Elin Movert Identification of a possible receptor on macrophages for the surface Mprotein, an important virulence factor of Streptococcus pyogenes Kroppen har många sätt att skydda sig mot sjukdomsframkallande mikroorganismer, s.k. patogener. Vårt immunförsvar är uppdelat i ett medfött (ospecifikt) och ett adaptivt (specifikt) försvar. Till det medfödda immunförsvaret hör yttre försvarsbarriärer som hud eller enzymer i saliv som kan bryta ner bakterier, men också vita blodkroppar som känner igen konserverade strukturer hos mikroorganismer och initierar ett ospecifikt svar för att bekämpa infektioner i kroppen. En av de viktigaste vita blodkropparna i det medfödda immunförsvaret är makrofager. Makrofager bekämpar patogener genom att fagocytera, “äta upp”, mikroorganismerna. Makrofager har receptorer på sin yta som kallas ”pattern recognition receptors” (PRRs), de känner igen konserverade strukturer på patogener och binder till dessa s.k. ligander för att kunna fagocytera mikroorganismerna. En PRR som är viktig för fagocytos och som kommer att studeras i detta examensarbete är ”scavenger receptor A” (SR-A). Fastän det är väl känt att PRRs spelar en viktig roll i det medfödda immunförsvaret, har man lite kunskap om de mekanismer patogener använder för att undvika eller manipulera dessa receptorer. Streptococcus pyogenes är en viktig bakteriell patogen som ger upphov till bl.a. halsfluss och svinkoppor hos människor. Alla S. pyogenes-stammar uttrycker det s.k. M-proteinet på sin yta. M-proteinet är en viktig virulensfaktor som hindrar fagocytos av S. pyogenes i blod. Mproteiner kan delas in i över hundra olika typer pga. den stora variationen i änden av proteinet. I nya experiment har det visat sig att en viss typ av M-protein, det s.k. M5 proteinet, hjälper S. pyogenes att undvika direkt fagocytos via SR-A på makrofagerna. Exakt hur M5 proteinet förhindrar denna fagocytos är okänt, men en möjlig förklaring är att M5 proteinet binder till en receptor distinkt från SR-A på ytan av makrofagerna och på så sätt utkonkurrerar bindningen av SR-A till dess ligand(er) på ytan av S. pyogenes. För att försöka identifiera en möjlig receptor på makrofager som M-proteinet binder till för att förhindra SR-A-medlad fagocytos använde jag mig av olika metoder. Absorptionsförsök gjordes med proteiner från makrofager och hela S. pyogenes bakterier. Framrenat M5 protein kopplades också upp på en s.k. HiTrap™ pelare och makrofagproteiner kördes genom pelaren. Om något protein interagerade med M5 proteinet i pelaren skickades det in för sekvensering. Proteiner från makrofager fördes också över till membran och inkuberades tillsammans med rent M5 protein för att analysera om M5 binder till något av dessa makrofagproteiner. Experimenten resulterade inte i en upptäckt av ett protein som interagerade med M5 proteinet. De förhållanden under vilka experimenten utfördes var kanske inte optimala. Det är också möjligt att den ytstruktur på makrofager som binder till M5 inte är ett protein. Kunskap om hur S. pyogenes orsakar infektion i människan och hur den undviker kroppens tidigaste försvarsmekanismer är viktigt för att i framtiden kunna skapa läkemedel mot denna patogen. Handledare: Thomas Areschoug Examensarbete, 30 hp i immunologi, hösten 2007 Sektionen för medicinsk mikrobiologi Lunds universitet Elin Movert Identification of a possible receptor on macrophages for the surface Mprotein, an important virulence factor of Streptococcus pyogenes The human immune system can be divided into an innate part and an adaptive part. One way of the innate immune system to identify pathogens is through pattern recognition receptors (PRRs) on antigen presenting cells (APCs), such as macrophages and dendritic cells. One important class of PRRs on APCs is the scavenger receptors (SRs). Scavenger receptor A (SR-A), which is expressed on most macrophage populations, has been shown to play an important part in host defence by mediating direct phagocytosis of several pathogens. Although we have gained much knowledge of the importance of different PRRs in the innate immune defence, less is known about the mechanisms by which pathogens evade or manipulate these receptors. In this degree project, I have analyzed how a Gram-positive bacterium called Streptococcus pyogenes evades SR-A mediated phagocytosis by macrophages utilizing the surface Mprotein. S. pyogenes can cause a variety of infections in humans, for example acute pharyngitis (strep throat) and impetigo. Although rare, the bacterium can also give rise to a variety of fatal conditions like necrotizing fasciitis, toxic shock syndrome (TSS) and septic shock. The M-protein of S. pyogenes is an important virulence factor with antiphagocytic properties, allowing the bacteria to grow in whole human blood. The M-protein has a hypervariable N-terminal region and on the basis of this variability, over 120 different Mtypes have been identified. A recent study by Areschoug et al. (2007) shows that the M5 protein of S. pyogenes prevents SR-A mediated recognition and direct non-opsonic phagocytosis by macrophages. A possible explanation for this prevention is that the M5 protein interacts with a receptor on the surface of macrophages and out-competes the binding of SR-A to S. pyogenes. The aim of this degree project was to try to identify a possible receptor for the M5 protein on macrophages. Three different approaches to identify a putative receptor were used. In an absorption experiment, surface proteins on bone marrow derived macrophages (BMMØ) were labelled by biotinylation. An S. pyogenes wild type strain of type M5 and an isogenic mutant lacking the M5 protein (∆M5) were used in absorption experiments with lysates of labelled macrophages. Macrophage surface proteins that associated with the bacteria were eluted and compared between the different strains using streptavidin for detection. For the two other approaches, recombinant M5 protein was purified. Purified M5 protein was coupled to a HiTrap™ column and biotinylated macrophage surface proteins were run through the column. Eluted proteins of interest were sent for identification by mass spectrometry. Finally, purified M5 protein was used as a probe in an overlay western blot analysis with macrophage lysates. The experiments did not result in the discovery of a macrophage receptor that interacts with the M5 protein. The conditions under which the experiments were done may not have been optimal. Alternatively, the M5 binding structure on macrophages may not be a protein. Even though the bacterial course of action could not fully be determined, a novel mechanism for PRR evasion has been demonstrated in this degree project. It has been shown that the M5 protein of S. pyogenes prevents scavenger receptor A mediated non-opsonic phagocytosis by macrophages.