GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
Antisekretorisk faktor och intratumoralt och intrakraniellt vävnadstryck
Huvudsökande
Tor Ekman, verksamhetschef, docent
Verksamheten onkologi
Sahlgrenska Universitetssjukhuset
Medsökande
Ragnar Hultborn, professor, avdelningschef
Avdelningen för onkologi, Sahlgrenska Akademin
Göteborgs Universitet
Stefan Lange, professor
Klin bakteriologi & virologi, infektionssjukdomar
Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet
Eva Jennische, docent
Avdelningen för medicinsk kemi och cellbiologi
Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet
Hans-Arne Hansson, professor emeritus
Avdelningen för medicinsk kemi och cellbiologi
Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet
Katja Werlenius, ST-läkare
Verksamheten Onkologi
Sahlgrenska Universitetssjukhuset
Bakgrund
Strålbehandling och/eller medicinsk tumörbehandling (onkologisk terapi) eliminerar (kurativ
intention) eller reducerar (palliativ intention) tumörcellsmassa i syfte att förlänga överlevnad
och/eller reducera tumörrelaterade symtom. Ofullständig effekt kan framför allt förklaras av
cellulära resistensmekanismer, bristfällig intratumoral (extra- eller intracellulär) koncentration
av aktiv drog och/eller intratumoral hypoxi vid strålbehandling.
För att övervinna dessa resistensmekanismer har utvecklingen gått mot allt intensivare
kemoterapi. Under 1980 - och 1990 - talet förbättrades behandlingstekniker för den
understödjande vården (cytokiner syntetiserades som stimulerade regeneration av röda och
vita blodkroppar, diagnostik och behandling av infektioner förbättrades, tekniken kring
autolog och allogen stamcellstransplantation utvecklades). Denna utveckling möjliggjorde en
intensifiering av den onkologiska terapin. Kliniska studier baserade på denna hypotes har
emellertid inte kunnat bekräfta att högre doser ger tydligt förbättrade resultat. Till exempel
leder autolog benmärgstransplantation vid kemosensitivt återfall av storcelliga B cellslymfom
bara till en definitiv kuration i ca 30 % av fallen (1). Vid solida tumörer har samma strategi
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
prövats men efter flera randomiserade studier ej uppfyllt förväntningarna.
Sammanfattningsvis fortsätter cellgiftsbehandling att svara för en begränsad del av den
kurativa cancerterapin till skillnad från de lokalt verkande terapierna strålbehandling och, i
ännu högre utsträckning, kirurgi.
För att förbättra den medicinska terapin av cancersjukdomar har läkemedel med nya
verkningsmekanismer, såsom hämning av överuttryckta signalvägar utvecklats. Humaniserade
antikroppar (som trastuzumab eller rituximab) inducerar bl.a. tumörcellsapoptos och det sker
nu en dramatisk ökning av denna målstyrda terapi.
En självklar förutsättning för effekt är att den aktiva substansen når tumörcellen. Vid
registrering av nya läkemedel redovisas farmakokinetiska studier där distributionsvolym,
halveringstid i plasma och clearance beskrivs. Dessa data är viktiga för att bedöma exposition
och därmed toxicitet men beskriver inte drogens penetrans in i och distribution inom tumören
(2). Denna penetrans kan antas definieras av faktorer såsom tumörens vaskularisering, flödet i
dessa tumörkärl samt olika substansers förmåga att diffundera ut i interstitiet till de enskilda
tumörcellerna. Interstitiet utgör normalt 1/6 av kroppsvolymen och medierar utbytet av
syrgas, näringsämnen och slaggprodukter mellan mikrocirkulationen och celler. Detta utbyte
påverkas av hydrostatiskt och kolloidosmotiskt intravaskulärt tryck samt det interstitiella
vävnadsstrycket (IFP), i sin tur beroende av kapillär permeabilitet, lymfatiskt dränage,
extracellulär bindväv och cellproliferation. I normalvävnad leder denna balans till ett lätt
undertryck, exempelvis i hud, som innebär kapillär uttransport. I tumörvävnad är förhållanden
annorlunda och det är visat att här föreligger ett ökat interstitiellt vävnadstryck (mellan 15 och
60 mm Hg) vilket hämmar uttransport av t.ex. cytotoxiska substanser (3, 4, 5). Orsakerna till
det ökade interstitiella vävnadstrycket i tumörvävnad är ej helt klargjorda men bl.a. har
dysfunktionella kärl med ökad permeabilitet samt avsaknad av lymfkärl föreslagits som
bidragande orsaker (4, 6, 7). Förändrad funktion av akvaporiner och jonpumpar i
cellmembraner kan av central betydelse för utvecklingen av ett förhöjt IFP (2,4).
En rad substanser kan sänka intratumoralt tryck, såsom VEGF antagonister. Genom att
minska tumörkärlspermeabilitet kan antiangiogenesantikroppar som bevacizumab minska
intratumoralt tryck (ITP) och öka upptaget av den cytotoxiska substansen CPT-11 (8) Detta
kan vara en förklaring till att man ser en ökad terapeutisk effekt när angiogeneshämmare
kombineras med konventionella cytostatika. Andra substanser såsom PDGF hämmare (9) och
TNF alfa ger också sänkt ITP och ökat upptag av cytotoxisk substans (10). Kombinationen
med melfalan och TNF alfa är etablerad som regional behandling av tumörer begränsade till
en extremitet men toxicitet av TNF alfa givet systemiskt förhindrar generell behandling (11).
Det finns således prekliniska och kliniska studier kring värdet av att sänka det intratumorala
trycket i syfte att öka intratumoralt upptag av cytotoxiska substanser. Vidare, om ökat
intratumoralt tryck leder till hypoxi minskar detta effekten av strålbehandling (12) och en
minskning av intratumoralt tryck skulle således kunna förbättra behandlingsresultaten även
här (13, 14, 15). Vid strålbehandling av tumörer i hjärnan kompliceras åtgärden dels av ett
redan pirmärt högt vävnadstryck och hypoxi i tumören, dels av att strålningen åstadkommer
en störning i blod-hjärnbarriären med sekundärt ökat tryck vilket accentuerar symptom och
kan ytterligare försämra behandlingseffekt.
Intevention i ovanstående fysiologi avses göras med ett av Lange och medarbetare framtaget
äggviteämne, antisekretorisk faktor (AF). Antisecretory Factor (AF) är ett 41 kD protein som
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
har karakteriserats i detalj på DNA, RNA och proteinnivå. AF bildas och lagras i de flesta
vävnader. Det förekommer fritt i celler och därtill som en obligat subenhet, S5a, i
proteasomerna, cellernas proteinnedbrytande struktur. AF skyddar mot intestinal
inflammation och hypersekretion. I olika patientgrupper har visats en tydlig korrelation
mellan AF i serum och terapieffekt vid inflammatorisk tarmsjukdom, Mb Meniere och mastit
(16, 17).
Vi har utvecklat en modell för Herpes simplex virus (HSV-1) inducerad encephalit och
studerat AF:s effekt. Obehandlat leder tillståndet snabbt till ökat intrakraniellt tryck och död.
Intrakraniellt tryck har mätts med en utrustning utvecklad i samarbete med Chalmers och
Samba Sensor AB, V Frölunda (18). Sensorn, cirka 0,4 mm, införs med en tunn nål. I
upprepade försök sänker AF intrakraniellt tryck och frekvensen överlevande går från 10-20 %
till 80-100 %. Dessa ytterst anmärkningsvärda resultat sammanställs nu för publicering.
I fortsatta pilotförsök har vi funnit att AF 16 förmår reducera det kraftigt förhöjda IFP i
inokulerade tumörer (adenokarcinom) på råtta till i stort sett samma nivå som vi har i
omgivande normal subkutan bindväv.
Fortsatt planering
a)
b)
Förutsatt att fortsatta försök kan styrka att AF 16 förmår att
reproducerbart reducera intratumoralt IFP kommer i nästa steg
effektivitet av strålbehandling kan förbättras med AF 16. Denna
effekt skall undersökas på inokulerade tumörer och på en
djurmodell som spontant utvecklar tumörer (se nedan). En
eventuell effekt av AF måste jämföras med andra substanser som
sänker intratumoralt tryck, t.ex. steroider.
Undersöka om AF 16 ger förbättrad behandlingseffekt/förbättrad
symptomkontroll hos patienter med hjärnmetastaser. Som en del i
projektet kommer ett regionalt vårdprogram implementeras som
ökar tillgängligheten till palliativ hjärnbestrålning (f.n. ca 100
patienter/år). I nuläget ger steroider och strålbehandling
symptomförbättring enbart hos 1/5 av patienterna (18) och en
förbättring för patienter med hjärnmetastaser och svåra symptom
som huvudvärk, neurologiska bortfall, illamående och kräkningar
ter
sig
synnerligen
önskvärd.
En
sänkning
av
intrakraniellt/intratumoralt tryck med förbättrad oxygenering kan
antas förbättra behandlingsresultat (19).
Djurmodell:
Råttor med transplanterade brösttumörer (adenocarcinom, Mat B-II, 1 x 106celler , injicerade
subkutant (20) samt Sprague-Dawley-råttor med DMBA-inducerade brösttumörer (21)
kommer att tryckmätas då tumörerna är 1 – 2 cm stora. En sensor registrerar intratumoralt
tryck och en omgivande vävnadstryck. Tryckregistreringar sker under flera timmar och kan
upprepas flera dagar i rad. AF 16 tillförs systemiskt eller lokalt och för att studera dos
response samband, optimalt administrationssätt och effektduration.
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
Om vävnadstryckssänkning verifieras studeras på dessa tumörmodeller:
Kapillär permeabilitet med intravasal injektion av Evans Blue och dess extravasation.
Kärlvolym/perfusion med den fluorescerande makromolekylen FITC-dextran injicerat
intravasalt. Kärlpermeabilitet med Evans Blue albumin.
Blodflödesmätning med Dopplerteknik alternativt med radioaktiva mikrosfärer.
Syrgastension med Eppendorff-teknik.
Koncentration och distribution av cytostatika i tumörvävnaden.
Histopatologiska och immunhistokemiska studier med avseende på struktur av
tumörceller, blodkärl och stroma. Ett viktigt inslag blir fördelning av akvaporiner och
jonkanalsystem.
Cellnybildning och cellmigration genom monoklonala antikroppar mot ribonucleotide
reductase, ett nyckelenzym i DNA syntesen (22) för att undersöka omsättning av celler
och deras fördelning och ev. omfördelning vid behandling med AF-16. Det är rimligt
att förvänta sig att AF-16 medför att kapsel-vävnaden kring tumören genomgår
mycket påtagkig ombyggnad i samband med sänkning av trycket i tumören med AF16.
Behandlingseffekt av strålbehandling AF på de två tumörmodellerna.
Råttor utan tumör kommer att strålas mot hjärnan i doserna 10 – 20 Gy vid ett tillfälle. Det
intrakraniella trycket studeras 1 – 5 dygn efter bestrålningen. Optimal dos och tidpunkt
fastställes och intervention med AF-16 görs. Den inducerade encefaliten karakteriseras vad
avser inflammatorisk reaktion, degenerativa och reaktiva förändringar och tryckstegring av
avser IFP. Dessa experiment utgör ett komplement till planerade kliniska studier (se nedan).
Klinisk modell
Inför de kliniska studierna ska AF-16 diskuteras med Läkemedelsverket för eventuell
registrering eller licentiering.
Patienter med hjärnmetastaser kommer att randomiseras till AF-16 eller placebo med
radiologisk utvärdering av respons och subjektiv värdering av huvudvärk och illamående, det
senare relaterat till uppkommet hjärnödem. Med funktionell MR och/eller hjärnscintigrafi ska
strålbehandlingens påverkan på blod-hjärnbarriären och eventuella effekter av AF-16
studeras.
Om de djurexperimentella studierna visar positivt utfall planeras kliniska studier med
vävnadstrycksmätning på åtkomliga tumörer, exempelvis stora brösttumörer, där ett högt
vävnadstryck föreligger (23). Effekten av strålbehandling med kurativ intention på t.ex.
head/neck tumörer, cervixtumörer kan studeras.
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
Kompetens och utrustning
Utveckling och karakterisering av det antisekretoriska proteinet AF-16 har som ett
pionjärarbete utförts av prof Stefan Lange och medarbetare under de gångna 20 åren. Försök
har gjorts djurexperimentellt och på människa i olika situationer.
Patofysiologin kring vävnadstryck liksom tumörmodeller är väletablerade i gruppen sedan 20
år.
Vävnadstrycksmätning görs med en beprövad och i gruppen tillgänglig utrustning.
Eppendorff-utrustning för syretrycksmätning finns tillgänglig.
Djuren stallas och försöken genomförs på djurstallet Mikrobiologen, Guldhedsgatan.
Betydelse och etik
Studierna berör frågor hur man eventuellt kan öka den tumörterapeutiska effekten vid såväl
strålbehandling som medicinsk tumörbehandling liksom att minska hjärnvävnadens ödem och
därmed öka den terapeutiska bredden.
Det antisekretoriska proteinet AF-16 har hittills i andra sammanhang inte visat någon
toxicitet.
Sedvanliga etikansökningar för djurexperimentella studier liksom framgent för humanförsök
kommer att insändas.
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
Referenser
1. Philip T, Guglielmi C, Hagenbeek A, et al. Autologous bone marrow transplantation
as compared with salvage chemotherapy in relapses of chemotherapy-sensitive nonHodgkin's lymphoma. N Engl J Med. 1995; 23:1540-5.
2. Minchinton A, Tannock I. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews 2006; 6:
583-592.
3. Tain RK Barriers to drug delivery in solid tumours. Sci Amer 1994;271:59-65.
4. Wiig H, Tveit E, Hultborn R, Reed RK, Weiss L. Interstitial fluid pressure in DMBAinduced rat mammary tumours. Scan J Clin Lab Invest 1982;42:159-64.
5. Heldin CH, Rubin K, Pietras K et al High interstitial fluid pressure – an obstacle in
cancer therapy Nature Reviews/cancer 2004;4:806-813.
6. Leu AJ, Berk DA, Lymboussaki A et al Absence of functional lymphatics within a
murine sarcoma: a molecular and functional evaluation. Cancer Res 2000:60:43244327,.
7. Jain RK, Munn LL, Fukumara D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital
microscopy Nature Rev Cancer 2002;2:266-276.
8. Wildiers H et al. Effect of antivascular endothelial growth factor treatment on the
intratumoral uptake of CPT-11. Br J Cancer 2003;88:1979-1986,.
9. Pietras K et al Inhibition of PDGF receptor signaling in tumor stroma enhances
antitumor effect of chemotherapy Cancer Res 2002;62:5476-5484.
10. Kristensen CA, Nozue M, Boucher Y et al. Reduction of interstitial fluid pressure after
TNF-alpha treatment of three human melanoma xenografts. Br J Cancer. 1996;4:5336.
11. Lienard D, Ewalenko P, Delmotte JJ High dose recombinant factor tumor necrosis
factor alpha in combination with interferon gamma and melphalan in isolation
perfusion of the limbs for melanoma and sarcoma. J Clin Oncol 1992;10:52-60,.
12. Nordsmark M, Overgaard M Overgaard J Pretreatment oxygenation predicts radiation
response in advanced squamous cell carcinoma of the head and neck Radiotherapy and
Oncology 1996;41:31-39.
13. Hultborn K A, Forssberg A. Irradiation of skin tumours during pure oxygen
inhalation. Acta Radiologica 1954;42:475-484.
14. Thomlinson RH, Gray LH The histological structure of some human lung cancers and
the possible implications for radiotherapy Br J Cancer 1955;9:539-549.
15. Harris AL. Hypoxia – a key regular factor in tumour growth. Nature Rev Cancer
2002;2:38-47.
16. Lönnroth I, Lange S. Purification and characterisation of the antisecretory factor: a
protein in the central nervous system and in the gut which inhibits intestinal
hypersecretion induced by cholera toxin. Biochim Biophys Acta 1986;883:138-144.
17. E Johansson, I Lönnroth, S Lange, I Jonson, E Jennische & C Lönnroth, Molecular
cloning and expression of a pituitary gland protein modulating intestinal fluid
secretion. J. Biol. Chem. 1995;270:20615 - 20620.
18. Bezjak A, Adam J, Barton R et al. Symptom response after palliative radiotherapy for
patients with brain metastases. Eur J Cancer 38; 487-496:2002
19. Suh JH, Baldassarre S, Abdenour N et al. Phase III study of efaproxiral as an adjunct
to whole-brain radiation therapy for brain metastases. J Clin Oncol 24 (1); 106-114,
2006.
20. Karlsson-Parra A. Personal communication.
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
21. Welsch CW. Host factors affecting the growth of carcinogen-induced rat mammary
carcinomas: a review and tribute to Charles Brenton Huggins. Cancer Res
1985;45:3415-43.
22. H. Zhu, Z Y Wang & H.-A. Hansson, Visualization of proliferating cells in the adult
mammalian brain with the aid of ribonucleotide reductase, Brain Research 977 , 2003,
180-189)
23. Less JR, Posner MC, Boucher Y, Borochovitz D, Wolmark N, Jain RK. Insterstitial
hypertension in human breast and colorectal tumors. Cancer Res 1992;52:6371-74.
GÖTEBORGS UNIVERSITET
Avdelningen för onkologi
FORSKNINGSPROGRAM
2017-07-15
Budget
Läkarlön för bearbetning:
ST-läkare, 3 mån
Specialistläkare, 1 vecka
Råttor, 400 á kr. 150
Stallningskostnader
Kemikalier och antikroppar för histologi
Analyskostnader, sensorer etc
Förbrukningsartiklar
45 500,- SEK
24 000,- ”
60 000,- ”
60 000,- ”
45 000,- ”
70 000,- ”
85 000,- ”
Summa
389500 :- SEK
