IFM/Kemi
Linköpings Universitet
September 2004/LGM
Projektlaboration i genteknik
Tillämpning av olika molekylärbiologiska
”verktyg” för kloning av en gen
Innehållsförteckning
Inledning ................................................................................................................... 3
Amplifiering av gen med PCR................................................................................... 4
Restriktionsklyvning ................................................................................................. 5
Rening av DNA......................................................................................................... 6
Agarosgelelektrofores................................................................................................ 7
Ligering av vektor och PCR fragment ....................................................................... 8
Transformering av vektor efter ligering ..................................................................... 9
Analys av transformanter......................................................................................... 10
Appendix................................................................................................................. 11
2
Inledning
Denna laboration, som omfattar 2 stycken heldagar, syftar till att ge laborativ
erfarenhet av några olika moment som används vid kloning såsom t.ex.
restriktionsklyvning och ligering. För varje laborationsmoment finns ett
”standardprotokoll” med olika frågeställningar /funderingar som gås igenom innan ni
sätter igång labmomentet.
Laborationsmässigt kommer ni att arbeta i något större laborationsgrupper (4-5 st i
varje grupp) där ni inom gruppen fördelar arbetet som anges för de olika momenten
enligt flödesschemat (Figur 1). Varje grupp för noggranna anteckningar för de olika
laborationsmomenten.
Redovisning sker i form av en muntlig utvärdering av de erhållna resultaten
tillsammans med labassistenten.
Dag1
Amplifiering av
gen med PCR
Analys av vektor och PCR
produkt på agarosgel
Rening av PCR produkt
Restriktionsklyvning
av vektor
Rening av vektor efter restriktionsklyvning
Restriktionsklyvning av PCR produkt
Rening efter restriktionsklyvning
Ligering av vektor och PCR produkt
Transformering av ligeringsblandning
(görs av lab-assistent)
Dag2
”Screening”av kolonier med PCR
Analys av transformanter på agarosgel
Figur 1: Flödesschema över de olika momenten i projektlaborationen
3
Amplifiering av gen med PCR
Frågeställningar/funderingar:
•
•
•
•
•
Utgående från primersekvensen, ge förslag på lämplig PCR cykel
Vad händer om annealingtemperaturen är för hög? Respektive för låg?
Uppskatta det molära förhållandet mellan vektor DNA och primer, hur stort
är överskottet?
Hur beräknas smältpunkten för primers?
Vad bör man tänka på vid designen av primers?
Utförande:
DNA:
1 µl
Primer_forward:
1 µl
Primer_reverse:
1 µl
10X dNTP-mix:
2 µl
10X Reaktionsbuffert:
2 µl
H2O:
12 µl
Taq polymeras:
1 µl
Totalvolym:
20 µl
Tag ut 5 µl för analys på agarosgel efter reaktionen, resten används för
restriktionsklyvning.
Lästips:
T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4th edition, sid. 179-193
Promegas, Protocols and application guide sid. 193-206
4
Restriktionsklyvning
Frågeställningar/funderingar:
•
•
•
•
•
•
Vad innebär 1 Unit?
Vid vilken temperatur och hur länge ska reaktionen ske?
Hur sker inaktivering av enzymerna?
Vad händer om man INTE inaktiverar enzymerna?
Vad bör man tänka på i val av reaktionsbuffert då man har två olika
restriktionsenzymer i blandningen?
Vilka kontroller bör ingå för att veta att bägge enzymerna har fungerat?
Restriktionsklyvning av vektor/fragment:
DNA: (1µg)
X µl
Restriktionsenzym NcoI:
1 µl
Restriktionsenzym HindIII:
1 µl
10X Reaktionsbuffert:
2 µl
H2O:
Y µl
Totalvolym:
20 µl
Tag ut 5 µl för analys på agarosgel, resterande volym renas med lämpligt reningskit.
Lästips:
T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4th edition, sid. 60-74
Promegas, Protocols and application guide sid. 2-24
5
Rening av DNA
Vid all manipulering av DNA såsom PCR amplifiering eller restriktionsklyvning
behöver DNA:t renas efter reaktionen.
Reningen tjänar flera syften, man blir av med överskott av t.ex. primer och
restriktionsenzymer, reaktionsbufferten byts ut mot H2O och man får även en
koncentrering av sitt prov. I denna projektlaboration kommer vi att använda oss av två
olika kommersiella kit för att rena DNA. Både kit:en bygger på att DNA:t binds till en
fast matris och sedan elueras ut i liten volym sterilt H2O.Anledningen till att man
använder två kit är deras olika bindningsförmåga. Det kit som används för PCR
produkten (QIAgen minelute PCR purification kit) binder DNA fragment i storleken
70-4000 bp medan det kit som används för rening av vektorn (QBiogene ”Geneclean
II”) endast binder DNA fragment i storleken 200-20000 bp
Rening av PCR produkt efter amplifiering och efter klyvning (QIAgen minelute
PCR purification kit)
Utförande:
1) Tillsätt 5 volymer av PB-buffert till reaktionsblandningen.
2) Centrifugera 1 min i ”minelute kolonnen” för att binda in DNA.
3) Kasta lösningen och tillsätt 750 µl tvättlösning, centrifugera 1 min och kasta
lösningen.
4) Centrifugera kolonnen torr för få bort ev. överflödig tvättlösning.
5) Tillsätt 10 µl H2O och låt stå 1 min. Överför ”minelute kolonnen” till ett nytt
epp.rör och centrifugera 1 min.
6) Provet finns nu i epp.röret och är klart att användas för ligering.
Rening av vektor efter klyning (QBiogene”Geneclean II”)
Utförande:
1)
2)
3)
4)
Tillsätt 3 volymer NaI.
Tillsätt 5 µl väl resuspenderad ”glassmilk”.
Centrifugera 5 sek.
Tillsätt 3 x 700 µl New wash tvätttlösning. Centrifugera 5-10 sek mellan
tvättarna och kasta supernatanten.
5) Låt pelleten torka i 5-10 min efter sista tvätten.
6) Tillsätt 10 µl H2O och centrifugera 30 sek.
7) Överför supernatanten till ett nytt epp.rör och provet är nu klart att användas
för ligering.
Lästips:
T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4th edition, sid. 36-43
Promegas, Protocols and application guide sid. 75-77
6
Agarosgelelektrofores
Frågeställningar/funderingar:
•
•
•
•
Vilka kontroller bör vara med vid elektroforesen
Vad händer om du har för låg respektive för hög spänning vid elektroforesen?
Vad bör du tänka på vid preparativt agarosgelarbete?
Vilken koncentration på agarosgelen ska du använda?
Gjutning av agarosgel
Utförande:
1) I en 250 ml flaska tillsätts 0.5-2.0 g agaros och 10ml 10x TBE buffert och spädes
med vatten till totalvolymen 100ml.
2) Värm agarosgelen tills den är helt flytande, i ett vattenbad eller i mikrovågsugn.
Låt blandningen svalna en stund (till ca 60oC) och gjut agarosgelen. Låt gelen svalna i
minst 30 minuter.
Elektroforetisk separation av DNA
1) Blanda 4 µl laddningsbuffert med 5µl DNA och 11µl H2O.
2) Blanda också 1µl molekylviktsstandard med 4 µl laddningsbuffert och 15µl vatten.
3) Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1x TBE buffert , så att
det täcker gelen.
4) Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett (de
ska sjunka ned i botten på brunnen).
5) Separera DNA fragmenten genom att lägga på en spänning ~100 Volt. Kom i håg
att DNA är negativt laddat.
6) När den blåa markören har nått ca 2/3 ner på gelen avbryts elektroforesen och
DNA fragmenten infärgas med etidiumbromid. Etidiumbromid som interkalerat med
DNA kan ses genom att gelen belyses med 300-360 nm ljus på en transluminator.
Skydda ögonen genom att använda skyddsglasögon och använd handskar vid
arbete med Etidiumbromid.
7) Fotografera av gelen och uppskatta mängden DNA ni har erhållit.
Lästips:
T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4th edition, sid. 68-74
7
Ligering av vektor och PCR fragment
Frågeställningar/funderingar:
•
•
•
•
•
•
Vilket molärt förhållande mellan vektor och fragment ska det vara vid
reaktionen?
Hur vet man mängden DNA?
Hur lång ligeringstid och vid vilken temperatur?
Vad bör man tänka på vid ligering av” blunt-ends” istället för ”sticky-ends”?
Vilka kontroller bör vara med ligeringsreaktionen?
Vad innebär 1 Unit?
Utförande:
1) Tag ~50ng vektor och 3-faldigt molärt överskott av PCR produkt. Justera volymen
till 10 µl med H2O.
2) Tillsätt 10 µl 2 X quick Ligation buffer och blanda.
3) Tillsätt 1 µl Quick T4 DNA ligas och blanda noggrant, centrifugera blandningen
några sekunder.
4) Inkubera i rumstemperatur 5-15 min.
5) Ställ blandningen på is.
6) Transformera ligeringsblandningen eller frys ned -20°C för transformering senare.
Lästips:
T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4th edition, sid. 74-84
Promegas, Protocols and application guide sid. 41-47
8
Transformering av vektor efter ligering
Frågeställningar/funderingar:
•
Vilka kontroller bör vara med ligeringsreaktionen?
Utförande:
1) Tina de superkompetenta XL1-blue cellerna portionerade i 50µl:s portioner.
2) Till varje 50µl:s portion av superkompetenta celler tillsätts 1-5µl av prov, kontroll
eller transformationskontroll.
3) Blanda försiktigt med pipettspetsen och inkubera på is 30 minuter.
4) ”Värmechocka” cellerna genom att placera rören i värmeblock 45 sekunder vid
42°C, placera sedan rören på is i 2 minuter.
5) Tillsätt 200µl av förvärmt (42°C.) NZY+Broth odlingsmedium och inkubera
transformationsreaktionen 1 timme i 37°C.
6) Tag 100-200 µl av den inkuberade blandningen och sprid på agarplatta.
7) Dagen efter transformation (ca 16 timmar) kontrolleras transformationsgraden.
Räkna antalet kolonier på de olika agarplattorna.
Lästips:
T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4th edition, sid. 85-91
Promegas, Protocols and application guide sid. 45-46, 51, 174
9
Analys av transformanter
För att säkert kunna hitta transformanter med klonad gen finns ett antal olika metoder.
Den allra bästa är att göra plasmidpreparation på ett antal kolonier och sedan
bestämma DNA sekvensen på de olika klonerna. Då denna metod är något omständlig
ska vi prova att göra ” koloni screening” med PCR. Denna metod bygger på att ett
antal kolonier från agarplattan (1 koloni i varje rör) förs över till ett rör och DNA
innehållet amplifieras med PCR. Då vi använder samma primers som vi använde för
att isolera genen kommer vi att kunna identifiera de kolonier som har genen insatt i
vektorn.
Utförande:
1) Blanda följande lösningar i PCR rör (1 rör för varje koloni, märk rören noggrant)
Primer_forward:
1 µl
Primer_reverse:
1 µl
10X dNTP-mix:
2 µl
10X Reaktionsbuffert:
2 µl
H2O:
12 µl
Totalvolym:
~20 µl
2) Plocka en koloni med tandpetare och ympa ned i PCR röret.
3) Värm PCR röret 95° C i 5 min.
4) Tillsätt 1 µl Taq polymeras, blanda med kort centrifugering.
5) Amplifiera DNA:t med samma PCR cykel som ni använde för att isolera genen.
6) Efter avslutad PCR tillsätts 4 µl laddningsbuffert och proverna analyseras på
agarosgel.
10
Appendix
Primer_forward:
5’-CGC GCG CGC GCC ATG GGA GTC TTT AGC AAG TGT GAG-3’
Primer_reverse:
5’- GCCGGC CGG AAG CTT TCA TCA CAG GTT GCA GCT CGC –3’
Figur 2: Primers för PCR amplifiering. Understruket indikerar restriktionssiten och
baser i kursiv stil den del av primer som binder till genen.
5´ATGGGAGTCTTTAGCAAGTGTGAGCTGGCCCACAAGCTGAAAGCCCAG
GAGATGGATGGATTCGGCGGATACAGCCTGGCCAACTGGGTGTGTATGGC
CGAGTACGAGAGTAACTTCAACACCCGAGCTTTCAACGGAAAAAACGCA
AACGGGAGCTCAGATTACGGCCTGTTCCAGCTGAACAACAAGTGGTGGTG
CAAGGATAACAAGCGAAGCTCCTCGAACGCCTGCAACATCATGTGCTCAA
AGCTGCTGGACGAGAACATAGACGATGACATCTCCTGCGCGAAGCGAGTC
GTCCGAGATCCAAAGGGCATGAGCGCGTGGAAGGCCTGGGTCAAGCACT
GCAAGGACAAGGACCTGAGCGAGTACCTGGCGAGCTGCAACCTGTGATG
AAA-3´
Figur 3: DNA sekvens av genen som ska amplifieras med PCR.
Länkar:
1. New England Biolabs hemsida om restriktionsenzymer:
http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp
2. QIAgen minelute PCR purification kit:
http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/DNACleanupAndConcentrati
on/MinElute/1027886_HB_QQ_MinElute_0604.pdf
3. Geneclean II Qbiogene:
http://www.qbiogene.com/literature/protocols/dna-kits/pdf/GC%20II.proto-703.pdf
4. New England Biolabs hemsida om quick ligation kit:
http://www.neb.com/nebecomm/products/productM2200.asp
11
