REDOVISNING
Slutredovisning
Skickas till: [email protected]
Ev. artiklar och publikationer skickas till:
Stiftelsen Forskning utan djurförsök,
Gamla Huddingevägen 437, 125 42 Älvsjö
1. Anslagstagare
Anna Krook
Arbetsplats (fullständig postadress)
E-postadress
Integrativ fysiologi
Fysiologi och farmakologi
Von Eulers väg 4a
Karolinska Institutet
171 77 Stockholm
[email protected]
2. Projektnummer
Sista redovisningsdatum (se kontraktet)
23/05
31/8-07
3. Projekttitel (svenska)
Reglering av insulinkänslighet i skelettmuskulatur: Studier på primära muskelcellodlingar från människa
4. Projektet
är avslutat x pågår utan fortsatt stöd från Stiftelsen Forskning utan djurförsök
5a. Kortfattad beskrivning av projektet (syfte och utförande) ca 1 A4-sida
Den centrala frågeställningen i detta forskningsprogram är att undersöka hur insulinkänsligheten i
muskel, och muskelns metabola egenskaper, regleras. Nedsatt känslighet för hormonet insulin är
vanligt i skelettmuskeln från personer med typ 2 diabetes (åldersdiabetes) och kan även påvisas hos
friska förstagradssläktingar till typ 2 diabetiker. För att studera hur insulinkänsligheten i muskel
regleras har vi etablerat muskelcellsodlingar från biopsier tagna från personer med eller utan typ 2
diabetes. Tillgången till odlad human muskel reducerar antalet pilotförsök som behöver utföras i
djurmuskel. Genom att använda oss av ny teknologi för att specifikt reducera uttryck av valda gener
har vi utökat användningsområdet för odlad muskel, vilket i sin tur bidrar till att behovet att generera
”knock out” modeller i mus för att studera muskelmetabolism minskar.
5b. Ange nyckelord (max 6 st)
Diabetes, muskel, insulin resistens, metabolism.
6. Kortfattad populärvetenskaplig beskrivning av de resultat som uppnåtts (bifoga gärna illustrationer, helst grafiska tekningar), ca ½ max 1 A4-sida
Typ 2 diabetes mellitus (åldersdiabetes) är en sjukdom som ökar allt mer, både i västvärlden och i
andra delar av världen som nu ser en snabb ökning i levnadsstandard och övergång till en mer
västerländsk livsstil, så som till exempelvis Indien och Kina. Dessutom ser man att typ2 diabetes
kryper allt längre ner i åldrarna. Två viktiga orsaker till detta anses vara att befolkningen blir
överviktigare och mindre fysiskt aktiv, vilka båda är riskfaktorer när det gäller utveckling av typ 2
diabetes . Sockermetabolismen i kroppen regleras av flera olika organ. Vid höga glukos (socker)
värden i blodet frisätts insulin från betaceller i pankreas, och detta aktiverar signaler som gör att
glukosupptaget ökar i fett och muskelvävnad, samtidigt som leverns glukosproduktion hämmas.
Effekten blir således att glukoshalten i blodet sjunker tillbaka till utgångsläget. Muskeln är det organ
som svarar för det största upptaget av socker som svar på insulinfrisättning. Hos personer med
åldersdiabetes är insulinets förmåga att stimulera glukosupptaget i muskel kraftigt försämrat, vilket
StiFUD0703
bidrar till förhöjda blodsockervärden. Vår forskning syftar till att förstå vad som reglerar muskelns
förmåga att svara på insulin, och hur detta är förändrat hos personer med typ 2 diabetes.
Tillgången på human muskel är begränsad, och baseras på frivilliga personers vilja att donera en
muskelbiopsi. Dessa biopiser är mycket värdefulla, och för att kunna öka tillgången på material har vi
med stöd av bland annat stiftelsen forskning utan djurförsök etablerat muskelcellsodlingar från
muskelbiopsier. Vi har visat hur man genom att applicera ny metodik kan utöka
användningsområdet för primära humanmuskelcellodlingar. Genom att använda siRNA, en ny metod
som belönades med noblepriset år 2006, har vi kunnat reducera det uttrycket av olika proteiner i
muskelcellsodligar. Detta är principiellt mycket viktigt eftersom det öppnar för möjligheten att
specifikt reducera uttryck av intressanta proteiner direkt i odlad differentierad human muskel.
Metoden är mer specifik än att använda farmakologiska hämmare och närmar sig det man uppnår med
muskel från ”knock out” möss. Detta arbete visar således på en mycket stor potential för utöka
användningsområdet och typen av frågeställningar som är möjliga att besvara med hjälp av odlad
human muskel.
7. Sammanfattning av resultatens betydelse för att ersätta/begränsa djurförsök (ge gärna konkreta exempel)
Rapport om projektets fösröksdjursbegränsing:
Följande relevanta arbeten har hittills publicerats sedan år 2005. Alla experiment har utförts i humana
muskelcellodlingar. Resultaten är publicerade i ansedda internationella tidskrifter, och behandlar
ämnen som i litteraturen domineras av resultat baserade på experiment som involverar djurförsök.
1.
DK Krämer, L Al-Khalili, S Perrini, J Skogsberg P Wretenberg, K Kannisto, H WallbergHenriksson, E Ehrenborg, JR Zierath A Krook (2005). Direct activation of glucose transport in
primary human myotubes following activation of PPARδ Diabetes. 54:1157-63.
Kommentar: Detta arbete visar hur aktivering av PPAR delta i primära humana muskelcellsodling
ökar glukosupptaget. Aktivering av PPAR delta är en ny angreppsvinkel för behandling av typ 2
diabetes. Arbetet visar på vilka intracellulära signaleringsvägas som aktiveras, och att human muskel
svarar på denna stimulering.Arbetet åtföljdes av en press-release från Karolinska institutet.
2.
L Al-Khalili, K Kannisto, M Forsgren, E Ehrenborg, JR Zierath , F Lönnqvist A Krook (2005).
Enhanced insulin-stimulated glycogen synthesis in response to insulin, rosiglitazone or metformin
is associated with increased mRNA expression of GLUT4 and PGC1. Diabetologia 48:1173-1179
Kommentar: Detta arbete karatäriserar effekten av ett antal olika diabetesfarmaka på primära
humana muskelceller, och visar hur förändringar i uttrycket av GLUT4 och PGC1 korrelerar med
insulin svaret i muskelcellerna.
3.
DK Krämer, K Bouzakri, O Holmqvist, L Al-Khalili, A Krook (2005). Effect of serum
replacement with Plysate on cell growth and metabolism in primary cultures of human skeletal
muscle. Cytotechnology48:89-95
Kommentar: I detta arbete har vi utvärderat användning av ett alternativ till fetalt kalvserum på
tillväxt, differentiering och insulinsvar i primära humana muskelceller, Plysate. Muskelceller växer i
media med Plysate, men differentieringsförmågan är nedsatt.
4.
K Bouzakri, A Zachrisson, L Al-Khalili, BB Zhang, HA Koistinen, A Krook, JR Zierath. (2006)
StiFUD0703
siRNA Based Gene Silencing Reveals Specialized Roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in
Glucose and Lipid Metabolism in Human Skeletal Muscle Cell Metabolism 4:89-96.
Kommentar: Detta arbete är publicerat i en högt rankad tidskrift, och åtföljdes av en press-release
från Karolinska institutet. Genom att systematiskt använda RNAi har vi visat att olika molekyler i
insulinets signaltransduktion har specifika funktioner. Detta har tidigare studerats i knock-out mössVi genomför här försöken i human vävnad. Dessutom skiljer sig möss och människor åt i ett för
artikeln relevant avseende- gnagare har en extra isoform av proteinet IRS som kan kompensera när
IRS1 eller IRS2 saknas.
5.
L Al-Khalili, K Bouzakri, S Glund, F Lönnqvist , HA Koistinen, A Krook (2006). Signalling
specificity of IL6 action on glucose and lipid metabolism in skeletal muscle. Mol Endo. 20:33643375
Kommentar: Här har vi studerat hur interleukin 6 påverkar den odlade muskelns differentiering,
metabolism och insulinsvar. Vi har applicerat RNAi för att förstå hur iterluekin 6 medierar effekter
på muskeln metabola profil
6.
H Parikh, E Carlsson, WA Chutkow, LE Johansson, H Storgaard, P Poulsen, R Saxena, C Ladd,
PC Schulze, MJ Mazzini, C Bjørn Jensen, A Krook, M Björnholm, H Törnqvist, JR Zierath, M
Ridderstråle, D Altshuler, RT. Lee, A Vaag,, LC Groop, VK Mootha (2007). Identification of
TXNIP as a marker and regulator of glucose homeostasis in humans. PLoS Medicine 4(5):e158
Kommentar: I denna artikel använde vi adenoviurs för att i odlad human muskel överuttrycka ett
protein som identifierats av Mootha och Groop som potentiellt intressant med avseende på glukos
metabolism.
7.
D Kitz Krämer, L Al-Khalili, B Guigas ,Y Leng, PM Garcia-Roves, A Krook (2007). Role of
AMP kinase and PPARδ in the regulation of lipid and glucose metabolism in human skeletal
muscle. J Biol Chem 282:19313-19320
Kommentar: Som uppföljning till arbetet redovisat som publikation 1 har vi även där applicerat
RNAi för att beskriva signalering som aktiveras via PPARdelta.
Sammanfattningsvis har vi använt primära muskelcellsodlingar för att studera insulin signalering i
muskel, med syfte att förstå hur både befintliga och nya antidiabetes farmaka fungerar i muskel.
Denna typ av experiment utförs annars rutinmässigt i djurmuskel. Vi har även försökt att reducera
användning av alternativ till fetalt kalvserum i muskelcellsodlingarna. Dessa angreppsvinklar syftar
till att utöka användningsområdet för primära muskelcellsodlingar genom att utveckla nya metoder
och applicera ny metodik.
8. Vilket är den största framgången hittills i projektet?
Den största framgången har varit applicering och användning av RNAi i odlad muskel från människa. Detta har fått stor
uppmärksamhet bland andra diabetesforskare och medfört ett flertal kontakter angående samarbeten.
9a. Beskrivning av vad som gjorts för att validera och sprida metoden/metoderna
Valideringen har gjorts kontinuerligt. Resultaten sprids genom presentationer vid vetenskapliga konferenser och via
publikationer.
9b. Vad mer skulle behöva göras för att metoden/metoderna ska bli spridda och praktiskt användbara?
StiFUD0703
Genomförbarheten är relativt hög. Det krävs dock realtivt specialiserad kompetens för att odla humana muskelceller på ett
bra sätt så att resultaten håller hög kvalite.
10. Förteckning över publikationer som projektet resulterat i
Se punkt 7
11a. Kortfattad vetenskaplig rapport (abstract) på engelska (projekttitel, syfte, utförande, och resultat), ca ½ A4-sida
The central aim of this project is to delineate signalling pathways regulating insulin sensitivity and
insulin action in human skeletal muscle. Skeletal muscle comprises over 50 % of total body mass and
in addition to locomotory and structural functions; it also plays a key role in whole body metabolism.
Skeletal muscle insulin resistance is a key characteristic of type 2 diabetes, and, when encountered in
an otherwise healthy individual, it is a predictor of type 2 diabetes. Derangements in glucose and lipid
handling in skeletal muscle negatively effect whole body metabolism. Thus, impairments in the
insulin signalling pathway contributes to an individuals risk for developing metabolic diseases
including type 2 diabetes and obesity. We have focused on determining the pathways regulating
insulin signalling and metabolism in the context of metabolic disease in humans. We have established
a primary human skeletal muscle culture system from satellite cells obtained from muscle biopsies
from insulin resistant and healthy subjects. Myoblast cultures can be induced to differentiate into
multinucleated myotubes and are thus a suitable cell culture model of skeletal muscle. The
availability of human skeletal muscle cultures enables a large portion of pilot experiments previously
carried out in animal muscle to be done in the cell culture system. From one muscle biopsy we are
able to culture the skeletal muscle for several passages, which means that the availability of human
tissue is greatly extended. We have also applied siRNA methodology to specifically silence gene
expression directly in cultured human muscle cells. Using this approach we have been able to unravel
specific roles for IRS1 and IRS2 as well for Akt 1 and Akt2 in mediating insulin responses on glucose
uptake and lipid metabolism. Results obtained using this system have a direct applicability to human
conditions, and mimick a “knock out” model otherwise created using transgenic animals. We have
also determined the effects of interleukin 6 (IL6) on human skeletal muscle. IL6 has been shown to
mediate insulin resistance in adipocytes. Il6 is also released by exercising muscle, and may thus
directly affect metabolism in the contracting muscle. We have evidence that IL6 increases lipid
oxidation and glycogen synthesis in primary human skeletal muscle cultures and we are currently
working to unravel the intracellular signalling pathways that mediate these effects.
11b. Bifoga eventuellt en vetenskaplig rapport på engelska, max 4 sidor (syfte, utförande, och resultat)
StiFUD0703
