Lösningsförslag TFKI09 och TFKE32 2010-12-18:
1. a) +1
b) Sur hydrolys, 6 M HCl, koka, 24 h – alla peptidbindningar bryts och fria
aminosyror kan separeras med exempelvis jonbyteskromatografi.
c) i) Pro = α-helixbrytare, Thr och Val grenade på β-kol intill varandra (steriskt
hinder) – bildar inte helix
ii) Skulle kunna bilda helix, var tredje/fjärde aminosyra polär så troligen på ytan av
proteinet.
iii) Flera positivt laddade sidokedjor intill varandra – bildar inte helix.
2. a) Urea, (kvartär-), tertiär- och sekundärstruktur förstörs endast primärstruktur intakt.
b) Vid pH 7 är proteinet med pI 5 minusladdat medan de med pI 8-9 är plusladdade.
Anjonbytare binder in negativt laddade proteiner medan övriga rinner rakt igenom.
Eluera genom att höja jonstyrkan. Kromatogram A280nm på y-axeln och fraktioner
på x-axeln. Kromatogram med endast en topp för proteinet med pI 5.
c) His57 i kymotrypsins aktiva yta fungerar som bas och “tar” en proton från Ser-195
– det skapar en bra nukleofil, vilken kan attackera karbonylkolet i peptidbindningen.
Cys har lägre pKa än Ser så His57 har t o m ”lättare” att ta dess proton än serinens
och skapa en bra nukleofil. Phe har inte någon möjlighet att deprotoniseras och
därmed får vi ett inaktivt enzym.
3. a) vmax = 1.2 µmol/min och KM = 7.1 µM
b) X är en kompetitiv inhibitor eftersom linjerna skär varandra på y-axeln, d v s vmax
ändras inte i inhibitorns närvaro. Inhibitionskonstanten beräknas genom att man ser
på skillnaden i lutning på linjerna i närvaro respektive frånvaro av inhibitor.
Skillnaden i lutning är 1+([I]/KI).
Beräknas; Lutning i närvaro av inhibitor = Lutning i frånvaro av inhibitor ∙
(1+([I]/KI)).
I uppgiften saknas dock uppgift om inhibitorns koncentration vilket ommöjliggör
beräkning av ett siffervärde.
c) Ger ett mått på enzymets effektivitet. Anger hur mycket substrat som omvandlas
till produkt per enzymenhet och per tidsenhet.
4. a) Anabol process = biosyntetisk process. Exempel; Fettsyrasyntesen,
glukoneogenesen
b) Glukos, C6H12O6, bryts i glykolysen ner till pyruvatjoner samtidigt som NADH
och en liten mängd ATP bildas (genom substratnivåfosforylering). Pyruvatjonerna
omvandlas sedan till acetylCoA och CO2 samt ytterligare lite NADH frisätts.
AcetylCoA bryts sedan ner genom citronsyracykelns reaktioner vilka startar med att
acetylCoA kondenserar med oxaloacetat varvid citrat bildas. Under ett varv i
citronsyracykeln frisätts 2 CO2, 1 FADH2, 3 NADH och 1 GTP. Slutligen avges
elektronerna som bärs av FADH2 och NADH till proteinkomplexen i mitokondriernas
innermembran = andningskedjan. Elektrontransporten ger upphov till att protoner
pumpas från matrix till mellanmembransutrymmet och när dessa protoner återvänder
till matrix via ATP-syntas bildas ATP. Elektronerna tas upp av syre som då bildar
H2O.
c) Enzymet heter pyruvatdehydrogenas och det hämmas om [ATP] är hög och
stimuleras om [ADP] är hög.
d) Fettsyror syntestiseras då vi har överskott på energi i kroppen. Utgångsämnet är
acetylCoA och för lagring byggs triacylglycerol upp. Triacylglycerol består av tre
fettsyror och en glycerol.
e) Muskler; snabb tillgång till energi vid muskelarbete
Lever; reglering av blodsockerhalten
5. a) DNA dubbelsträngat – RNA enkelsträngat
DNA innehåller C,G,A,T – RNA innehåller C,G,A,U
Sockret i DNA är deoxyribos – sockret i RNA är ribos
b) Effektiv tätpackning i kärnan (upplindning på positivt laddade histoner)
Stabilitet – står emot basisk hydrolys
c) Båda DNA-kedjorna ska fungera som mall för DNA-syntesen, så den ena
exponeras alltså 3’ till 5’ och den andra 5’ till 3’. DNA-polymeraser rör sig från
mallens 3’-ände till 5’-änden och syntetiserar ny kedja 5’ till 3’. För att detta ska
fungera måste den ena mallkedjan göra en loop och den nya kedjan måste syntetiseras
diskontinuerligt. Enzymet som kopplar samman Okazakifragmenten heter DNA-ligas.
d) Kemiska mutagener kan vara ämnen som liknar de vanliga kvävebaserna och
inkorporeras i deras ställe eller ämnen som modifierar befintliga baser eller ämnen
som binder till (interkalerar med) DNA och uppfattas som en kvävebas.
e) DNA-polymeraser har s k exonukleasaktivitet, d v s kan korrigera sina misstag.
Ett startställe för transkription består av en specifik sekvens 35 baser ifrån startstället
(-35-regionen) och en specifik sekvens 10 baser ifrån startstället (Pribnow-boxen).
f) Rätt aminosyra på rätt tRNA – aminoacyltRNA-syntetasreaktionen
Inbindning av tRNA med aminosyra till F-sitet tillsammans med elongeringsfaktorn
EF-Tu. Om korrekt = hydrolys av GTP och flytt till A-sitet. Den sekvens som visas i
A-sitet ska stämma överens med tRNAts antikodon.
6. a) PCR bygger på att man använder ett värmetåligt polymeras och att man tillsätter
primer (korta DNA-bitar) som binder specifikt till delen av DNA:t som man vill
kopiera. Genom att variera oftast tre olika temperaturer får man en exponentiell
amplifiering av DNA-fragmenten. Se även figur sid 140-141 i Stryer. Förutom
nämnda komponenter behövs även dNTP och buffert.
b) I brunn 1 har du ett band som motsvarar ~300 baspar (104aa=312 baspar) vilket är
det lyckade försöket.
c) I en agarosgel sker separation med avseende både på storlek och konformation.
DNA:t är negativt laddat och vandrar mot pluspolen. Minsta fragmenten går snabbast.
Infärgning sker genom att tillsätta det DNA-bindande ämnet etidiumbromid som vid
belysning med UV-ljus fluorescerar.
d) Expressionsplasmid och DNA-fragment klyvs med samma restriktionsenzymer och
blandas i närvaro av DNA-ligas. Blandningen transformeras in i E. coli-celler som har
möjlighet att ta upp plasmiden. De E. coli-celler som har antibiotikaresistens har tagit
upp plasmid.
e) Se figur 899 i Stryer. Styrning av produktion sker med IPTG som fungerar som en
syntetisk inducer.
