Leukemi hos barn och ungdomar
Diagnostik
Stefan Söderhäll
Sektionen för onkologi och koagulation
Astrid Lindgrens Barnsjukhus
Med en del bilder från Cilla Söderhäll
Novum Huddinge
Hematopoes
myeloid
stamcell
pluripotent
stamcell
megakaryocyter
erytrocyter
basofiler
eosinofiler
Differentiering
granulocyt/monocyt
B lymfocyt
lymfoid
stamcell
T lymfocyt
Diagnostik/ terapisvarbedömning
• Benmärgsaspiration
– Morfologisk analys aspirat/biopsi
– Immunfenotypning
– Genetisk analys
•
•
•
•
•
•
Kromosomanalys (traditionell)
DNA index
FISH (interfas)
PCR för Translokationsanalys och MRD analys
CGH array
Sekvensning
– Lumbalpunktion När och hur?
• Klinisk undersökning
–
–
–
–
–
Allmäntillstånd
Blödningar, petechier
Körtlar, lever-mjältförstoring
Andning, halsvenstas
Testikelpalpation
Riskgruppering idag
• Vad är det för risk vi menar?
• Hur bestämmer man den?
• Är den alltid lika stor eller kan den
förändras?
• Vad påverkar risken?
Prognostiska faktorer ALL
LPK vid insjuknandet
• Ålder
• Lymfomatösa manifestationer
• CNS engagemang
• Immunofenotyp
• Cytogenetik / DNA ploidi
• Initialt terapisvar Konventionell teknik
Minimal residual disease (MRD)
Immunofenotypning
fluorokrom
monoklonal
antikropp
differentierings associera
ytantigen
malign cell
Leukemier indelas efter transformerad
ursprungscell
och identifieras efter sitt uttryck av olika
ytantigener
Giemsa banded Karyotype
Spectral Karytyping SKY
SKY (spectral karyotyping)
Interfas fluorescerande in situ hybridisering
= interfas FISH
Kromosomanalys av ALL celler
• Prognos+
• t(12;21)(p12;q22),TEL-AML1, 20%?, pre B
(“kryptisk”)
• Hyperdiploidi modaltal 47-50, 15%, pre B
• Hyperdiploidi modaltal 51-65, 25%, pre B
• Prognos-
• t(9;22)(q34;q11), BCR-ABL, 3%, B/pre-B
• t(4;11)(q21;q23), MLL-AF4 och varianter, 2%, pre-pre
B
• Hypodiploidi <44
• dic(9;20), preB
• t(1;19)(q23;p13), E2A-PBX1, 5%,
Kromosomanalys – Genetisk
analys vid AML
• Prognos +
• t(15;17)(q22;q11-21) , PML-RARA, 7% ?, M3
• inv16
, CBFb-MYHll, 7%, M4EO
• (t(8,21)(q22;q22) , AML1-ETO, 10%, M2)
• Prognos -
• monosomi 7
• t(1;22)(p13;q13), ? , 2%, M7
Differentialdiagnoser
diagnostik hjälp
• Icke maligna sjukdomar
– Bakteriell infektion speciellt
meningokocksepsis
– Virala infektioner i synnerhet
• EBV, CMV
– Idiopatisk trombocytopen purpura ITP
• retikulocyter
– Aplastisk anemi
• Biopsi!!!! Upprepade BM prover
– Hemolytiskt uremiskt syndrom
• Kreatinin, blodtryck, retikulocyter,
hemolystecken
Differentialdiagnoser
• Maligna sjukdomar
– Myelodysplasi
– Maligniteter med
benmärgsinfiltration ex
• Bilaterala prover, biopsier
• Neuroblastom
• Lymfom
• Ewing sarkom
• Mjukdelssarkom
• Mfl som metastaserar till benmärgen
Bedömning av terapisvar
• Klinik
• Blodvärden
– transfusionsintervall
• Morfologi
– D15, d29, d78
• Flödescytometri MRD
– D15? Fångar upp ev markörskift samt snabbt terapisvar
– Känslighet ner till 10-4-(10-5)
• PCR MRD
– Immunglobulinrearrangemang, T-cellsreceptorrearrangemang
– Specifika translokationsrearrangemang
– Känslighet ner till 10-5
• FISH
– Begränsad känslighet %-nivå
GCSF
I-D+/P+ Induction with dexa. or pred.
VCR/Dexa reinductions
DepoCyte/pred.succinate
IIDC DI w/ daunorubicin and cyclo
i.t. MTX
HDMTX with i.t. MTX
IIC DI w/ cyclo
TIT with conventional AraC
PEG-asparaginase
II DI w/o daunorubicin and cyclo
NOPHO ALL-2008
MRD timepoints
d0
d29
SCT*
d79
d15
BM:
HR (10-15%):
preB>100
or T
A
MLL
Hypo<45
C
A
B
C
A
B
C
IIC
R3
6MP
MTX
>10-3
I-D+
IR (35%):
<10-3
t(1;19)
Amp21 CNS3
dic(9;20)
I-P+
SR (50-55%):
<10-3
HDMx3, PEGasp
6MP 25-75mg/m2
R1
>10-3
preB<100
B
R2 IIDC
6MP
MTX
IIC
HDMx3, PEGasp
6MP 25mg/m2
R1
R2
6MP
MTX
II
HDMx3, PEGasp
6MP 25-75mg/m2
0
4
5
12
R1 6MP dose increments (25-50-75 mg/m2 if HDM w/o ANC<0.5 and T<50),
130
N=900-1000
R2 PEG-asparaginase 1.000 IU/m2 at 2 vs 6 weeks intervals weeks 13-33,
N=900-1000
R3 Standard TIT vs DepoCyte/pred.succinate at 12w intervals x6,
N=100-130
*SCT if d29 M2/3 or d79/post-B >10-3
Svensk version 2008-12-30
MRD
begreppet minimal residual disease
Nya tekniker för att mäta små kvarvarande
mängder leukemiceller
Terapisvar d29 och d79 mätt med MRD
slår ut nästan alla andra prognosfaktorer
EFS
100
D29 MRD < 1‰
75
50
0
1
2
3
4
Years from Dx
5
6
Flödescytometri
% leukemi-lika av alla
Framrenade mononukleara celler
PCR restmängd jämförd med
klonen som karakteriserades vid
diagnos
Minimal residual disease assessment in childhood acute lymphoblastic leukaemia: a Swedish
multi‐centre study comparing real‐time polymerase chain reaction and multicolour flow
cytometry
British Journal of Haematology
Volume 152, Issue 6, pages 743-753, 20 JAN 2011 DOI: 10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x/full#f3
Minimal residual disease assessment in childhood acute lymphoblastic leukaemia: a Swedish
multi‐centre study comparing real‐time polymerase chain reaction and multicolour flow
cytometry
British Journal of Haematology
Volume 152, Issue 6, pages 743-753, 20 JAN 2011 DOI: 10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x/full#f4
British Journal of Haematology
Volume 152, Issue 6, pages 743-753, 20 JAN 2011 DOI: 10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x/full#f4
British Journal of Haematology
Volume 152, Issue 6, pages 743-753, 20 JAN 2011 DOI: 10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2141.2010.08456.x/full#f5
Riskindelning – dag29
Nonhigh från början
MRD < 0,001 (=0,1%)
Ja < 0,1%
HR cytogenetik? Ja
Nej
IR cytogenetik? Ja
Nej
CNS3?
Ja
Nej ≥ 0,1%
>5% blaster i BM?
Nej
HR cytogenetik?
Nej
Nej
Standard
Ja
Intermediär
Ja
HR +
SCT
HR
CGH-Array
CGH
Comparative genome hybridization
CGH-Array
Comparative genome hybridization
CGH-Array CGHC
Next generation DNA sequencing/
massively parallel DNA sequencing
• Nya metoder för storskalig sekvensering
• Ett fåtal märken på marknaden (2004->) som använder olika teknologi
• Gemensamt
– DNA molekylerna fästs på yta
– Parallell sekvensering
– Sekvensen läses i realtid
– Korta sekvenser
– snabbare och billigare
Kan automatiseras
=> snabbare och billigare
=> projekt som för några år sedan var helt orimliga
kan idag genomföras på några månader
Metodbeskrivning
•
•
•
•
•
•
Fragmentera provet
Gör bibliotek
Fäst till yta
Amplifiera
Sekvensera
Sekvensanalys
– Pussla samman sekvensen
december 5, 2014
Cilla Söderhäll
28
Metodbeskrivning
RNA
•
•
•
•
•
•
Fragmentera provet
Gör bibliotek
Fäst till yta
Amplifiera
Sekvensera
Sekvensanalys
cDNA
– Pussla samman sekvensen
cDNA = DNA sträng som tillverkats från RNA mall
29
Riktad ResekvenseringDNA Exom
• Exom = alla kända exon i ett genom
• Anrika för exonsekvenser
– Jämför sekvens mellan sjuka och friska
– monogena sjukdomar
• Fördelar:
– Mycket mindre än hela genomet (1,5%)
– Störst chans att hitta något här
• Nackdelar:
– Labintensivt
– Endast exon
30
Major changes in AML 2012
MRD flow is used for evaluation of treatment response
Intensification and lengthening of induction courses
Risk grouping refined
HR definition
Poor response after course 1 ≥ 15% LC
Poor response after course >4.9% after induction 1
Poor response still after induction 2 >0,1%
FLT3-ITD without NPM1 mutation
Standard risk patients receive
three consolidation courses
Standard risk patients with Inv(16)
receive two consolidation courses
Konstitutionell
genuppsättning
•
•
•
•
•
Exempel
Variation i omsättning av läkemedel
Olika subtyper av leukemi
Olika DNA reparationsförmåga
Mm, mm
AML jämförelse Down och
övriga
1,0
,9
,8
0.82 (n=36) DS
Probability
,7
,6
0.50 (n=242 non-DS
,5
,4
,3
,2
,1
0,0
0
1
2
3
4
5
6
Years from diagnosis
7
8
9
Transkriptomsekvensering
RNA
• RNA
cDNA
• Alla uttryckta gener
sekvenseras
– Varierar mellan vävnader
– Varierar över tid
– Skillnad mellan sjuka och friska?
• Mängden reads motsvarar uttrycksnivån
• Information om transkriptens utseende
– Transkriptionsstart
– Splice varianter
– Nya transkript
december 5, 2014
34
