Labkompendium

LABKOMPENDIUM
VIRUS
och
CELLER
Cellmodeller för studier av virus
T1
6/12 - 2012
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
Celler som verktyg för att studera virusinfektioner ...................................................... 3
Cellodling in vitro ........................................................................................................ 3
Allmän introduktion ................................................................................................... 3
Olika typer av kulturer ............................................................................................... 4
Organkultur ...................................................................................................... 4
Vävnadskultur ................................................................................................... 4
Cellkultur .......................................................................................................... 4
Primärkultur ..................................................................................................... 5
Cellinje .............................................................................................................. 5
Etablerad cellinje .............................................................................................. 5
Kontaktinhibition ....................................................................................................... 6
Serumfaktorer och näringsmedier för cellodling....................................................... 6
Biologiskt material ............................................................................................ 6
Kemiskt definierade medier ............................................................................. 7
Dispergering av celler ................................................................................................ 7
Kontamination ........................................................................................................... 8
Ordlista ...................................................................................................................... 9
Att arbeta sterilt ......................................................................................................... 12
Cellkultursystem för studie av virusinfektion, produktionsförsök ................................ 13
Materiel och Laborationens upplägg, beskrivning av produktionsförsök ................. 13
1. Exempel på celltyper som används i forskning ............................................ 13
2. Olika typer av cellskadande effekt vid virusinfektion .................................. 14
3. Infektion av GMK-celler - produktionsförsök ............................................... 14
Illustration .................................................................................................. 16
Plack och titerberäkning ............................................................................ 17
Bilder .......................................................................................................... 18
2
CELLER SOM VERKTYG FÖR ATT STUDERA VIRUSINFEKTIONER
Virus är parasiter som kräver en värdcell för att kunna föröka sig och spridas vidare. De har
en cell- eller vävnadstropism* vid infektion, vilket leder till att infektion endast sker i de
vävnader eller celltyper som har de egenskaper eller funktioner som viruset kräver för att
kunna infektera och förökas. Vissa virus, såsom herpes simplex virus typ 1 och 2, har en
bredare tropism och kan infektera flera olika typer av celler. Andra virus har en snävare
tropism, exempelvis RS-virus som endast infekterar en specifik typ av cell i luftvägarna, eller
rabiesvirus som främst infekterar neuronal vävnad. Baserat på virusets tropism väljer man
att studera infektion i den typ av cellkultur som uppfyller virusets basala ”krav”.
I cellkulturer odlas celler ut i botten av ett kärl och vanligtvis växer cellerna i ett monolager*
(se en mer utförlig beskrivning under avsnittet Cellodling in vitro). Dessa kulturer är en
förenklad modell som ska efterlikna den speciella vävnad som viruset normalt infekterar. I
cellkultursystemen kan man studera många olika aspekter av en virusinfektion och få fram
viktig information, t.ex. om vilka delar som är absolut nödvändiga för att viruset ska kunna
infektera, hur viruset påverkar sin värd under infektionen och i slutändan också hur man ska
kunna ta fram nya vaccin och läkemedelssubstanser för att förebygga och behandla
infektionerna. Vissa virustyper, bl.a. Norovirus (som kan orsaka vinterkräksjuka) och
hepatitvirus har i dagsläget inget väl fungerande cellkulturssystem och de är därmed svårare
att studera i laboratorium. För att studera dessa infektioner förlitar man sig istället på andra
metoder som exempelvis transfektion* och analys av VLP (virus-lika partiklar)*.
CELLODLING IN VITRO
Allmän introduktion
Vävnader och celler från djur sägs befinna sig i kultur när de växer in vitro*, i odlingskärl med
näringsmedium. Vävnads- och cellkulturer* är bra experimentella system för att studera flera
medicinska och biologiska företeelser. Cellkulturen tillåter studier av biokemiska processer i
enskilda typer av celler, vilket är en stor fördel jämfört med att arbeta med försöksdjur.
Organ- och cellkulturer* har också varit oumbärliga redskap inom virusdiagnostiken, men har
* anger att termen återfinns i ordlistan på sidorna 9-11
3
idag till stor del ersatts av andra tekniker, så som exempelvis PCR*. Vid framställning av
vaccin används fortfarande cell- och bakteriekulturer.
Olika typer av kulturer
Under 1800-talet började framför allt embryologer att utveckla metoder att studera levande
celler och organ in vitro. År 1885 upptäckte Vilhelm Roux att delar av kycklingembryon
kunde hållas vid liv ett par dagar i buffrade fysiologiska koksaltslösningar. Allt eftersom det
fysiologiska och biokemiska vetandet fördjupades kunde mer avancerade tekniker tas i
anspråk. Framför allt har de kemiskt definierade medierna och god aseptisk teknik
möjliggjort att man kan hålla flera typer av celler och organ från varmblodiga djur under lång
tid in vitro. I detta avsnitt beskrivs närmare olika typer av organ-, vävnads- och cellkulturer.
Organkultur
Karaktäristiskt för denna kultur är att flera olika, differentierade *, celler samverkar som om
de fortfarande vore i funktion inuti kroppen. Typiska exempel är trachea, där cellernas
slemtransporterande rörelse fortfarande kan observeras, eller nervvävnad, ovarier,
tyreoidea och tarmvävnad. Dessa kulturer används för studier av organfunktioner, samt för
studier av speciella, oftast färdigdifferentierade, celler. De är också lämpliga för odling av
virus som har specifika krav på värdcellen.
Vävnadskultur
Begreppet har sitt ursprung i in vitro-odlingen av fragment från sönderdelad vävnad i
suspension, eller vävnadsexplantat som bäddats in i koagulerad plasma. På senare tid har
begreppet vävnadskultur kommit att associeras med in vitro-odlingen av celler i allmänhet.
Cellkultur
Det finns huvudsakligen tre typer av cellkulturer, som alla kan framställas från den
ursprungliga vävnaden på tre olika sätt:
4

Vävnaden sönderdelas till enskilda celler på mekanisk väg.

Vävnaden sönderdelas till enskilda celler med hjälp av proteolytiska enzym.

Enskilda celler växer ut från ett vävnadsfragment.
Primärkultur *
Består av ett eller flera olika cellslag från en bit vävnad där vävnadens struktur har utplånats
genom dissociering, till enskilda celler. Cellerna växer, omflutna av näringsvätska som ett
monolager* på odlingskärlets botten, eller flytande i aggregat som cellsuspension *. De
ingående cellslagen är differentierade i olika grad. Sorting out *-fenomen leder till att
områden av lika celler bildas. Cellerna i primärkulturen motsvarar inte nödvändigtvis cellerna
i den levande vävnaden, eftersom vissa cellslag gynnas medan andra missgynnas i den
primära cellkulturmiljön. Primärkulturen används till att studera virus som kräver värdceller
med delvis bevarade differentieringskaraktäristika.
Cellinje *
När celler överförs från en primärkultur till en ny odlingsflaska, dvs. passeras *, betecknas den
nya kulturen cellinje. Detta innebär en ytterligare selektion och begränsning av antalet
ingående cellslag. Fortsätter man att passera cellinjen går man mot en allt mer konstant
cellsammansättning. Vill man framställa en kultur av i hög grad enhetliga celler, måste man
framställa s.k. kloner*. Vid detta fås initialt celler med identisk genuppsättning och
differentieringsgrad. Efter några passager divergerar cellerna från varandra i varierande
grad, beroende på mutationer av olika slag. Differentieringsdynamiken i cellkulturen är dock
mycket komplex. Cellinjer används för studier av kulturer som förfogar över
ursprungscellens fulla genetiska uppsättning, samt inom virologin.
Etablerad cellinje *
Av olika anledningar kan ibland en cellkultur övergå till att kunna passeras i oändlighet.
Denna förändring kan ske spontant eller genom inverkan av olika agens, så som mutagena
substanser, joniserande strålning eller vissa virus. Förändringen kallas transformation *. De
transformerade cellerna får nytt utseende; de blir kortare, rundare och kontaktinhibitionen
(se nedan) minskar ofta så att cellerna ibland kan ge upphov till tumörer, både maligna och
benigna, när de injiceras på försöksdjur. Eftersom samma agens även kan framkalla cancer
hos försöksdjur ligger det nära till hands att knyta samman tumörutveckling med
transformation. En etablerad cellinje kan också fås fram via odling av tumörceller eller
genom fusion av en normal cell och en etablerad cell (inte nödvändigtvis av samma sort). Vid
varje passage av den etablerade cellinjen sker en förändring av cellpopulationen på grund av
de, från cellens ursprungsmiljö, kraftigt avvikande cellkulturbetingelserna. Efter ett antal
5
passager har de egenskaper som gynnar växt i cellkultur förstärkts, medan de onödiga
funktionerna har selekterats bort. Detta kan ske genom förlust av vissa kromosomsegment
och mångdubblande av andra. Därmed förvandlas den diploida* cellen till en heteroploid*.
Den etablerade cellinjen kan betraktas som ett slutet evolutionärt system; nya mutanter
uppstår, prövas och förkastas eller förökas ständigt. De mutanter som kan förena snabb
delning med optimalt utnyttjande av miljön kommer snabbt att dominera cellinjen.
Situationen kommer att vara lik den i en snabbt växande cancersvulst. Etablerade cellinjer
används där stora mängder eukaryota celler behövs och mindre vikt läggs vid definierad
genuppsättning.
Kontaktinhibition
Kontaktinhibition kan innebära dels inhibition av cellens rörelse, som inträffar när celler
berör varandra, dels inhibition av celldelning vid kontakt med grannceller. Med den
generella termen kontaktinhibition avses oftast det senare. Kontaktinhibitionen får som
konsekvens att celldelningen i en kultur upphör när en viss kritisk celltäthet uppnåtts. Att
celldelningen upphör tyder inte på någon brist på näringsfaktorer i mediet, då medium från
en kontaktinhiberad kultur kan understödja utväxt av celler i en ny kultur. Det verkar i stället
finnas receptorer på cellens yta, som reagerar på närvaron av en intilliggande cell. När
tillräckligt många sådana receptorer har aktiverats hämmas cellens delning. Det molekylära
underlaget för fenomenet är fortfarande till största del okänt. En kontaktinhiberad cell
stannar i G1-fasen i celldelningscykeln. Genom kontaktinhibitionen hindras cellerna från att
växa ovanpå varandra och om cellerna är adherenta (fastväxande) bildas ett monolager.
Serumfaktorer och näringsmedier för cellodling
Biologiskt material
För att celler skall kunna växa i kultur måste oftast serum eller liknande extrakt tillsättas. Det
finns i serum en mängd ofullständigt kända faktorer som påverkar cellernas tillväxt, bl.a.
hormoner och peptider (tillväxthormoner, vitaminer, insulin), transportproteiner som binder
t.ex. mineraler eller lipider (transferrin binder järn, albumin binder kolesterol) samt fria
fettsyror och mineraler. Serumfaktorerna är många och måste samverka för att den
6
tillväxtstimulerande effekten skall uppstå. Man har även funnit att många cellslag utsöndrar
egna tillväxtfaktorer som har serumlika effekter på celltillväxten.
Kemiskt definierade medier
De tidigaste näringsvätskorna vid cellodling in vitro utgjordes av plasma, serum och
vävnadsextrakt. Efter hand som kunskapen om cellernas metabolism ökades kunde
syntetiska, fullständigt kemiskt definierade media introduceras. Deras fördel framför
kalvserum, som annars används mycket, är att man vet precis vad de består av, vilket ökar
reproducerbarheten i försökssammanhang. För tillväxt av celler in vitro är det nödvändigt att
upprätthålla gynnsamma koncentrationer av nödvändiga oorganiska joner samt fysiologiskt
osmotiskt tryck och pH. Dessa betingelser uppfylls av den s.k. balanserade saltlösningen
(balanced salt solution, BSS), som är basen i alla kemiskt definierade cellkulturmedier. Vissa
balanserade saltlösningar innehåller dessutom glukos. De flesta balanserade saltlösningar
innehåller CO2-bikarbonatbuffertsystem, vilket innebär att cellerna måste odlas i tillslutna
kärl eller i en atmosfär som innehåller 5 % CO2 för att förhindra att förlust av CO2 leder till en
toxisk höjning av pH. Balanserade saltlösningar berikas sedan med aminosyror, vitaminer
och andra kemiskt definierade näringsämnen för att producera de syntetiska medier som
används idag.
Dispergering av celler
Vid anläggande av en cellkultur och passage av celler är det nödvändigt att dispergera
(finfördela) vävnadsbitar och cellaggregat till en suspension. Detta sker vanligen med hjälp
av proteolytiska enzym och/eller kelatbildare. Det proteolytiska enzymet spjälkar
intercellulära proteinbryggor och kelatbildaren binder divalenta katjoner, främst Ca
2+
och
2+
Mg , som fungerar som stabilisatorer för de intercellulära bindningarna. Flera olika enzym
kan användas för celldispergering; kollagenas rekommenderas för vävnad som innehåller
mycket bindväv och pronas ger mycket snabb och komplett dispersion av vissa humana
vävnadstyper. Trypsin har dock blivit det mest använda enzymet i dessa sammanhang. De
mest använda kelatbildarna är EDTA (etylendiaminotetraättiksyra) och citrat. Dessa är mest
effektiva för dispersion av celler som redan befinner sig i monolager.
7
Kontamination
Alla cellkulturer är oerhört känsliga för angrepp av virus, svampar och bakterier. För att
bemästra bakterieinfektioner tillsätts ofta en blandning av penicillin och streptomycin (PEST)
i mediet. Svampinfektioner kan förebyggas genom tillsats av en kombination av mycostatin
och nebocetin i mediet. Svårare att komma tillrätta med är infektioner av mykoplasma, som
är ytterst små bakterier, på grund av deras resistens mot flera typer av antibiotika. Dessa
bakterier lever ytterst intimt förenade med cellerna; de är ofta cytoplasmatiskt lokaliserade,
vilket gör att antibiotika riktade mot mykoplasma måste vara verksamma även intracellulärt
i den infekterade cellkulturen. Flera långvariga behandlingar med bl.a. kanamycin och
aureomycin trycker ned infektionen och kan i vissa fall helt utplåna bakterien. De flesta
primära cellkulturer synes vara fria från mykoplasma, vilket tyder på att det är det laborativa
handhavandet som ger upphov till infektionen. Preventiva åtgärder, så som fullgod aseptisk
teknik, är därför viktigt vid cellodling.
8
ORDLISTA
Det råder en språklig förbistring inom cellodlingstekniken; flera begrepp används med
skiftande och ofta oklar betydelse i olika framställningar. Nedanstående ordlista är en
förkortad översättning av Tissue Culture Associations terminologi (Schaeffer, W.I., 1990. In
Vitro Cell Dev Biol 26, 97-101). Dessutom är listan kompletterad med några ytterligare
termer.
Cellkultur: Odling av celler in vitro. I cellkulturen är cellerna inte längre organiserade i organ
eller organliknande vävnad.
Cellinje: Uppkommer då en primärkultur passeras.
Cellsuspension: En typ av kultur där celler, eller aggregat av celler, befinner sig fritt i mediet.
Cytopatogen effekt: Förändring hos cell, exempelvis i utseendet, som orsakas av infektion.
Differentiering: Specialisering av celler för en specifik funktion.
Diploid: Cell med två kompletta kromosomuppsättningar. Människans vanliga celler är
diploida.
Etablerad cellinje: En cellinje sägs vara etablerad när den kan passeras ett obegränsat antal
gånger. Den kan, men måste inte, orsaka tumörutveckling in vivo.
Haploid: Cell med en kopia av varje kromosom. Människans könsceller är haploida.
Heteroploid: Cell med kompletterande kromosomuppsättningar, där antalet kromosomer
avviker från det normala för celltypen.
In silico: Simulering av ett försök i datorprogram. Inkorrekt anspelning på in vitro och in vivo;
korrekt latinsk form skulle vara in silicio (av silicium, kisel).
9
In situ: I intakt cell eller vävnad. Denna behöver dock ej vara vid liv, som är fallet vid in vivo.
Från latin, ”på plats”.
In vitro: I en artificiell miljö som består av små delar av en organism, som inte kan fungera av
sig själv, i t.ex. ett provrör. Från latin, "i glas".
In vivo: I intakt organism. Från latin, "i liv".
Klon: Betecknar en cellpopulation som uppkommit från en enda cell, genom mitoser.
Konfluensgrad: Täckningsgrad, dvs. hur stor del av en yta som är täckt med celler.
Organkultur: Avser bitar av, eller hela, organ som odlas in vitro, så att organets uppbyggnad
och/eller funktion helt eller delvis bevaras.
Monolager: Avser ett cellager, av en cells tjocklek, som växer på en yta.
Passage: Överförande av celler, med eller utan utspädning, från ett odlingskärl till ett annat.
PCR (polymerase chain reaction): En teknik som används för att öka mängden av ett
genetiskt material. En eller några få kopior av en DNA-sekvens kan ökas till miljontals kopior.
Tekniken är vanlig inom bl.a. molekylärbiologi och inom virusdiagnostik.
Plack: Område på ett cellulärt monolager där virusreplikation skadat cellerna.
1 PFU (plaque forming unit): mängden infektiösa viruspartiklar som krävs för att infektera
en cell och ge upphov till ett plack. Används i ”plaque assays” för att kvantifiera mängden
infektiöst virus. Då sägs att ett plack har ursprung i en viruspartikel som kan infektera en cell,
”plaque forming unit”.
PFU/mL: Anger virusets titer, d.v.s. hur många infektiösa viruspartiklar som finns i en viss
mängd vätska.
10
Primärkultur: En kultur som härrör från celler, vävnader eller organ som tagits från en
organism utan ytterligare passage in vitro.
Sorting out: När ett organ finfördelas, aggregerar lika celler selektivt. Detta ger i en
primärkultur ett monolager med områden av lika celler.
Syncytium: Cell-lik struktur som bildats genom sammanslagning av två eller flera celler.
Transfektion: Överföring av främmande genetiskt material till en ”surrogat”-cell för att t.ex.
försöka efterlikna olika infektionsscenarior. På så sätt kan man studera olika aspekter av en
virusinfektion där en väl fungerande cellmodell saknas.
Transformation: Begreppet omfattar minskad kontaktinhibition, ändrad cellmorfologi, ökad
tillväxthastighet, ökad förmåga att passeras många gånger.
Tropism: den cell eller vävnad som har de nödvändiga faktorer och egenskaper som ett
specifikt virus kräver för att kunna infektera och föröka sig.
VLP (virus-lik partikel): En partikel som liknar en viruspartikel men som inte är infektiös
eftersom den inte innehåller något viralt genetiskt material. VLPs används ofta för att
studera virusets ytprotein, hur viruset sammanfogas vid produktion av nya viruspartiklar och
även vid framställning av vaccin.
Vävnadskultur: Avser bitar av, eller hel, vävnad som odlas in vitro, så att dess uppbyggnad
och/eller funktion helt eller delvis bevaras.
11
ATT ARBETA STERILT
I laborationsarbete med celler, bakterier och virus måste man tänka på att alltid arbeta så
sterilt som möjligt, för att skydda sitt preparat från infektioner och kontaminationer av icke
önskvärda bakterier och svampar. Dessa finns överallt: i luften, på arbetsbänken, på dina
händer och kläder, i utandningsluft och hostningar och så vidare. Det sterila arbetet
underlättas av planering och av att man är införstådd med vad som ska göras under
laborationen. Genom att torka av arbetsbänken med ytdesinfektion och genom att täcka
kläder och händer med labrock och skyddshandskar minskar man risken för kontamination.
På så sätt undviker man också att utsätta sig själv och sina kläder för potentiellt infekterat
material.
Plastmateriel, såsom sexhålsplattor och pipetter, är sterila så länge den omgivande plasten
är oöppnad. Så fort förpackningen bryts kommer de att påverkas av den omgivande luften.
Därför bör man inte använda en pipett som varit uttagen ur sin förpackning för länge eller
som har kommit i beröring med exempelvis arbetsbänk eller labrock, utan hellre slänga den
och byta till en ny. Inte heller sexhålsplattor eller flaskor med odlingsmedium bör vara utan
lock respektive kork annat än när arbetet så kräver.
Kom ihåg att ta av skyddshandskarna när ni använder mobiltelefon, miniräknare och tar i
pennor eller liknande!
12
Cellkultursystem för studie av virusinfektion och Produktionsförsök
Arbeta 2 studenter/grupp. Använd skyddshandskar under laborationen!
Materiel (per grupp)
(materiel finns utplacerat vid invertmikroskopen)

1 st. 6-hålsplatta med herpesinfekterade GMK-celler, fixerade och färgade med
kristallviolett - produktionsförsök

2 st. 6-hålsplattor med infekterade GMK-celler, avdödade med glutaraldehydfixering

1 liten flaska med SP2/0-celler

1 liten flaska med Hum-celler

2 små flaskor med GMK-celler, utodlade vid två olika tillfällen
Cellinje
Ursprung
Celltyp
Etablerad?
Användning
GMK
Njurceller från
grön markatta
Epitelcell
(adherent)
Ja
Odling av herpes, polio,
coxsackie, echo, RS, CMV,
parainfluensa
SP2/0
Myelomceller
från musmjälte
B-lymfocyt
(suspensionscell)
Ja
Antikroppstillverkning
Helf
(Hum)
Celler från
humanembryo
Fibroblastcell från
lunga (adherent)
Nej
Odling av de flesta
humana virus
Laborationens upplägg och beskrivning av produktionsförsök
Tänk på att ni INTE behöver ta av 6-hålsplattans lock när ni använder invertmikroskopet.
1. Titta på olika celltyper som används inom forskningen för att studera
virusinfektion
Använd gärna olika förstoringar och rör på flaskorna så att ni ser på celler i olika delar av
odlingskärlet. Studera de två små flaskorna med GMK-celler i invertmikroskop och notera
celltillväxt och ungefärlig konfluensgrad*, dvs. hur stor del av odlingsytan i kärlet som
täcks av celler? Hur skiljer sig cellkulturerna åt mellan flaskorna efter 1 respektive 4 dygn
med avseende på cellernas utseende/morfologi och täthet?
13

Kort information om dessa celler är samlad i tabellen på sidan 13. SP2/0-celler växer i
suspension men kan binda in löst till flaskan. Skaka därför på flaskan några gånger
innan ni tittar på cellerna. Helf (Hum)-celler växer (liksom GMK-celler) fastsittandes
på flaskans botten.

Att tänka på när ni tittar på cellerna:
Hur ser de ut? Hur växer de?
Är cellkulturerna kontaminerade?
Vad är skillnaden mellan epitelliknande och fibroblastliknande?
Fundera över: Vilken typ av virusinfektion kan passa att studera i de olika
celltyperna?
2. Studera olika typer av cellskadande effekt vid virusinfektion
Virus ger upphov till olika typer av cellskadande effekt (cytopatogen effekt – CPE) under
infektionens gång. Exempel på detta finns i plattorna märkta med KOS respektive MP.
Plattorna innehåller två olika herpes simplex typ 1-virus: ett som ger vanliga plack och ett
som ger syncytieplack*. Beskriv skillnaden!
3. Infektion av GMK-celler- Produktionsförsök
GMK celler används ofta som cellmodeller för att studera många olika typer av
virusinfektion t.ex. herpes (HSV). Innan man går vidare med större experiment behöver
man veta hur mycket infektiöst virus man har i sitt prov eller virusstam och detta kan
man ta reda på genom ett så kallat produktionsförsök.
Detta experiment får ni dock inte utföra själva, utan det är redan gjort på
viruslaboratoriet. Följande kursiva text (och illustrationen på sidan 16) beskriver hur
experimentet har gått till:
Samma mängd herpesvirus sätts till brunnarna på en 6-hålsplatta med konfluenta
GMK-celler och inkuberas. Efter en timme skördas cellerna i första brunnen, efter sex
timmar skördas cellerna i nästa och så vidare, vid tidpunkterna 12, 24 och 48 timmar.
Vart och ett av dessa prov innehåller en okänd mängd virus.
14
Proverna med okänd mängd herpesvirus späds i spädningsserier om tiopotenser,
beroende på vid vilken tidpunkt i odlingen de skördades. Generellt kan sägas att tidiga
prover, när viruset i de infekterade cellerna inte har hunnit föröka sig så mycket, späds
mindre än sena prover. Exempelvis kan spädningen 10-1, 10-2 och 10-3 användas på prov
som odlats i en timme, medan prov som odlats i 48 timmar snarare späds 10-4, 10-5 och
10-6. Beteckningen 10-6 anger att provet har spätts 106 gånger, dvs. är 1000000 gånger
svagare än ursprungsprovet.
Efter spädning sätts 0,5 mL per brunn av proverna på nya 6-hålsplattor med GMKceller. Efter ca en timme, då virus har bundit till cellerna, tillsätts metylcellulosa, som
gör att viruset inte kan spridas vidare fritt i mediet, utan bara sprider sig från cell till
cell. Slutligen inkuberas plattan i tre dygn i CO2-termostat och fixeras och färgas
därefter med kristallviolett för att man tydligt ska kunna urskilja de virusplack* som har
bildats.
15
16
Räkning av plack
Anteckna er egen spädningsserie i bilden på föregående sida.
1. Räkna antalet virusplack i den 6-hålsplatta som är färgad med kristallviolett. Använd
4-objektivet och tag hjälp av de horisontella stödlinjerna. Välj en lämplig
koncentration virus; plackantalet bör vara minst 50. Räkna båda brunnarna och
beräkna ett medelvärde.
Antal plack: .................................. st.
2. Beräkna också virustitern i provet och ange den i Plaque Forming Units (PFU)/mL *.
PFU/mL är ett mått på hur många infektiösa viruspartiklar per volymsenhet, som
provet innehåller. Ett värde på 1 PFU/mL anger således att den mängd infektiösa
viruspartiklar finns i provet, som behövs för att bilda ett plack; infektera en cell,
reproducera i den och slutligen döda värdcellen.
Virustiter: .................................. PFU/mL
Redovisa och skriv upp dig på listan!
17
Exempel på olika typer av cellskadande effekt (CPE) orsakat av virus:
Plack
Syncytium
18
Oinfekterad cellmosaik