resistant Escherichia coli

Dose-related selection of Pradofloxacinresistant Escherichia coli
Summer Eriksson
Examensarbete 10 poäng C-nivå, 2007
Biomedicinsk analytikerprogrammet
Institutionen för medicinska vetenskaper, Klinisk bakteriologi
Handledare: Sara Olofsson
-1-
ABSTRACT
The study evaluated the Mutant Prevention Concentration (MPC) of Pradofloxacin on three
Escherichia coli (E.coli) strains, 2 wildtypes and one first-step gyrA resistant mutant. We also
measured the value of AUC (Under the Concentration)/MPC that prevents growth of resistant
mutants. It is of importance to reach a concentration above MPC that prevent E.coli from
developing resistance against the antibiotic.
We used an in vitro kinetic model where we added bacteria? and antibiotic. The culture
flask was attached to a pump with an adjustable pump-speed. This made it possible to dilute
the antibiotics in a satisfying elimination half-life (t1/2= 7 hours) pace. Samples were removed
with a syringe at different times in the study. The samples where then cultured on agar- plates
to enable counting of the viable colonies after incubation.
The optimal concentration to completely eradicate both E.coli wildtypes Nu14 and MG1655
with Pradofloxacin was Cmax ≥8 times MPC and AUC/MPC then became73. Additional
experiments needs to be done on the resistant mutant LM378 before we can determine the
optimal concentration. But results so far indicate that the concentration of Cmax would be
about 8-12 timesMPC to completely eradicate that mutant.
Nyckelord: Fluoroquinolone, antibiotic resistance, Area Under Concentration, Mutant
Prevention Concentration, In vitro kinetic method
-2-
FÖRKORTNINGAR
AUC
Area under koncentrationskurvan
cfu
Colony forming unit
Cmax
Den maximala koncentrationen
MPC
Mutant Prevention Concentration.
MSW
Mutant Selection Window
-3-
INTRODUKTION
I studien har vi gjort försök med Pradofloxacin på Escherichia coli (E.coli). Pradofloxacin
ingår i antibiotikagruppen fluorokinoloner. Fluorokinolon är ett bredspektrumsantibiotika som
togs fram under 1960-talet mot framförallt urinvägsinfektioner. Den första och ursprungliga
kinolonen är nalidixinsyra. Till nalidixinsyra kopplades en fluoridjon, på så vis åstadkoms en
bättre antibakteriell effekt med bättre farmakodynamik och mindre bieffekter (Wolfson 1989).
Grundstrukturen för fluorokinolonen kan ses i figur 1. Genom att tillsätta en fluoridjon på
basstrukturen i position C-6, samt tillsätta olika molekylkombinationer på position 1, 5, 7, och
8 har mer än 10,000 analoger syntetiserats fram (Childs 2006, Lytsy 2005. Pradofloxacin är
en 8-cyano-fluorokinolon och som blivit framtagen för att behandla bakterieinfektioner hos
djur.
Kinoloner verkar genom att blockera två bakteriella topoisomeraser, DNA-gyras och DNAtopoisomeras IV, vilka är viktiga enzymer för replikationen och transkriptionen. Genom att
bilda DNA-topoisomeras–kinolonkomplex hämmas dessa vitala cellfunktioner vilket leder till
att bakterien dör. Fluorokinoloner har en koncentrationsberoende avdödande effekt, vilket
betyder att en ökad dos ger en ökad effekt. Dessa antibiotika utsöndras delvis via njurarna,
och det är därför nödvändigt att anpassa doseringen vid behandling av patienter med nedsatt
njurfunktion, t.ex. äldre patienter (Wolfson 1989, Drlica 1997).
E. coli ingår i familjen Enterobacteriaceae och är en bakterieart som lever i de nedre
delarna av tarmarna hos varmblodiga djur; både hos fåglar och hos däggdjur. Bakterien
upptäcktes 1885 av Theodor Escherich, en tysk barnläkare och bakteriolog. E. coli är en
gramnegativ kort stav med en bredd på 1,1-1,5µm och längd på ca 2-6µm. Bakterien har visat
sig orsaka olika typer av infektioner i bland annat urinvägar, blodbanor, hjärnhinnor och
tarmar. E. coli är viktig för matsmältningen och utgör en stor del av tarmfloran. Antalet E.
-4-
coli bakterier i en människas avföring varierar mellan 100 miljarder och 10 biljoner per gram
feaces (Forsgren 1996).
Som gramnegativ organism är E. coli oförmögen att bilda sporer. Ett effektivt sätt att döda
de aktiva bakterierna är genom pastörisering eller kokning. Som ett resultat av deras
anpassning till däggdjurs inälvor växer E. coli bäst in vivo eller i liknande miljöer jämfört med
kyltempererade miljöer. Den optimala odlingstemperaturen ligger kring 37°C. Hittills har 4
olika ytantigensystem identifierats hos E. coli. Dessa benämns ”O ” (lipopolysackarid), ”K”
(kapsel), ”H” (flagell)- och ”F” (fimbrie)-antigen. Antigenerna möjliggör för bakterierna att
orsaka feber (O), motstå kroppens immunförsvar (K), röra sig (H) och fästa på slemhinnor
(F). Vissa E. coli-bakterier bildar så kallade enterotoxiner/gifter som orsakar diarréer. E. coli
är den vanligaste urinvägspatogenen hos vuxna (~80% av infektionerna) med avseende på
akuta och okomplicerade samhällsförvärvade sjukdomar, följt av Staphylococcus
saprophyticus (10% till 15%). Urinvägsinfektion är en av de vanligaste infektionerna, det
uppskattas att ca 150 miljoner människor världen över drabbas av urinvägsinfektioner, vilket
orsakar en vårdnadskostnad på mer än 6 miljarder dollar (Ronald 2003, Arslan 2005).
Urinvägsinfektion uppstår då E.coli bakterier tar sig in i urinblåsan genom urinröret. Om
bakterier tar sig via urinvägarna ända upp till njurarna kan de orsaka en allvarligare
urinvägsinfektion, s.k. njurbäckeninflammation. Hur svår urinvägsinfektionen blir beror på
flera faktorer, bland annat antalet bakterier, hur svårbekämpade bakterierna är och hur starkt
immunförsvar individen har.
Ingående studier har visat att E. coli i allt större utsträckning världen över har utvecklat
resistens mot olika antibiotika. En tydlig resistensökning kan ses på en rad olika
bredspektrumantibiotika som bl.a. penicillin och trimethoprim (von Baum 2005). I takt med
ökad antibiotikakonsumtion, ökar även antalet komplexa resistensmekanismer hos patogena
bakterier. Samtidigt har läkemedelsindustrins forskning och utveckling av antibiotika minskat
-5-
och de flesta nya preparat är endast modifieringar av redan existerande antibiotikaklasser
(Krause 1992). Antibiotikaresistensen är ett stort orosmoln då det kan leda till allvarliga
konsekvenser för bl.a. svårt sjuka patienter.
Ett vanligt sätt att kategorisera antibiotika är efter deras sätt att verka. Det 5 huvudsakliga
verkningssätten är; 1) Interferering av bakteriernas cellväggsuppbyggnad. Exempel på detta är
β-laktamer (t.ex. penicilliner och cefalosporiner). Dessa antibiotika förhindrar enzymer att
korsbinda peptidoglycan, som är en viktig del av baktericellväggen. 2) Inhibering av
proteinsyntesen; bakteriers ribosomer skiljer sig i struktur jämfört med eukaryota celler,
antibiotika använder sig av dessa skillnader för att inhibera bakterietillväxten (t.ex.
tetracykliner binder till 30S-subenhet på ribosomen medan t.ex. kloramfenikol binder till 50Ssubenheten) (Tenover 2006). 3) Interferering av nukleinsyrasyntesen; den antibakteriella
effekten hos fluorokinoloner beror på en inhibering av DNA-syntesen. Antibiotikat orsakar en
förstörande effekt på dubbelsträngat DNA genom att binda in till DNA-gyras eller DNAtopoisomeras IV under DNA-replikation/transkription (Drlica 1997). 4) Inhibering av
metaboliska processer; en vanlig antibiotikakombination är en folsyra-analog i samband med
en sulfonamid 5) Upplösning av det bakteriella membranet; polymyxin utövar sin effekt
genom att öka bakteriens membranpermeabilitet, vilket i sin tur leder till att innehållet läcker
ut och bakterien dör (Storm 1977).
Resistens mot antibiotika kan uppstå på en rad olika sätt. Exempel på olika
resistensmekanismer som kan uppstå är; (1) Bakterier som förvärvar gener som kodar för
olika enzymer, t.ex. β-laktamaser som hydrolyserar β-laktam antibiotika så att de blir inaktiva.
(2) Bakterier kan förvärva efflux-pumpar som pumpar ut antibiotika ur cellen. (3) Bakterier
kan förvärva ett antal gener som förändrar deras metaboliska egenskaper, detta gör att
bakterien kan producera en alternativ cellvägg som inte antibiotikamolekylen kan binda till.
(4) En fjärde resistensmekanism är då bakterier förvärvar en mutation som leder till att
-6-
antibiotika hindras från att ta sig in i bakterien och på så vis inte kan nå sitt mål. Detta sker då
bakterierna reglerar porin-proteinerna. Förvärvad resistens utvecklas p.g.a. kromosomala
mutationer. Denna typ av selektion kallas för vertikal resistensutveckling. Bakterier kan också
utveckla resistens genom förärvning av nya genetiska material från andra resistenta
organismer. Detta fenomen kallas för horisontell resistensutveckling och kan uppstå mellan
samma eller olika bakteriearter. Vid de genetiska utbyten ingår mekanismer som konjugation,
transduktion och transformation (Tenover 2006).
För att komma till bukt med den ökande resistensutvecklingen bör antibakteriella
läkemedel endast användas då de verkligen behövs, t.ex. vid allvarliga infektioner. Dosering
är också en viktig faktor, genom att optimera doseringen kan behandlingstiden förkortas och
resistensutveckling förhindras. Genom att optimera så att antibiotikakoncentrationerna ligger
ovanför MPC (förklaras längre ner) under hela doseringsintervallet kan teoretiskt sett
resistensutvecklingen minskas/förhindras. Detta är dock inte möjligt för alla preparat då vissa
antibiotika inte går att administrera i allt för höga doser, p.g.a. farmakokinetiken och
toxiciteten. Genom att kombinera två eller flera läkemedel med olika effekter under en
behandling kan problemet kringgås.
Den nedre gränsen av Mutant Selection Window (MSW) är den lägsta koncentrationen som
inhiberar tillväxt av de flesta antibiotikakänsliga bakterier, den nedre gränsen ligger kring
Minimum Inhibiting Concentration (MIC-värdet). Den övre gränsen av MSW är den
koncentration som hindrar tillväxten av den minst känsliga förstastegs- mutanten, denna gräns
kallas för Mutant Prevention Concentration (MPC). Antibiotikadoser inom dessa gränser
gynnar resistensutveckling (Drlica 2003). För att lättare förstå teorin kring MPC och MSW
visas därför en bild på gränserna i figur 2. MPC är nödvändigt att uppnå för att undvika
resistensutveckling. För att tillväxt skall kunna ske över MPC krävs det två eller fler
-7-
resistensmutationer. Då detta är sällsynt kommer få mutationer att uppstå när koncentrationer
över MPC doseras. Exempelvis; om mutationsfrekvens hos en bakterie ligger kring ≤10-7
krävs det en bakteriepopulation på ≥1014 för att två mutationer skall kunna uppstå. Detta är
högst osannolikt då det vid kliniska fall som mest uppkommer en bakteriepopulation på 1010
hos en infekterad patient.
I samband med att MPC undersöks, undersöks också parametern AUC/MPC, där AUC står
för Area Under the Concentration Curve och är arean under koncentrationskurvan över 24h
(se figur 1). AUC/MPC är en relativt ny Pharmakokinetisk/Pharmakodynamisk (PK/PD)
parameter. Denna räknas ut för att undersöka om parametern noggrant kan förutse effekten av
antibiotika och selektion av resistenta mutanter. Tidigare användes parametern AUC/MIC och
var ett mått för effektiviteten för t.ex. fluorokinoloner. Ett index på ca 125 var något som
skulle eftersträvas, dock tar AUC/MIC inte hänsyn till resistens, därför börjar man titta på
AUC/MPC.
I studien använde vi oss av en in vitro kinetik modell, där det tillsätts bakterier och
antibiotika. Kulturflaskan är kopplad till en pump vilket hastigheten ställs in på så att
antibiotika späds ut med önskad halveringstid, i detta fall 7h då det motsvarar kinetiken för
Pradofloxacin hos katter och hundar Därefter tas prover vid olika tidpunkter och odlas ut på
plattor för att vi skall kunna räkna antalet bakteriekolonier. Det viktigaste är dock att
undersöka om andelen resistenta bakterier ökat eller försvunnit mellan 0 och 24h. Vi använder
denna modell för att undersöka tre E. coli-stammar, varav två antibiotikakänsliga vildtypsstammar samt en resistent förstastegs- mutant.
Syftet med studien var att optimera doseringen av Pradofloxacin mot tre E.coli-stammar.
Vi har försökt komma fram till den lägsta dosen som ger bäst effekt och som förhindrar
-8-
selektion av resistenta mutanter. Parametern AUC/MPC räknades ut och undersöktes för
användning somett index för att förutspå och förhindra resistensuppkomst.
Figur 1. Bilden illustrerar grundstrukturen
för fluoroquinolon-molekylen.
Figur 2. Bilden illustrerar övre och nedre
gränserna för Mutant Selection Window;
MPC och MIC. Cmax är den maximala
koncentrationen (Drlica 2003)
-9-
MATERIAL OCH METOD
Provmaterial
Tre E. coli-stammar undersöktes; MG1655 och Nu14 (vildtyps-stammar), och LM378 med
en gyrA-mutation. MIC och MPC-värdet för stammarna var förutbestämda. I tabell 1 visas
MIC och MPC för Pradofloxacin för de olika stammarna.
Tabell 1. E. colistam och genotyp
Stammar
Genotyp
MIC (µg/ml)
MPC (µg/ml)
NU14
wt
0,008
0,2
MG1655
wt
0,008
0,2
LM378
gyrA S83L
0,06
1,8
- 10 -
Antibiotika
Pradofloxacin tillhandahölls i 100% ren pulverform av Bayer Healthcare. Pulvret löstes i
fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en stamlösning med en koncentration på 500µg/ml, som
användes till alla försöken.
Odlingsmedium
Som flytande medium användes Mueller-Hinton (MH) buljong (Difco Laboratories,
Detroit, MI, USA). Bakterierna odlades ut på plattor med Columbiaagar (Substrat
avdelningen, Mikrobiologen, Uppsala, Sverige). För att detektera resistenta bakterier
användes även agarplattor innehållande Pradofloxacin. Antibiotikaplattorna tillverkades med
en koncentration 4xMIC Pradofloxacin för respektive stam
In vitro kinetik modellen
Delarna i modellen bestod bland annat av en flaskhållare som hade ett utlopp och som
anslöts till en pump (P-500; Pharmacia Biotech, Uppsala). I anslutning till botten på
flaskhållaren anslöts ett järnrack och ovanpå järnracket placerades ett filtermembran med en
porstorlek på 0,45µm. En flaska med en volym på 110ml med öppen botten anslöts till
flaskhållaren. Flaskan (se figur3) hade två ”armar” med varsin kork. En kork hade
silikonmembran vilket underlättade provtagningen. Den andra korken var ansluten till en
plastslang, och från en behållare tillfördes flaskan, via plastslangen, ny MH buljong. En
magnetisk omrörare var ansluten till flaskan, denna såg till att det blev en homogen blandning
av bakteriekulturen samt hindrade membranet från att täppas igen. Med hjälp av pumpen sögs
- 11 -
medium genom filtret från kulturflaskan med en given hastighet (11ml/h i detta fall, vilket ger
en halveringstid på 7h), i samband med detta tillfördes ny MH-buljong i samma hastighet
p.g.a. det negativa tryck som uppstod. Antibiotika som tillsattes till flaskan under försöken
späddes enligt kinetikens första ordning; C(t)=Cmax×e-kt, Där Cmax är den initiala
antibiotikakoncentrationen, C(t) är antibiotikakonc entrationen vid tiden t, k är
eliminationshastigheten och t tiden som förflutit sedan antibiotikat tillsattes. Hela proceduren
utfördes i ett inkubationsrum med en temperatur på 37°C.
Figur 3. Bilden illustererar uppsättningen av den in vitro kinetiska metoden
Försöksdesign
En bakteriekultur odlades i ca 6-7h i MH-buljong. På så sätt uppnåddes ett inokulat på
~106 cfu/ml. Till varje försök fylldes flaskan i den kinetiska modellen med ca 110 ml MHbuljong, samt 1 ml av den förberedda bakteriekulturen. Flaskan inkuberades därefter i 3,5h för
att erhålla en population på ~108 cfu/ml. Ett 0hprov togs m.h.a. en sprutnål, därefter tillsattes
Pradofloxacin (4, 6 och 8xMPC för vildtyps-stammar samt 6, 8, 10 och 12xMPC för LM378
). I samband med detta sattes pumpen igång. Ytterligare prover togs vid 2, 4, 20 och 24h.
- 12 -
Proverna odlades ut på Columbiaagar vid olika lämpliga spädningar. Prover som togs vid 0
och 24h odlades även ut på antibiotikaplattor (4xMIC). Plattorna inkuberades övernatt
varefter kolonierna räknades. Detektionsgränsen för plattor utan antibiotika var 10cfu/ml och
1 cfu/10ml för plattor med antibiotika. Antibiotikaplattorna inkuberades i totalt 48h och
kolonierna räknades både efter 24 och 48h. Tre kolonier plockades därefter från plattor med
och utan antibiotika (både vid 0 och 24h), och renströks på ny Columbiaagar. Plattorna
inkuberades övernatt och en koloni från varje platta sparades i -70°C. Kolonierna från utvalda
utodlingsplattor gramfärgades, detta för att konfirmera E.coli. Gramfärgningen utfördes enligt
Lugols metod.
MIC-bestämmning
Genom att utföra MIC-bestämning kan förändringar av bakteriens känslighet mot
antibiotikat upptäckas. MIC-bestämning gjordes både på originalstammarna och på de
kolonier som renstrukits från antibiotikaplattorna som utodlats med 24h prov. Tre kolonier
från varje platta undersöktes.
MIC-bestämningen gjordes i en mikrotiterplatta. Pradofloxacin späddes med MH- buljong
till olika koncentrationer (2, 1, 0,5; 0,25; 0,125; 0,06; 0,03; 0,016; 0,008; 0,004 och 0,002
µg/ml) och 50 µl tillfördes till brunnarna. En bakteriespädning förbereddes genom att
kolonierna suspenderades i PBS till 0,5 McFarland (motsvarande 108 cfu/ml). Från
suspenderingen togs 100µl och tillfördes till 10ml PBS. 50µl av bakteriespädningen tillsattes
sedan till brunnarna. En negativ (bara MH- buljong) och en positiv (MH- buljong och
bakterier) kontroll inkluderades på varje platta. Mikrotiterplattan inkuberades 16-20h i 37°C,
varefter grumligheten i brunnarna och MIC-värdet kunde bestämmas. MIC-värdet
- 13 -
definierades som den lägsta antibiotikakoncentration som inte gav någon synlig tillväxt av
bakterier.
AUC/MPC
AUC räknades ut efter försöken för alla 3 stammarna med formeln:
Där C0 är den initiala (vilket motsvarar den maximala) koncentrationen av antibiotika,
konstanten k = ln2/halveringstiden, och där Ct är antibiotikakoncentrationen vid tiden t. För
att få Ct-värdet användes formeln Ct = C0*e-kt.
RESULTAT
Koncentrations bestämning av antibiotikat
Bakterierna utsattes för pradofloxacin under 24h i in vitro kinetik modellen, och försök
gjordes med olika startkoncentrationer (4-8xMPC för Nu14 och MG1655 med MIC:
0,008µg/ml och MPC: 0,2µg/ml; 6-12xMPC för LM378 med MIC: 0,06µg/ml och MPC:
1,8µg/ml). Andelen resistenta E.coli- bakterier var i början stor trots att de inte utsatts för
Pradofloxacin, men andelen minskade dock vid alla försöken.
Figur 4 illustrerar utodlingsresultat på plattor utan antibiotika för vildtypstammen Nu14.
Kurvorna för 4, 6 och 8xMPC är medelvärden från 2 försök vardera. Resultaten visar en
koncentrationsberoende effekt där 8xMPC ger bäst avdödning. Återväxt observerades efter 20
och 24h för alla kurvor.
Stapeldiagrammet i figur 5 illustrerar utodlingsresultat på antibiotikaplattor (4xMIC) för
vildtypstammen Nu14. Det var en markant minskning av de resistenta bakterierna för 24h
proverna, jämfört med 0hs proverna. I försöken gjorda med koncentrationer på 4 och 6xMPC
- 14 -
avdödades bakterierna inte helt efter 24h. Däremot var de resistenta bakterierna helt utdöda
vid försöken med 8xMPC.
Figur 6 illustrerar utodlingsresultat på plattor utan antibiotika för vildtypstammen MG1655.
Kurvan för 4xMPC är medelvärden från 3 försök, kurvorna 6 och 8xMPC är medelvärden
från 2 försök vardera. Inget av försöken gav en komplett avdödning av MG1655, däremot
verkade koncentrationen 8xMPC hålla bakterierna på en låg jämn nivå redan efter 4h.
Figur 7 illustrerar utodlingsresultat på antibiotikaplattor (4xMIC) för vildtypstammen
MG1655. Som i försöken med Nu14 visar stapeldiagrammet en lika markant minskning av
MG1655-bakterierna på de plattor som utodlats med 24hs prover jämfört med 0h prover. I
försöken gjorda med koncentrationer på 4 och 6xMPC avdödades bakterierna inte helt efter
24h. Däremot varr de resistenta bakterierna helt utdöda vid försöken med 8xMPC.
Figur 8 illustrerar utodlingsresultat för förstastegsmutanten LM378 på plattor utan
antibiotika. Kurvorna för 6, 8, 10 och 12xMPC är medelvärden från 2 försök vardera. Vid 1
av 2 försök avdödades bakterierna efter 20h vid 8xMPC, men en återväxt erhölls efter 24h.
Vid 10xMPC avdödades bakterierna helt efter 20h, vid ett annat försök med 10xMPC skedde
detta endast vid 20h. Därefter uppträdde? en återväxt av bakterierna för alla
koncentrationerna.
Figur 9 illustrerar utodlingsresultat för förstastegs-mutanten LM378 på plattor med
antibiotika. Liksom figur 8 är staplarna medelvärden från försöken med de olika
koncentrationerna. Som för de tidigare stammarna ses en markant minskning av resistenta
bakterier efter 24h jämfört med 0hs proven. Figur 9 visar att inte någon koncentration helt
avdödar bakterierna, dock är detta något missvisande då 24h proverna var vid 1 av de 2
försöken helt negativa vid 10xMPC. Koncentrationen 12xMPC lyckades aldrig helt avdöda
bakterien vid något av försöken.
- 15 -
Sammanställning av PK/PD parametrar
För varje stam jämfördes koncentrationen med lägst Cmax eller kortast T>MPC som
förhindrar uppkomst av resistens, mot den koncentrationen med högsta Cmax eller längst
T>MPC som bidrar till uppkomst av mutanter (se tabell 2). Den optimala koncentrationen för
stammarna Nu14 och MG1655 var ett Cmax på 8xMPC. I tabell 2 ses att 8xMPC
korresponderar mot ett T>MPC på 21hs, samt ett AUC/MPC på= 73. Då Cmax/MPC var < 8
sågs tillväxt av mutanter, samt att MIC-värdet var något förhöjd vid vissa av försöken. De
mest intressanta koncentrationerna för LM378 var ett Cmax kring 8 och 10xMPC. Tabell 2
visar även att vid Cmax 8xMPC, var T>MPC 21hs och AUC/MPC på= 73. Vid Cmax 10xMPC
var T>MPC 23h och AUC/MPC på= 92. MIC-värdet hade inte förändrats vid något av
försöken för LM378.
- 16 -
Figur 4. Bilden visar viabilitetskurvor vid koncentrationerna 4, 6
och 8xMPC av Pradofloxacin för vildtypen Nu14. De markerade
punkterna är prover tagna vid olika tidpunkter och som är utodlade
på plattor utan Pradofloxacin.
Figur 6. Bilden visar viabilitetskurvor vid koncentrationerna 4, 6
och 8xMPC av Pradofloxacin för vildtypen MG1655. De
markerade punkterna är prover tagna vid olika tidpunkter och som
är utodlade på plattor utan Pradofloxacin.
- 17 -
Figur 5. Bilden visar viabilitetsstaplar vid koncentrationer 4,
6 och 8xMPC av Pradofloxacin för Nu14. Proverna som är
tagna vid 0 och 24h är utodlade på plattor innehållande
Pradofloxacin (4xMIC). De blå staplarna representerar
utodlade 0h prov. De röda staplarna visar tillväxten från 24h
prov.
Figur 7. Bilden visar viabilitetsstaplar vid koncentrationerna
4, 6 och 8xMPC av Pradofloxacin för MG1655. Proverna som
är tagna vid 0 och 24h är utodlade på plattor innehållande
Pradofloxacin (4xMIC). De blå staplarna representerar
utodlade 0h prov. De röda staplarna visar tillväxten från 24h
prov.
Figur 8. Bilden visar viabilitetskurvor för förstastegs- mutanten LM378 vid koncentrationerna 6, 8, 10,
och 12xMPC av Pradofloxacin. De markerade punkterna är prover tagna vid olika tidpunkter och som är
utodlade på plattor utan Pradofloxacin.
Figur 9. Bilden visar viabilitetsstaplar för förstastegs- mutanten LM378 vid koncentrationerba 2, 4,6 och
8xMPC av Pradofloxacin. Proverna som är tagna vid 0 och 24h är utodlade på plattor innehållande
Pradofloxacin (4xMIC). De blå staplarna visar tillväxten av bakterier som utodlats med prover som gått i 0h. De
röda staplarna representerar tillväxten av bakterier som utodlats med prover som gått i 24h.
- 18 -
Tabell 2. PK/PD parametrar i den in vitro kinetiska modellen för E.coli- stammarna Nu14,
MG1655 och LM378
Stam
Cmax/MPC
T>MPC
MIC a
AUC/MPC
(timmar)
(µg/ml)
0,016-0,004
Nu14
4
14
37
MG1655
0,016-0,008
Nu14
0,008-0,004
6
18
55
0,03-0,016
MG1655
-
Nu14
8
21
73
-
MG1655
a
LM378
6
18
55
0,06
LM378
8
21
73
0,06
LM378
10
23
92
0,06
LM378
12
25
110
0,06
MIC-värde för kolonier som växte på antibiotikaplattor (4xMPC) utodlade med 24h prov.
SLUTSATS OCH DISKUSSION
Till studien användes en in vitro kinetisk metod. Denna beskrivs och illustreras av Löwdin
et. al samt Gustafsson et al. Metoden är en enkel konstruktion, är relativt billig att använda,
och är inte allt för tidskrävande. Ytterligare fördelar är att; under försökens gång kan
bakterieavdödningen följas med tiden, det är också lättare att simulera farmakokinetiken hos
människor än för de studier som använder sig av djurförsök (Gustafsson 2005). De problem
- 19 -
jag upplevde i början av studien var att behärskauppsättningens monteringsföljd, dock löste
sig detta snabbt då en utförlig metodbeskrivning kunde följas. Ett annat problem var då
flaskan råkade fyllas med lite för mycket MH-buljong i samband med att med att bakterierna
tillfördes. Då fanns en risk att behållaren som tillförde ny buljong kunde kontamineras. Detta
skulle kunna lösas om en av armarna på flaskan gjordes något längre och mer vertikal. De
ovan nämnda problemen var inga större problem i sig.
En allmän metod att mäta resistens är via MIC-bestämmning. Då testas oftast bara en eller
ett fåtal kolonier. Genom att istället odla bakterier på antibiotikaplattor blir
resistensbestämningen mycket känsligare då det odlas ut en större mängd bakterier. För att
förhindra resistensutveckling tillämpas MPC. Vid 2006 gjordes en studie (Olofsson 2006) där
de bl.a; använder den in vitro kinetiska metoden, undersöker dosförhållandet för
Ciprofloxacin genom att odla ut olika E.coli- stammar på antibiotikaplattor, samt titta på tiden
över MPC. Studien visar att ju högre den initiala antibiotikakoncentrationen (Cmax) är, ju
kortare tid krävs det över MPC för att förhindra selektion av resistenta bakterier. Genom att
använda sig av doser som snabbt tar sig över MPC minskar risken för resistensutveckling.
Studier har visat att in-optimala doser av antibiotika kan vara en stark bidragande orsak till
den ökande resistensenutvecklingen (Guillemot 1998, Blaser 1987). I vår studie har vi försökt
optimera doseringen för Pradofloxacin. . I likhet med resultat från Olofson et al (2006) såg vi
att avdödningen var koncentrationsberoende i alla våra försök. Den optimala koncentrationen
för vildtyps- stammarna Nu14 och MG1655 var ett Cmax på 8xMPC (T>MPC= 21h). Vildtypsstammarna var helt avdödade då de utodlades på plattor med antibiotika, däremot försvann
inte den totala populationen då de odlades ut på plattor som saknade antibiotika (gällde även
LM378). Detta fenomen har också observerats i andra studier (Marcusson 2005, Olofson
2006). Att s.k. ”persistent population” återfinns i samband med antibiotika är ett känt
fenomen, men varför olika bakteriepopulationer och behandlingar kan ge upphov till detta är
- 20 -
okänt. Ingen optimal koncentration av Pradofloxacin kunde fastslås för E. coli- stammen
LM378, p.g.a. den rådande tidsbristen hann vi inte med alla planerade försök. Fler försök med
Cmax koncentrationerna 8 och 10 xMPC (ev. högre) bör göras för att kunna fastställa optimala
koncentrationen för denna mutant.
I studien räknade vi ut indexvärden för AUC/MPC för de olika stammarna vid de olika
koncentrationerna. Detta gjordes för att undersöka vilket indexvärde av AUC/MPC som kan
förhindra tillväxten av resistenta mutanter, samt för att undersöka om antibiotikans effekt kan
förutses. Tidigare användes parametern AUC/MIC. Studier visar att AUC/MIC- värde kring
100-125 skall vara tillräcklig för att förhindra uppkomsten av antibiotkaresistens (Wright
2000). Detta värde verkar dock variera mycket då två studier visar att ett AUC/MIC på 29
respektive 43 är de optimala värdena för att förhindra uppkomst av resistens (Wright 2000).
Därför undersöks nu om AUC/MPC är en bättre parameter. För våra försök med
Pradofloxacin var AUC/MPC= 73 för vildtyps- stammarna Nu14 och MG1655 vid ett Cmax på
8xMPC. För LM378 verkar Cmax hamna kring 8 och 10xMPC, vilket då ger den ett
AUC/MPC index på= 73 respektive 92. Då LM378 är en förstastegs- mutant väntas denna ha
ett högre indexvärde än vildtyps-stammarna.
I studien har vi visat att en viss koncentration med ett visst värde på AUC/MPC kan
förhindra uppkomsten av resistens för vildtyp- stammarna Nu14 och MG1655. Dock bör fler
försök göras på stammen LM378.
- 21 -
ACKNOWLEDGEMENT
Jag skulle vilja tack Sara Olofsson som var en utmärkt handledare, vill också tacka hela
gänget på mikrobiologens forskningsavdelning då de hela tiden livade upp vistelsen på
mikrobiologen. Sist men inte minst måste substratgänget få cred.
REFERENSER
Arslan H, Azap OK, Ergönül O, et al. - Risk factors for ciprofloxacin resistance among
Escherichia coli strains isolated from community-acquired urinary tract infections in Turkey.
J Antimicrob Chemother. Vol. 56(5), 914-8, 2005
Blaser J, Stone BB, Groner MC, et al. - Comparative study with enoxacin and netilmicin in a
pharmacodynamic model to determine importance of ratio of antibiotic peak concentration to
MIC for bactericidal activity and emergence of resistance. Antimicrob Agents Chemother.
Vol. 31, 1054-60, 1987
Childs J. Stacy - Safety of the Fluoroquinolone Antibiotics: Focus on Molecular Structure.
http://www.medscape.com/viewarticle/410202_1, 2006
Drlica K and Zhao X. - DNA Gyrase, Topoisomerase IV, and the 4-Quinolones. Microbiol
Mol Biol Rev, Vol. 61, 377–392, 1997
Drlica K - The mutant selection window and antimicrobial resistance. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy Vol. 52, 11–17, 2003
Forsgren A och Kronvall G. - Klinisk Bakteriologi. s. 378-380, 1996
Guillemot D, Carbon C, Balkau B, et al. – Low Dosage and Long Treatment Duration of βlactam: risk factors for carriage of penicillin-resistant Streptococcus pneumonaie. JAMA
Vol. 279, 365-70, 1998
Gustafsson, Löwdin E, Odenholt I, Cars O et al. – Pharmacokinetic and pharmacodynamic
parameters for antibacterial effects of cefotaxime and amoxicillin in an in vitro kinetic model.
Antimicrob Agents Chemother. Vol. 45, 433-8, 2001)
Http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli. 20070424, 2007
Krause RM. - The origin of plagues: old and new. Science. Vol. 257, 1073-8, 1992
- 22 -
Lytsy B - Kinoloner – bot som blivit hot. Läkartidningen Vol. 102, Nr 48, 2005
Lowdin E, Odenholt I, Bengtsson S, Cars O, et al. – Pharmacodynamic effects of sub-MICs of
benzylpenicillin against Streptococcus pyogenes in a newly developed in vitro kinetic model.
Antimicrob Agents Chemother. Vol. 40, 2478-82, 1996
Marcus LL, Olofsson SK, Komp Lindgren et al. Biological cost of single and multiple
norfloxacin resistance mutations in Escherichia coli implicated in urinary tract
infections.Antimicrob Agents Chemother. Vol. 49, 2343-51, 2005
Olofsson SK, Marcusson LL, Komp Lindgren P, et al. Selection of ciprofloxacin resistance in
Escherichia coli in an in vitro kineticmodel; relation between drug exposure and mutant
prevention concentration. J Antimicrob Chemother. Vol. 57 (6), 1116-21, 2006
Ronald, A. - The Etiology of Urinary Tract Infection: Traditional and Emerging Pathogens
Vol. 49, 71-82, 2003
Storm DR, Rosenthal KS, Swanson PE, et al. Polymyxin and related antibiotics. Annu Rev
Biochem. Vol. 46, 723-63, 1977)
Tenover C. F. - Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. AJIC. 2006; Vol. 34, 310, 2006
Van Bambeke F, Michot JM, Van Eldere J, Tulkens PM. - Quinolones in 2005: an update.
Clin Microbiol Infect, Vol. 11(4), 256-80, 2005
Von Baum H, Marre R. - Antimicrobial resistance of Escherichia coli and therapeutic
implications. Int J Med Microbiol. Vol. 295 (6-7), 503-11, 2005
Wolfson JS, Hooper DC. Fluoroquinolone Antimicrobial Agents. Clin Microbiol Reviews,
Vol. 2(4), 378-424, 1989
Wright DH, Brown GH, Peterson ML, Rotschafer JC. et al – Application of fluoroquinolone
pharmacodynamics. J Antimicrob Chemother. Vol. 46, 669-83, 2000
- 23 -