Analys av NK-cellers migration och interaktion med målceller

Analys av NK-cellers migration och interaktion
med målceller
Tobias Everhorn 891020
[email protected]
Alexander Rivera Ahlin 891021
[email protected]
SA104X- Kandidatexamensarbete
Institutionen för tillämpad fysik, KTH, Kungliga Tekniska Högskolan, 10044 Stockholm, Sverige.
13 Maj 2013
Handledare: Björn Önfelt
Examinator: Mårten Olsson
Sammanfattning
Denna rapport kommer att redogöra för NK-cellers (Naturliga mördarceller) beteende vid
odopat tillstånd. Det vi kallar dopning är när NK-celler aktiveras genom interleukin-2, detta är
en signalerande molekyl i vårt immunsystem som reglerar aktiviteten hos vita blodkroppar
vilka utgör en del av immunförsvaret.
Med hjälp av ett par mikroskopfilmer har vi kunnat följa varje enskild NK-cells
migration(rörelse) och interaktion med våra målceller i ett prov under en 8-timmars period.
De målceller vi använder är en sorts tumörceller, HEK 293T(Human embryonic kidney 293T
cells. Vi har valt att spåra cellerna manuellt med ett program kallat ImageJ och automatiskt
med ett matlabprogram, Baxter algorithm. Anledningen till att vi dessutom valt att spåra
automatiskt är för att kunna avgöra hur väl detta program kan spåra celler. Sedermera har vi
beräknat alla cellers hastigheter, både medelhastigheter och hastigheter de har i olika tillstånd.
Slutligen har vi kunnat jämföra våra odopade NK-celler med en uppsättning av väsentligt mer
aktiva(dopade) NK-celler.
Det första vi konstaterade är att våra odopade NK-celler endast dödade ett par tumörceller.
Vilket fick oss att lägga vårt fokus på analys som inte berör det. Vi fann att det t.ex. existerar
klara fördelningar av hastigheten, både för medelhastigheten och hastigheten de har i olika
tillstånd. Definitionen av tillstånden är kort sammanfattat i del 2.3.1 med referens för exakt
definition. Liknande resultat har vi fått fram gällande interaktionsanalysen. Vidare har vi
kommit fram till att automatisk spårning med hjälp av ett speciellt dataprogram inte är
optimalt när man har ett litet prov, men att det kan vara användbart vid analys av stora
mängder data när manuell spårning är ineffektivt. Däremot anser vi att det kräver ett
reproducerbart experiment med hållbar bildkvalité. Det bör även nämnas att Baxter algorithm
är ett program som ursprungligen skapades för att spåra stamceller.
Jämförelsen mellan de odopade och dopade NK-cellerna gav oss att fördelningarna i
hastigheter skilde sig. Majoriteten av de odopade cellernas medelhastigheter låg inom ett
mindre intervall, 1.0-2.2 µm/min, och de dopade cellernas inom ett större intervall, 0.6-2.6
µm/min. Det kan bero på skillnaden i antal celler i de olika proven och att det är osäkert hur
många av cellerna som reagerat på IL-2.
Innehållsförteckning
1. Inledning
2
2. Metod
2.1. Manuell spårning av NK-celler . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2. Automatisk spårning av NK-celler . . . . . . . . . . . . . .
2.3. Analys av odopade NK-celler . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1. Migrationsanalys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.2. Interaktionsanalys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Jämförelse mellan odopade NK-celler och dopade NK-celler
.
.
.
.
.
.
3
3
3
3
3
5
5
3. Resultat
3.1 Manuell spårning av NK-celler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Automatisk spårning av NK-celler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Jämförelse mellan odopade NK-celler och dopade NK-celler . . . . . . . . . .
5
5
10
12
4. Diskussion och slutsatser
4.1. Jämförelse mellan manuell och automatisk spårning . . . . . . . . . . . . . .
4.2. Analys av odopade NK-celler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3. Jämförelse mellan odopade och dopade NK-celler . . . . . . . . . . . . . . .
19
19
19
20
5. Referenser
21
1
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1. Inledning
Upptäckten av NK-cellen en relativt ny upptäckt. Det var tidigt 1970-tal då man började
upptäcka ’naturlig mördaraktivitet’ i flera olika arter och bekräftade existensen av en cell med
högst intressanta egenskaper, att den t.ex. kan oskadliggöra tumörceller. NK-cellen klassas
idag som en lymfocyt vilket är en typ av vita blodkroppar. Den är en del av det ospecifika
immunförsvaret.[1]
Den mest intressanta egenskapen för vår del är att den kan oskadliggöra tumörceller. Det här
är ett område där det idag aktivt bedrivs forskning. När man studerar NK-celler brukar man
aktivera dem med en signalmolekyl IL-2, Interleukin-2, som reglerar aktiviteten för vita
blodkroppar. Detta kallar vi dopning. Ofta sker forskningen på dopade NK-celler därför att
deras dödlighet är mycket högre. Vårt fokus har istället legat på hur odopade NK-migrerar
och interagerar och vilka slutsatser vi kan dra från det. Det material som tillhandahölls för att
undersöka detta var två mikroskåpfilmer över NK-celler och tumörceller av typen HEK 293T,
Human embryonic kidney 293T cells.
NK-cellerna förbereds inför experimentet genom flourescensmarkering (orange/röd för NKceller och grön för tumörceller) samt sorteras in i ett kiselchip med olika brunnar. Brunnarna
är ungefär 300 mikrometer djupa och dess funktion är att hålla cellerna på plats. För att
experimentet ska vara realistiskt ser man till att förhållandet överensstämmer med det i
människokroppen, vilket innebär en koldioxidhalt på 5 % och en temperatur på 37 grader
Celsius.
Det primära målet är att granska hur deras egenskaper och effektivitet som mördare är
kopplad till deras migration, och att jämföra de resultat vi får med dopade NK-celler. En
annan av frågeställningarna var om automatisk spårning är realistiskt och användbart.
2
2. Metod
2.1. Manuell spårning av NK-celler
Två stycken mikroskopfilmer tagna i .lsm-format och omvandlade till .avi-format, var
materialet som tillhandahölls vid start och som arbetet baserar sig på. Filmerna har 240
respektive 228 bilder där en bild är tagen varje 2 respektive 2,1 min. Varje cells koordinat
antecknades vid varje bild under hela sekvensen för att kunna få ut hela dess bana. Dessa
koordinater användes för att beräkna bl.a. medelhastigheter. Det program som använts är ett
bildhanteringsprogram kallat ImageJ med ett visst plugin, ”manuell spårning”.
2.2. Automatisk spårning av NK-celler
Det primära målet för den automatiska spårningen var att undersöka hur väl programmets
spårning överenstämde med de manuella spåren. Dels undersöktes hur väl spåren
överensstämmer med manuellt framtagna spår och dels hur medelhastigheterna
överensstämde med dem beräknade från de manuella spåren. Det program som användes var
Baxter Algorithm[2], vilket är ett spårningsprogram från början var avsett för att spåra
stamceller. Notera att vi endast tillämpar automatisk spårning på en av våra två filmer.
2.3. Analys av odopade NK-celler
Nästan alla resultat och all analys genomfördes med självskrivna matlabprogram som läser in
all data från excelfiler, dvs. spår och interaktionsdata, och utför några specifika beräkningar.
Då det är stora mängder kod så utelämnas en exakt förklaring på hur varje kod fungerar utan
den förklaras istället övergripande. Resultaten som matlabprogrammen genererade presenteras
i olika diagram i resultatdelen.
Det första som konstateras är att NK-celler nästan aldrig dödade de tumörceller de fick
kontakt med. Alla 97 celler som spårades dödade tillsammans endast ett par tumörceller och
därför finns inte möjligheten att göra någon egentlig analys rörande dem.
Vid beräkning av medelvärden väljer vi ett 95% konfidensintervall och antar att det är
normalfördelat. För det använder vi vanligt aritmetiskt medelvärde, formel 1, och beräknar
standardavikelsen med formel 2 och beräknar sedan konfidensintervallet med formel 3.[3]
(1) 𝑥 =
∑𝑛
𝑖=0 𝑥𝑖
𝑛
2
∑𝑛
𝑖=0(𝑥𝑖 −𝑥)
(2) 𝜎 = �
(3) 𝐼 = ±𝑍 ∗
𝑛
𝜎
√𝑛
(Z fås ur tabell för normalfördelningen, 1.96 för 95% konf.intervall)[4]
2.3.1. Migrationsanalys
Då en cells migration undersöktes så delades dess bana in i tre olika tillstånd: TMAP(transient
migration arrest periods), direkt rörelse och slumpad rörelse. TMAP innebär att cellen stannar
eller har lite migration t.ex. om den kretsar runt en tumörcell eller är i kontakt med en. Direkt
rörelse är när cellen färdas ett längre avstånd, rakt och snabbt. Slumpad rörelse är allt
resterande. För att ta reda på när varje cell var i TMAP, direkt rörelse och slumpad rörelse
3
användes ett matlabprogram, getMovement[5]. Det är skrivet med samma definitioner som
används i artikeln[6]. Ett exempel på hur det kan se ut med dessa definitioner av TMAP,
direkt rörelse och slumpad rörelse kan man se i figur 1 med färgkodning som följer,
TMAP=RÖD, direkt rörelse=grön, slumpad rörelse=blå.
y
x
Figur 1. En cells uppritade bana med indelning i TMAP(röd)/direkt rörelse(grön)/slumpad
rörelse(blå). Enheterna på koordinataxlarna är mikrometer.
Först bestämdes medelhastigheten för varje cell. Genom att beräkna hastigheten mellan varje
punkt i en cells bana, beräkna medelvärdet av dem och ange detta som den cellens
medelhastighet. Slutligen delades hastigheterna upp i ett histogram. Dessutom beräknades hur
många gånger varje cell går in i de olika tillstånden. För att göra detta användes ett
egenskrivet program som går igenom varje cells koordinater och kollar när cellen byter
tillstånd och noterar varje gång en ny TMAP, direkt rörelse eller slumpad rörelse startar.
Därutöver kollades alla hastigheter i TMAP, direkt rörelse och slumpad rörelse. Eftersom data
om alla cellers hastigheter mellan alla punkter fanns tillgänglig tog vi ut hastigheterna för de
punkter som är i de olika tillstånden. Med hjälp av dessa data beräknades även hur stor andel
av tiden varje cell är i de olika tillstånden. Den sista analysen som gjordes i denna del var att
kolla hur medelhastigheten för en cell påverkas av hur mycket den är i de olika tillstånden.
Vilket implementerades genom att identifiera vilka celler som låg inom vilket intervall, 010%, 10-20% upp till 90-100%. För att sedan beräkna medelhastigheten av alla celler inom ett
intervall och ta medelhastigheten av dem.
4
2.3.2. Interaktionsanalys
Den undersökningen som gjordes var att kolla hur många kontakter varje cell hade och hur
länge kontakterna varade. Varje cells bana gicks igenom och det noterades varje gång NKcellen var i kontakt med en tumörcell med ett så kallat konjugat. Vilket vi definierat som en
kontakt mellan en NK-cell och en tumörcell som upprätthållits i minst 3 bilder(ca 6 min) där
utbyte mellan cellerna kan ske. Därpå skrevs ett program som räknade antal konjugat varje
cell hade och hur länge varje kontakt varade.
2.4. Jämförelse mellan odopade NK-celler och dopade NK-celler
En annan uppsättning av koordinater från celler som kommer från andra prover tillhandahölls
till denna del. Dessa uppsättningar kommer från experiment som genomfördes på samma sätt
men med dopade NK-celler och är därför mer aktiva mördare. Koordinaterna matades in i
samma program som användes på de odopade cellerna för att få en bra jämförelse. Dessutom
används samma metod för beräkning av medelvärden som beskrivs i 2.3.
3. Resultat
I denna del presenteras de resultat som har blivit framtagna av våra matlabprogram. Eftersom
det essentiella i detta projekt är all data, kommer det bli mycket figurer, diagram och
medelvärden som representerar projektets resultat.
3.1. Manuell spårning av NK-celler
Det skedde många konjugat trots att NK-cellerna nästan aldrig dödade tumörceller. Därför
kunde det undersökas hur många konjugat varje cell hade under experimentet och hur långa
kontakterna var. Från fig 2 och 3 fås att en majoritet av NK-cellerna har 0-7 konjugat med ett
medelvärde på 2.5±0.4 konjugat/cell och att kontaktlängderna är framförallt 0-20 min med ett
medelvärde på 22.4±3.2 min. Vidare fås ur figur 4 och 5 att varje cell går in i TMAP 1-2
gånger och direkt rörelse 0-1 gånger. Medelvärdet för antal TMAPs/cell är 1.80±0.15 och
medelvärdet för direkta rörelser/cell är 0.76±0.14.
Antal konjugat per cell
25
Antal celler
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
Antal konjugat
6
7
8
9
Figur 2. En uppdelning som visar hur många celler som har ett visst antal konjugat.
5
Antal kontakter
Kontaktlängd
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0-20
20-40
40-60
60-80 80-100 100-120120-140140-160160-180
Kontaktlängd(min)
Figur 3. Diagrammet representerar en uppdelning av kontaktlängderna.
TMAPs/cell
70
60
60
50
50
40
Antal celler
Antal celler
70
30
20
10
Direkta rörelser/cell
40
30
20
10
0
0
1
2
3
0
0
Antal TMAPs/cell
1
2
3
Antal Direkt rörelses
4
Figur 4 och 5. Antal celler med ett visst antal TMAPs/cell respektive direkta rörelser/cell.
Undersökningen av alla cellers hastigheter började med medelhastigheten, figur 6. Från den
figuren framgår det att medelhastigheten verkar ligga mellan 1-2 µm/min och väldigt sällan är
lägre än 1 µm/min eller högre än 3µm/min. Med ett medelvärde som är1.95±0.15 µm/min.
Cellernas hastigheter i de olika tillstånden, TMAP/direkt rörelse/slumpad rörelse, visas i figur
7, 8 och 9 där klara fördelningar i respektive tillstånd syns. Hastigheten i TMAP är rätt strikt
mellan 1.2 och 1.8 µm/min medan hastigheten i direkt rörelse är väsentligt snabbare och är
mellan 3 och 5 µm/min. Hastigheten i slumpad rörelse är särskilt mellan 2.1 och 3.7 µm/min,
dvs en hastighet högre än TMAP men lägre än riktad rörelse. För TMAP blir
medelhastigheten 1.48±0.08 µm/MIN, för direkt rörelse 3.89±0.7 µm/min och för slumpad
rörelse 2.90±0.37 µm/min.
6
Antal celler
Figur 6. Medelhastigheter(mikrometer/minut) för alla celler uppdelade i olika intervall.
Hastighetsfördelning i TMAP
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Hastighet(µm/min)
Figur 7. En uppdelning av hur många celler som ligger inom ett specifikt hastighetsintervall i
TMAP.
20
Hastighetfördelning i Direkt rörelse
Antal celler
15
10
5
0
1.0-2.0 2.0-3.0 3.0-4.0 4.0-5.0 5.0-6.0 6.0-7.0 7.0-8.0 8.0-9.0 9.0-10.0
Hastighet(µm/min)
Figur 8. En uppdelning av hur många celler som ligger inom ett specifikt hastighetsintervall i
direkt rörelse.
7
18
Hastighetfördelning i slumpad rörelse
16
Antal celler
14
12
10
8
6
4
2
0
1.7-2.1
2.1-2.5
2.5-2.9 2.9-3.3 3.3-3.7
Hastighet(µm/min)
3.7-4.1
4.1-4.5
Figur 9. En uppdelning av hur många celler som ligger inom ett specifikt hastighetsintervall i
slumpad rörelse.
Antal celler
Figur 10, 11 och 12 visar hur stor del av tiden som NK-cellerna är i TMAP, direkt rörelse och
slumpad rörelse. Det visade sig att TMAP är det klart vanligaste tillståndet. Celler är oftast
90-100% av tiden i TMAP medan de flesta celler är 0-10% i direkt rörelse och slumpad
rörelse. Ur figur 13 och 14 ser man att medelhastigheten för celler går ner när andelen tid i
TMAP ökar, och går upp när andelen tid i direkt rörelse ökar.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
TMAP-fördelning
Andel av tiden i TMAP
Figur 10. Antal celler som är en viss andel av tiden i TMAP.
8
Antal celler
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Direkt rörelse-fördelning
Andel av tiden i Direkt rörelse
Figur 11. Antal celler som är en viss andel av tiden i direkt rörelse.
50
Random-fördelning
Antal celler
40
30
20
10
0
Andel av tiden i slumpad rörelse
Hastighet(µm/min)
Figur 12. Antal celler som är en viss andel av tiden i slumpad rörelse.
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0-10% 10-20% 20-30% 30-40% 40-50% 50-60% 60-70% 70-80% 80-90%
Andel av tid i direkt rörelse
Figur 13. Medelhastigheten celler har som en funktion av hur stor andel av tiden de är i
direkt rörelse.
9
Hastighet(µm/min)
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Andel av tid i TMAP
Figur 14. Medelhastigheten celler har som en funktion av hur stor andel av tiden de är i
TMAP.
3.2. Automatisk spårning av NK-celler
Resultaten är ett histogram över hastigheten för de celler som Baxter Algorithm spårade, och
en bild på spårningen av samma cell som visades i figur 1 fast med koordinater inhämtade av
programmet. Medelhastigheten är framförallt mellan 1.0 och 2.0 µm/min vilket kan ses i figur
15. Dess medelvärde blir 1.64±0.09 µm/min. För att kunna jämföra beräknades uppdelningen
och medelvärdet för hastigheten på de celler som var i filmen vi automatiskt spårat.
Hastighetsuppdelningen är i figur 16 och medelvärdet är 1.77±0.12 µm/min.
Med ögat som enda jämförelse kan man konstatera att banan i figur 1 och 17 är näst intill
identiska, förutom att det i figur 17 lagts till en del i ena änden. Ett snabbtest i matlab, av hur
många unika cellbanor programmet hittade, gav att den hade funnit 91 unika cellspår.
Medelhastighet(Automatisk spårning)
0,3
Antal celler
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Hastighet(µm/min)
Figur 15. Medelhastigheten för de celler programmet hittat.
10
0,3
Hastighet(1 film endast)
Andel av alla celler
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Hastighet(µm/min)
Figur 16. Medelhastigheten för celler från en av mikroskåpfilmerna, samma film som
automatiskt spårats.
y
x
Figur 17. En cells uppritade väg med koordinater inhämtade från Baxter Algorithm, jämför
med den manuella spårningen i figur 1.
11
3.3 Jämförelse mellan odopade och dopade NK-celler
Vid jämförelse av dopade och odopade NK-celler fås att odopade har högre medelhastighet
och majoriteten av dem är inom ett mindre hastighetsintervall än de dopade, detta kan ses i
figur 18. Mer specifikt är medelvärdet för odopade och dopade 1.95±0.15 respektive
1.68±0.12 µm/min. Undersöker vi medelhastigheterna mer djupgående ses att hastigheterna i
TMAP(figur 19), direkt rörelse(figur 20), slumpad rörelse(figur 21) är högre för de odopade i
de 3 fallen än för motsvarande dopade celler, och i direkt rörelse ligger även här en majoritet
av de odopade cellernas hastigheter inom ett mindre intervall än för de dopade. För de dopade
cellerna är medelvärdet för TMAP 1.23±0.06 µm/min, för direkt rörelse 2.80±0.32 µm/min
och för slumpad rörelse 2.55±0.24 µm/min. Jämför de med medelvärdena för de odopade från
avsnitt 3.1 i tabellen nedan.
Tabell 1. Medelvärden för hastigheterna i de 3 tillstånden för odopade och dopade NK-celler
Dopade NK-celler
Odopade NK-celler
TMAP
1.23±0.06 µm/min
1.48±0.08 µm/min
Direkt rörelse
2.80±0.32 µm/min
3.89±0.7 µm/min
Slumpad rörelse 2.55±0.24 µm/min
2.90±0.37 µm/min
Medelhastighet
0,35
Andel av alla celler
0,3
0,25
0,2
Dopade NK-celler
0,15
Odopade NK-celler
0,1
0,05
0
Hastighet(µm/min)
Figur 18. Fördelningen av cellernas medelhastigheter, för dopade och odopade celler.
Hastigheter i µm/min på x-axeln och andel av alla celler på y-axeln.
12
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Dopade NK-celler
2.8-3.0
2.6-2.8
2.4-2.6
2.2-2.4
2.0-2.2
1.8-2.0
1.6-1.8
1.4-1.6
1.2-1.4
1.0-1.2
0.8-1.0
0.6-0.8
0.4-0.6
Odopade NK-celler
0.2-0.4
Andel av alla celler
Hastighetfördelning i TMAP
Hastighet(µm/min)
Figur 19. Uppdelningen av cellens medelhastigheter i TMAP för odopade och dopade NKceller. Hastigheter i µm/min på x-axeln och andel av alla celler på y-axeln.
Dopade NK-celler
Odopade NK-celler
0-0.6
0.6-1.2
1.2-1.8
1.8-2.4
2.4-3.0
3.0-3.6
3.6-4.2
4.2-4.8
4.8-5.4
5.4-6.0
6.0-6.6
6.6-7.2
7.2-7.8
7.8-8.4
8.4-9.0
9.0-9.6
9.6-10.2
Andel av alla celler
Hastighetsfördelning i direkt rörelse
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Hastighet(µm/min)
Figur 20. Uppdelningen av cellens medelhastigheter i direkt rörelse för odopade och dopade
NK-celler.
Hastighetfördelning i slumpad rörelse
Andel av alla celler
0,2
0,15
Dopade NK-celler
0,1
Odopade NK-celler
0,05
5.3-5.7
4.9-5.3
4.5-4.9
Hastighet(µm/min)
4.1-4.5
3.7-4.1
3.3-3.7
2.9-3.3
2.5-2.9
2.1-2.5
1.7-2.1
1.3-1.7
0.9-1.3
0.5-0.9
0
Figur 21. Uppdelningen av cellens medelhastigheter i slumpad rörelse för odopade och
dopade NK-celler.
13
Från uppdelningen av tiden i de olika tillstånden i figur 22 och 23 ses att dopade och odopade
överensstämmer väldigt väl med en stor majoritet för 90-100% i TMAP och 0-10% i direkt
rörelse. Från figur 24 och 25 fås det att minskningen i medelhastighet för hela livslängden
som funktion av andelen tid i TMAP är i princip lika för odopade och dopade. Dessutom är
trenden för medelhastigheten, som en funktion av andelen av tid i direkt rörelse, liknande för
dopade och odopade, båda höjs desto mer de är i det tillståndet. Det går att se i figur 26 och
27 att antalet gånger en cell går in i de olika tillstånden skiljer sig åt, de dopade går in fler
gånger i TMAP och direkt rörelse. Medelvärdena för det kan ses i tabell 2.
Tabell 2. Medelvärden för antal TMAPs/cell och direkta rörelse/cell
Dopade NK-celler
Odopade NK-celler
TMAPs/cell
1.84±0.15
1.29±0.11
Direkta rörelse/cell
0.76±0.14
0.42±0.14
Ur figur 28 ser man att odopade NK-celler har en större andel TMAPs som är mellan 240-480
minuter medan dopade NK-celler har större andel TMAPs som är korta, 0-60 min, och väldigt
långa 540-720 min. Notera dock att experimenttiden för de dopade cellerna är 720 min och
inte 480 minuter som de odopade. Vidare ses det i figur 29 att direkt rörelse för dopade NKceller är väsentligt längre än för de odopade. Respektive medelvärde kan ses i tabell 3.
Tabell 3. Medelvärden för längden på TMAP och direkt rörelse för dopade och odopade
Dopade NK-celler
Odopade NK-celler
TMAP-längd
110±12 min
199±14 min
Direkt rörelse-längd 42.3±6.5 min
25.0±5.4 min
TMAP-fördelning
Andel av alla celler
0,5
0,4
0,3
Dopade NK-celler
0,2
Odopade NK-celler
0,1
0
Andel av tid i TMAP
Figur 22. Figuren visar fördelningen av cellernas tid i TMAP.
14
Andel av alla celler
Direkt rörelse-fördelning
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Dopade NK-celler
Odopade NK-celler
Andel av tid i direkt rörelse
Figur 23. Figuren visar fördelningen av cellernas tid i direkt rörelse.
4,5
Medelhastighet(µm/min)
4
3,5
Dopade NK-celler
3
Odopade NK-celler
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Andel av tiden i TMAP
Figur 24. Graferna i figuren representerar medelhastigheten celler har med en viss tid i
TMAP för dopade och odopade NK-celler. Varje punkt motsvarar medelhastigheten(y-axeln,
µm/min) för de cellerna med en viss andel av tiden i TMAP(x-axeln)
.
15
5
Medelhastighet(µm/min)
4,5
4
3,5
3
2,5
2
Dopade NK-celler
1,5
Odopade NK-celler
1
0,5
0
Andel av tiden i direkt rörelse
Figur 25. Graferna i figuren representerar medelhastigheten celler har med en viss tid i
direkt rörelse för dopade och odopade NK-celler. Varje punkt motsvarar medelhastigheten(yaxeln, µm/min) för de cellerna med en viss andel av tiden i TMAP(x-axeln).
Direkta rörelser per cell
0,8
Andel av alla celler
0,7
0,6
0,5
0,4
Dopade NK-celler
0,3
Odopade NK-celler
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
Antal direkta rörelse
Figur 26. En uppdelning av andelen celler(y-axeln) med ett visst antal direkta rörelser(xaxeln)
16
TMAPs per cell
0,7
Andel av alla celler
0,6
0,5
0,4
Dopade NK-celler
0,3
Odopade NK-celler
0,2
0,1
0
0
1
2
3
Antal TMAPS
4
5
Figur 27. En uppdelning av andelen celler(y-axeln) med ett visst antal TMAPs(x-axeln)
TMAP-längd
0,35
Andel av alla TMAPs
0,3
0,25
0,2
Dopade NK-celler
0,15
Odopade NK-celler
0,1
0,05
0
Tid(min)
Figur 28. En uppdelning som visar hur långa TMAPs är.
17
Längd på direkta rörelser
Andelen av alla direkta rörelse
0,7
0,6
0,5
0,4
Dopade NK-celler
0,3
Odopade NK-celler
0,2
0,1
0
Tid(min)
Figur 29. En uppdelning som visar hur långa direkta rörelser är.
18
4. Diskussion och slutsatser
4.1. Jämförelse mellan manuell och automatisk spårning
Spontant känns det väldigt ineffektivt att manuellt spåra alla celler vid ett sådant här projekt,
och tanken på ett program som gör det åt en är väldigt lockande. Sanningen är att i detta fall
gav manuell spårning ett bättre resultat snabbare. Det ska dock sägas att mycket av det
troligen beror på okunskap, men med den tid som var tillgänglig för projektet fanns det ingen
tid att sätta sig in i hur man gör det på ett bra sätt. Dessutom syns det från figur 1 och 17 att
när den väl spårar en cell är resultatet bra. Däremot är den inte perfekt, den del som den lagt
till kan vara en konsekvens av en krock mellan två NK-celler i kombination med dålig
bildkvalité då i filmen.
Vår uppfattning är att det kommer krävas reproducerbara experiment i stor skala med hållbar
bildkvalité för att det ska vara en effektiv metod. Fast om det finns kunskap inom området och
goda programmeringskunskaper bör man kunna skriva ett program som Baxters algorithm för
att effektivt spåra celler. En sak att notera gällande resultat från den automatiska spårningen är
att felkällorna är många. För det första var programmet inte skrivet för detta experiment.
Utöver det så fann vi endast 91 unika cellspår, varav många av dessa 91 cellspår är delar av
hela cellspår som den tappar bort men sedan hittar igen och startar ett nytt spår. Det innebär
att ett cellspår i den manuella spårningen kan vara uppdelad i t.ex. 2 stycken olika spår i den
automatiska. Dessutom är det ett stort antal celler den inte hittar, vi har inte beräknat ett exakt
värde på detta.
4.2. Analys av odopade NK-celler
Utgångpunkten var från början att spåra celler och undersöka hur deras migration kunde
kopplas till hur effektiva mördare de är. Det skulle göras genom att förstå hur deras hastighet
och interaktion med tumörcellerna påverkade. Fast det noterades snabbt att våra odopade NKceller bara dödade ett par tumörceller så inriktningen flyttades mot analys inte berör det. Det
gick snabbt att konstatera ett par saker, hastigheten i direkt rörelse är mycket högre än den i
TMAP vilket känns logiskt med tanke på de olika tillståndens natur. När NK-cellerna är i
TMAP sitter de fast vid en tumörcell eller kretsar runt i ett litet område oftast nära en
tumörcell medan i direkt rörelse så färdas de längre avstånd som ser ut att vara för att
transportera sig från ett område där den inte hittar någon cell till ett nytt område i jakt på en
annan cell.
Vår data säger att NK-cellerna är i TMAP en väldigt stor del av sin tid och endast en kort tid i
direkt rörelse vilket förklarar varför medelhastigheten för TMAP är lik medelhastigheten för
hela banan. Det går att spekulera i att det är mer krävande för cellen att vara i direkt rörelse
eftersom våra resultat visar att en majoritet av alla NK-celler är i direkt rörelse under 20% av
sin tid(figur 23). Dock kan det bero på att NK-celler lätt fastnar nära eller i en tumörcell under
en längre period och lämnar lite tid över.
19
4.3 Jämförelse mellan odopade och dopade NK-celler
Till att börja med vill vi påpeka att de rätt stora skillnaderna i hastighet kan bero på skillnad i
storlek på de båda experimenten. Nämligen att en har spåret 97 NK-celler och en annan har
spårat 178 NK-celler. Utöver det så kan skillnader förklaras av att IL-2 lyckats aktivera olika
mycket i de olika proven.
Dessa tvivel gäller för alla våra jämförelser men det går åtminstone att se en märkbar skillnad
i antalet TMAPs och direkt rörelser, från figur 26 och 27, som det går att dra slutsatser ifrån. I
en artikel om dopade NK-celler ser man att de dödar betydligt mer[7]. Utifrån det kan man
spekulera i att NK-celler har större chans att döda tumörceller om de går in fler gånger i
TMAP och direkt rörelse. Det kan i sin tur vara en följd av att dopade NK-celler helt enkelt är
mer aktiva och byter oftare tillstånd.
Ytterligare en sak rörande TMAPs är att längden på dem, figur 28, är lite missvisande.
Topparna vid 420-480 och 660-720 beror på att till de staplarna räknas alla TMAPs som är i
TMAP när experimentet slutar vid 480 min respektive 720 min. Undersöker vi kontaktdatan
ser vi att för våra odopade NK-celler är kontaktlängden kort. Från det kan man dra slutsatsen
att det finns en koppling mellan hur långa kontakterna är och om de lyckas oskadliggöra
tumörcellerna.
Det kan ses som normalt NK-cell beteende att cellen är i en sorts cykel, denna cykel skulle då
bestå av tre olika steg och repeteras tills det att cellen dör. Stegen skulle naturligt vara att den
först rör sig snabbt för att hitta ett område med olika tumörceller, för att sedan när cellen hittat
ett område där det finns ett eller flera målceller saktar in och rör sig runt tumörcellerna. Till
sist skulle cellen komma att ta kontakt med en av tumörcellerna för att kanske döda denna
eller gå direkt vidare till första steget.
20
5. Referenser
[1] Vivier, E., Raulet, D.H., Moretta, A., Caligiuri, M.A., Zitvogel, L., Lanier, L.L.,
Yokoyama, W.M. & Ugolini, S. (2011). "Innate or Adaptive Immunity? The Example of
Natural Killer Cells". Science 331: 44–49
[2] Skapat av Klas Magnusson, doktorand, KTH. Ursprungsartikel: P. M. Gilbert, et al.,
’Substrate Elasticity Regulates Skeletal Muscle Stem Cell Self-Renewal in Culture’, Science
27 Aug 2010, Vol. 329 no. 5995 pp. 1078-1081
[3] Permanent länk,’Confidence interval’, 9 Maj 2013
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Confidence_interval&oldid=553766154
[4] http://www.math.kth.se/matstat/gru/FS/tabeller_gk.pdf, 9 Maj 2013
[5] Modifierat program av Ksenia Chechet, Oscar Mickelin. Ursprunligen från
M.A.Khorshidi, ’Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ
and in vitro’. Integrative Biology, vol 3, Juli 2011, pp. 770-778.
[6]Mohammad Ali Khorshidi, Bruno Vanherberghen, Jacob M. Kowalewski,
Kym R. Garrod, Sara Lindström, Helene Andersson-Svahn, Hjalmar Brismar,
Michael D. Cahalan and Björn Önfelt,’Analysis of transient migration behavior of natural
killer cells imaged in situ and in vitro’, Integr. Biol., 2011, 3, 770–778
[7] B. Vanherberghen, P.E. Olofsson, E. Forslund, M. Sternberg-Simon, M.Ali. Khorshidi, S.
Pacouret, K. Guldevall, M. Enqvist, K.J. Malmberg, R. Mehr and B. Önfelt, ’Classification of
human natural killer cells based on migration behavior and cytotoxic response’. Blood, Jan 15
2013
21