Förändringarikomplexadentalabiofilmer
övertidinvitro.
EmiliaDavey
LydiaTran
Handledare:GunnelSvensäterochMadeleineBlomqvist
ExamensarbeteMasternivå(30hp)
Tandläkarprogrammet
Februari2017
MalmöHögskola
Odontologiskafakulteten
20506Malmö
1
Sammanfattning
Syfte
Att undersöka hur tillväxt och succession sker i ett bakteriellt konsortium bestående av
vanliga orala bakteriearter vid lågt pH och vid tillgång av glukos i närmiljön.
Material & metod
Konsortiumet bestod av Streptococcus mutans, Streptococcus intermedius, Streptococcus
oralis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula/dispar, Lactobacillus paracasei,
Capnocytophaga gingivalis, Fusobacterium nucleatum, och Actinomyces odontolyticus.
Denna bakteriekultur sattes till glukosfattiga lösningar vid pH 5.5 och 7.2, samt till en
glukosrik lösning vid pH 7.2 och inkuberades i 37°C. Efter 0, 24 och 48 timmar analyserades
bakteriekompositionen samt pH-värdet i bakteriekulturen.
Resultat
Den procentuella pH-sänkningen var störst i bakteriekulturen med initialt pH 7.2 med tillsats
av glukos, och minst i bakteriekulturen med initialt pH 7.2 utan tillsats av glukos. Alla
bakteriearter förekom i varierande mängd vid odling, men i takt med pH-sänkning sågs en
mer homogen mikroflora som nästan uteslutande dominerades av L. paracasei.
Slutsats
L. paracasei hade stor förmåga att överleva i detta konsortium oavsett miljöförändring, och
visade även på högst syratolerans. Det förekom en samexistens mellan L. paracasei och S.
gordonii eller S. oralis oavsett bakteriekultur. Övriga bakterier klarade sig inte lika bra som
L. paracasei, däribland S. mutans som inte överlevde i bakteriekulturerna i den
utsträckningen som förväntades.
2
Developmentofcomplexdentalbiofilms
overtimeinvitro.
EmiliaDavey
LydiaTran
Supervisor:GunnelSvensäterandMadeleineBlomqvist
Masterthesis(30hp)
ProgramofDentistry
Februari2017
MalmöUniversity
FacultyofOdontology
20506Malmö
3
Abstract
Introduction
The aim of this study was to investigate the outcome of interspecies interactions in vitro in a
consortium made of nine commonly isolated oral bacterial strains under different
environmental conditions, such as glucose excess.
Material and methods
The bacterial consortia was comprised of Streptococcus mutans, Streptococcus intermedius,
Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula/dispar, Lactobacillus
paracasei, Capnocytophaga gingivalis, Fusobacterium nucleatum, and Actinomyces
odontolyticus. This complex culture was incubated in glucose-limited and glucose-rich media
with different pH at 37°C for 48 hours during which the bacterial composition and pH was
analysed at 0, 24, and 48 hours.
Results
The greatest pH-reduction was seen in the bacterial culture with an initial pH of 7.2 with
glucose-excess, and lowest in the culture with an initial pH of 7.2 with glucose-limitation. All
species were identified at least once in the experiments, but the diversity was diminished
following pH reduction.
Conclusion
L. paracasei showed great ability to survive in the bacterial cultures, with the highest acid
tolerance, regardless of environmental change. Coexistence occurred between L. paracasei
and S. gordonii or S. oralis regardless of bacterial culture. Other bacteria did not cope as
good as L. paracasei, including S. mutans that did not survive in the bacterial cultures to the
extent expected.
4
Innehåll
Sammanfattning ....................................................................................................................... 2
Abstract..................................................................................................................................... 4
Introduktion ............................................................................................................................. 6
pH i dentala biofilmer ....................................................................................................................... 8
Motivering av försöksmodell och val av bakterier ........................................................................ 9
Syfte .................................................................................................................................................. 13
Frågeställningar .............................................................................................................................. 13
Hypoteser ......................................................................................................................................... 14
Material och metod ................................................................................................................ 14
Beredning av medium ..................................................................................................................... 14
Beredning av bakteriellt konsortium med flera arter ................................................................. 15
Inkubation ....................................................................................................................................... 15
Bakteriell sammansättning av konsortium ................................................................................... 16
pH-mätning ...................................................................................................................................... 17
Resultat ................................................................................................................................... 17
Förändring i bakteriesammansättning över tid ........................................................................... 17
Förändringar av pH över tid ......................................................................................................... 22
Diskussion ............................................................................................................................... 22
Begränsningar ................................................................................................................................. 25
Signifikans ....................................................................................................................................... 26
Konklusion ....................................................................................................................................... 26
Referenser ............................................................................................................................... 27
Bilaga 1 – Bakteriell sammansättning ................................................................................. 30
Bilaga 2 – Odling av bakteriekulturer ................................................................................. 36
Bilaga 3 – Förändring av pH över tid .................................................................................. 42
5
Introduktion
Ekologiska plackhypotesen
Det har funnits olika teorier om huruvida bakterier samverkar eller inte i utvecklingen av
orala sjukdomar (1, 2). Tidigare har man antagit att en sjukdom orsakas av en eller flera
specifika patogener, något man kallade den specifika plackhypotesen. Senare har man dock
upptäckt att denna hypotes har brister. Till exempel förekommer karies både i närvaro och i
frånvaro av Streptococcus mutans, en patogen som man tidigare trott var ensamt bidragande
till karies. Således kan S. mutans förekomma i dentala biofilmer utan att karies uppkommer.
En annan hypotes som utvecklades var den ospecifika plackhypotesen, som menar att
sjukdom är en följd av mängden dentalt plack. Hypotesen lyfter dock inte faktumet att vissa
bakteriearter återfinns i större grad vid sjukdom än vid hälsa. Idag används den ekologiska
plackhypotesen för att förklara hur orala sjukdomar kan uppkomma, och hur biofilmens
sammansättning kan ändra sig vid hälsa och sjukdom (2, 3). Denna hypotes lyfter fram att
dentalt plack är ett mikrobiellt samhälle, där enskilda bakterier interagerar med varandra. Vid
hälsa råder homeostas, en balans mellan värd och mikroflora. Om balansen störs, till exempel
på grund av förändringar i miljön, kan det gynna vissa mindre dominanta bakterier som
normalt förekommer i mikrofloran utan att ge upphov till sjukdom. Dessa bakterier som är
potentiella patogener och förknippas med sjukdom, får då större konkurrenskraft än de som
förknippas med hälsa. Ekologiska plackhypotesen menar att sjukdomar inte enbart kan
behandlas genom att angripa förmodade patogener, eftersom sjukdom inte nödvändigtvis
förekommer där patogener finns. Det är därför mer adekvat att angripa de förändringar som
kan orsaka en ekologisk obalans som vidare kan leda till sjukdomsutveckling. Exempelvis
sker en ekologisk förändring i placksammansättningen vid högt eller frekvent kolhydratintag,
som kan orsaka demineralisering av emaljen, vilket startar kariesutveckling i tanden. I
samband med behandling av parodontit sker en ekologisk förändring i tandköttsfickor, då
icke-specifika bakterier avlägsnas mekaniskt för att minska inflammation. Detta ger en
miljöförändring som påverkar förutsättningarna för patologi i området (4). Karies och
parodontit är vanliga sjukdomar som kostar patienten och samhället både tid och pengar. I
dagsläget råder brist på kunskap om hur placksammansättningen kan manipuleras för att
minska förekomsten av dessa sjukdomar.
Plackbildning
Pellikel bildas på en ren tandyta, med hjälp av salivens proteiner (5). Bakterier transporteras
passivt till tandytan med saliven, där de fäster reversibelt till pellikeln genom svaga
elektrostatiska attraktionskrafter. Så småningom uppstår irreversibla molekylära interaktioner
mellan adhesiner på de primära kolonisatörerna och kolhydratreceptorer i pellikeln.
6
Figur 1. Illustration av plackbildning (Oral biologi, Malmö Högskola).
Primära kolonisatörer är främst streptokocker, med medlemmar från mitis-gruppen
(Streptococcus gordonii, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis). Koaggregation sker
sällan mellan bakterier från samma art, men kan ske hos tidiga kolonisatörer som
streptokocker och actinomyceter (6). Dessa egenskaper kan förklara varför streptokocker är
mest dominanta bland de tidiga kolonisatörerna. Actinomyces spp. isoleras ofta efter två
timmar, även Haemophilus spp. och Neisseria spp. Med tiden får biofilmen en mindre andel
streptokocker och flera actinomyceter samt andra gram-positiva bakterier. Sekundära
kolonisatörer kan sedan fästa till de primära, ofta genom så kallad koadhesion. Utöver dessa
tidiga kolonisatörer kommer ytterligare bakterier, sena kolonisatörer, bli en del av biofilmen.
Fusobakterier har visat sig kunna koaggregera med flest bakterier, både tidiga och sena
kolonisatörer, men inte med varandra. De komplexa interaktionerna som sker vid mikrobiell
succession leder till en mogen biofilm som underlättar bakteriell interaktion. I Figur 1 visas
en illustration av plackbildning. Genuttrycket hos en mikroorganism kan skilja sig beroende
på om organismen befinner sig i en vätska eller om den har kontakt med en yta. Det påverkas
sannolikt också av lokala miljöförändringar, såsom sockerkoncentration och pH. En viktig
komponent i plackmatrixen är de extracellulära polysackariderna som strukturerar, innesluter
vatten och näringsämnen, samt skyddar. Biofilmen kan avlägsnas mekaniskt, men bakterierna
kan också aktivt lösgöra sig ifrån biofilmen för att kolonisera på andra ställen i munnen. (5).
Samverkan mellan bakterier
Obligat anaeroba arter ses sällan i den tidiga biofilmen. Näring och metaboliter från tidiga
kolonisatörer kan ändra miljön och därmed påverka vilka bakterier som kan tillväxa, till
exempel kan Neisseria skapa en syrefattig miljö där obligat anaeroba bakterier trivs.
Mikrobiella interaktioner har alltså stor inverkan på hur mikrofloran är sammansatt. Det
förekommer både synergistisk och antagonistisk interaktion mellan mikroorganismerna, det
vill säga interaktion till deras fördel respektive nackdel. Exempel visas i Figur 2.
Synergistiska interaktioner innebär att tillväxten av en mikroorganism kan gynnas av eller
helt vara beroende av en annan organism. Till exempel kan S. oralis bryta ner
kolhydratskedjor i glykoprotein, vilket i sin tur exponerar proteindelen som andra
mikroorganismer, bland annat Fusobacterium nucleatum, kan ta del av. S. oralis har
dessutom förmågan att bilda IgA-proteaser, vilket hjälper dem och andra bakterier att
överleva värdförsvaret. Ett annat exempel på synergistisk interaktion är att Veillonella spp.
kan bryta ner laktat som bildats vid andra bakteriers kolhydratmetabolism, och ge
restprodukter i form av acetat. Synergistisk interaktion innebär även koaggregation, cell-cellsignalering och genöverföring. Celler som befinner sig nära varandra i en biofilm har
7
förmåga att signalera med varandra vilket gör att de känner av och kan anpassa sig efter
miljöförändringar. Antagonistiska interaktioner har negativ påverkan på andra bakterier. De
flesta bakterier, framför allt streptokocker, utsöndrar antagonistiska substanser, så som
bakteriociner eller bakteriocin-liknande ämnen. Dessa proteiner hämmar tillväxten hos andra
bakterier och kan vara till fördel vid kolonisering. Andra hämmande substanser som bildas av
plackbakterier är organiska syror, väteperoxid, och enzymer. Lågt pH till följd av
kolhydratmetabolism kan också hämma vissa mikroorganismer. De antagonistiska faktorerna
är aldrig så omfattande att de helt utkonkurrerar en bakterieart, eftersom de lever i en
komplex biofilm. Antagonistiska interaktioner hindrar även exogena arter från att kolonisera.
(5).
Glukos, maltos, sackaros
O2
O2
Lactobacillus Capnocytophaga
Streptococcus
butyrat
O
2
laktat
CO2
Fusobacterium
Aminosyror
acetat
CO2
Veillonella
H2O2
succinat
acetat
laktat
Actinomyces
katalas
Glukos
Figur 2. Illustration av möjliga interaktioner mellan bakteriearter. Rosa pil indikerar näringsämnen. Blå pil indikerar resultat
från metabolism. Grå pil indikerar synergistisk interaktion där streptokocker använder syre, vilket gör miljön anaerob för
exempelvis F. nucleatum.
pH i dentala biofilmer
Många organismer kräver ett neutralt pH för att växa, och är känsliga för större skiftningar.
Saliven påverkar munnens pH, och medelvärdet för ostimulerad helsaliv ligger mellan 6.25
och 7.25 (7). Vid förtäring bidrar många sackarolytiska bakterier till ett lågt pH till följd av
sockermetabolismen, men få arter överlever vid sådana förhållanden under längre tid.
Utmärkande för kariogena bakterier som till exempel mutansstreptokocker och laktobaciller,
är deras förmåga att kunna leva i låga pH-värden, genom att bibehålla en intracellulär pHhomeostas. Det finns även bakterier som har förmågan att höja intracellulärt pH genom
produktion av basiska ämnen. Det finns tidigare studier om bakterier och pH-förändringar (8,
9). I en av dem studerades ett konsortium bestående av nio olika bakterier i kemostater,
avseende pH-sänkning till följd av glukostillsats, för att se om och när en skiftning i
mikrofloran inträffade (9). Bakterierna i denna studie var S. mutans, S. oralis, S. gordonii,
Lactobacillus rhamnosus, Actinomyces naeslundii, Neisseria subflava, Veillonella dispar,
Prevotella nigrescens and F. nucleatum. Resultatet man fick då var att mängden syratoleranta
bakterier, S. mutans och L. rhamnosus, ökade i takt med pH-sänkningen, samtidigt som de
8
mindre syratoleranta arterna (F. nucleatum, P. nigrescens, S. gordonii, och S. oralis)
minskade i antal. Resultaten tydde på att en sänkning till pH 4.5–5.5 möjligen kunde förbättra
chanserna för potentiellt patogena arter, medan de som förknippas med hälsa förblev relativt
opåverkade. När pH sjönk till under 4.5, fick de förmodade patogenerna troligtvis ökad
konkurrenskraft, medan tillväxt och metabolism hämmades hos arterna som förknippas med
hälsa. Även pH-sänkningens hastighet verkar ha varit av vikt, då en snabb pH-sänkning gav
en mer radikal skiftning i mikrofloran än när pH-sänkningen fick ske långsamt. Till skillnad
från den här studien kommer försöken inte att utföras i kemostater. Dessutom studeras ett
annat konsortium i tre olika medium, med eller utan tillsats av glukos, och med varierande
initiala pH-värden.
Motivering av försöksmodell och val av bakterier
Det finns tidigare studier som har använt sig av konsortium bestående av flera bakterier (2,
10). I en studie användes plack vilket var tidskrävande, resultaten var svåra att tolka och
försöket var svårt att reproducera. I en annan studie skapades konsortium av nio olika
bakteriearter, där varje bakterieart odlats separat och sedan inkuberats tillsammans i miljöer
med och utan glukosöverskott vid pH 7. Fördelar med detta var att relevanta och
lättidentifierade bakteriestammar kunde väljas, och att sammansättningen kunde formas
beroende på försök. Dessutom kunde detta konsortium lagras och användas igen, vilket
gjorde försöken reproducerbara. Metoden har använts vid upprepade tillfällen.
I denna studie har ett konsortium använts vars bakteriesammansättning kan ses i Tabell 1
samt illustreras i Figur 3. Dessutom har en annan försöksmodell valts, där bakterierna odlas i
en biofilm och inte planktoniskt. Biofilmen ska efterlikna ett artificiellt plack in vitro.
Bakterierna undersöks i en multibakteriell miljö istället för renkulturer, vilket blir mer
verklighetstroget och ger chans till samverkan mellan flera bakteriearter i enighet med den
ekologiska plackhypotesen. Urvalet av bakterier är tänkt att spegla en frisk munflora med en
bred mikrobiell variation avseende beteende, miljöpreferenser och förekomst (2). Ett annat
kriterium var att de skulle vara lätta att urskilja för att förenkla artbestämning. Bakterierna
som användes var dessutom lättillgängliga då de togs från fakultetens biobank. Vilka
bakterier som inkluderats framgår i Tabell 1.
Tabell 1. Bakteriearter som ingår i studien.
Gram-positiva kocker
• Streptococcus mutans
• Streptococcus intermedius
• Streptococcus oralis
• Streptococcus gordonii
Gram-negativa kocker
• Veillonella parvula/dispar
Gram-positiva stavar
• Actinomyces odontolyticus
• Lactobacillus paracasei
Gram-negativa stavar
• Capnocytophaga gingivalis
• Fusobacterium nucleatum
9
Bakteriestam
Streptococcus spp.
Actinomyces odontolyticus
Capnocytophaga spp.
Lactobacillus
Fusobacterium
Figur 3. En mikroskopisk bild av det konsortium som användes i denna studie. (Oral biologi, Malmö Högskola)
Streptococcus mutans, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis och Streptococcus
gordonii.
Streptokocker är gram-positiva kocker som ofta förekommer i munfloran (11). De kan
särskiljas från varandra, och det finns mycket skrivet om arterna. De är därför fördelaktiga att
inkludera i laborativa försök. Interaktionerna hos orala streptokocker är mångfacetterade, och
sker inom samma art, mellan olika arter, samt med värden. Många interaktioner är
fortfarande okända (12). Streptokocker är indelade i fyra undergrupper: mutans, salivarius,
anginosus, mitis.
Bakterier i mutansgruppen kan vara opportunistiska
patogener och intresset för dem är stort på grund av deras
roll i kariesutveckling. Gruppen förekommer ofta i dentalt
plack vid karieslesioner, och mer sällan på frisk emalj.
Mutansstreptokocker hittar effektivt socker från kosten
och kan snabbt konvertera det till organiska syror, främst
laktat som förknippas med kariesutveckling. De kan även
växa och överleva under de sura förhållanden som skapas,
genom att bibehålla ett intracellullärt pH på 7.5.
Utvecklingen av syratolerans kan eventuellt vara beroende
av adhesion till en yta (13). Mutansstreptokocker bidrar
till plackmognad genom produktion av lösliga och
olösliga extracellulära polysackarider som glukan, mutan Figur 4. Fotografi på koloni av S. mutans
och fruktan från sackaros. Gruppen kan även syntetisera odlad på blodagar.
intracellulära polysackarider när det finns överskott på
socker, vilket kan användas som kolhydratsreserv och konverteras till syror när det råder
underskott på socker. S. mutans är den vanligaste ur gruppen vid utveckling av karies. Trots
sin ringa utsträckning i normalfloran är S. mutans välstuderad och därmed intressant ur just
kariessynpunkt, vilket gör den lämplig i dessa försök. S. mutans och S. gordonii kan ha
antagonistisk effekt genom att hämma tillväxten hos varandra (12, 14). Till exempel kan S.
gordonii inaktivera en peptid hos S. mutans, vilket gör S. mutans mindre resistens mot
antimikrobiella substanser i saliven, och minskar S. mutans produktion av bakteriociner. I
Figur 4 ses ett fotografi av S. mutans på blodagar.
Salivariusgruppen hittas främst på slemhinnor och var därför inte lämpliga i denna studie,
som har fokus på supragingivala biofilmer.
10
Anginosusgruppen isoleras ofta från dentalt plack och slemhinneytor. Gruppen innefattar
bland annat Streptococcus intermedius som är en del av normalfloran i munhålan (15). S.
intermedius är sackarolytisk och producerar stora mängder laktat från bland annat glukos
(16). Det är däremot ingen i anginosusgruppen som
producerar extracellulära polysackarider av sackaros (11).
Sura förhållanden kan eventuellt gynna dess
biofilmsbildning (17). S. intermedius producerar även
enzymer (sialidas och hyaluronidas) som förstör värdens
vävnad och konverterar den troligen till näringsämnen
som kan användas till bakteriell tillväxt (18).
I mitisgruppen ingår bland annat S. oralis och S. gordonii.
En av de vanligaste bakterierna i mitisgruppen är S.
oralis. De bildar syror från bland annat glukos, fruktos,
galaktos, laktos och maltos. De producerar även
neuraminidas, ett enzym som avlägsnar sialinsyra från Figur 5. Fotografi på koloni av S. oralis
oligosackaridens sidokedja på mucin i saliven. Vissa odlad på blodagar.
bakteriestammar från S. oralis kan producera extracellulärt glukan från sackaros. S. oralis
kan bilda IgA-proteas och väteperoxid (19). I Figur 5 ses ett fotografi av S. oralis på
blodagar.
S. gordonii förekommer inte i så stor utsträckning, men är intressanta att studera då de är
primära kolonisatörer. De bildar syror från bland annat glukos, fruktos, galaktos, laktos och
maltos. De kan bilda lösliga och olösliga glukaner från sackaros, vilket bidrar till
plackbildning. För att möjliggöra nedbrytning av stärkelse binder S. gordonii till alfa-amylas
i saliven. Bindningen till amylas kan även dölja bakteriella antigener vilket gör att
organismen kan undvika värdförsvaret. Kolonisering av S. gordonii anses vara förmånligt för
värden då de bidrar till pH-homeostas (20). Genom att bryta ner arginin från saliven och
kosten, och producera bland annat ammoniak, koldioxid, och ATP, ökar syratoleransen
eftersom det neutraliserar cytoplasman och omgivande miljö. S. gordonii anses dock bara
vara en svagt syratolerant bakterie i jämförelse med S. mutans.
Lactobacillus paracasei
Laktobaciller karakteriseras av laktatproduktion som den
enda
eller
främsta
slutprodukten
från
kolhydratsmetabolism (21). De är fakultativt anaeroba
och återfinns ofta i munhålan, speciellt i plack och på
tungan, men utgör endast en liten del av den totala
odlingsbara mikrofloran. Lactobacillus paracasei är en av
de mest förekommande arterna i släktet. Laktobaciller är
acidogena och förknippas med karieslesioner som når
dentinet. Antalet laktobaciller i munnen motsvarar
individens kolhydratintag (11). Man vet inte mycket om
vilken miljö laktobaciller gynnas av, förutom att de klarar
av att påbörja kolonisation i låga pH-värden och är de
mest syratoleranta bakterierna i dentalt plack (22). Av den
här anledningen är de intressanta att använda i försöken. I
Figur 6 ses ett fotografi av L. paracasei på blodagar.
Figur 6. Fotografi på koloni av L. paracasei
odlad på blodagar.
11
Actinomyces odontolyticus
Actinomyces spp. är gram-positiva, anaeroba eller fakultativt anaeroba stavar som utgör en
stor del av mikrofloran i dentalt plack, speciellt approximalt och i tandköttsfickor (23). De
finns vid tidig plackbildning och koaggregrar initialt med
varandra, men därefter även med streptokocker (5).
Actinomyces spp. är acidogena (24) och fermenterar
glukos vilket ger slutprodukter som succinat, acetat och
laktat. Actinomyces spp. är inte lika syratoleranta som S.
mutans och laktobaciller (7), men de förknippas ändå med
rotytekaries. De ökar även i antal vid gingivit. Den
vanligaste arten i dentalt plack är A. naeslundii (11). A.
naeslundii och Actinomyces odontolyticus är tidiga
kolonisatörer i munnen hos barn. A. odontolyticus bildar i
50 procent av fallen kolonier med karakteristiska rödbruna pigment vid odling på blodagar, vilket gör dem
lättidentifierade och fördelaktiga att ha med i försöken. I
Figur 7. Fotografi på koloni av A.
Figur 7 ses ett fotografi av A. odontolyticus på blodagar. odontolyticus odlad på blodagar.
A. odontolyticus valdes därför istället för den mer
vanligare arten A. naeslundii. A. odontolyticus är en viktig medlem i den supra- och
subgingivala biofilmen, och förknippas med tidiga stadier av emaljdemineralisering och
progression av små karieslesioner (11, 25). A. odontolyticus har förmågan att adherera till
ytor och koaggregera med andra orala bakterier. De är liksom fusobakterier sekundära
kolonisatörer som kan binda samman tidiga och sena eventuellt mer patogena kolonisatörer.
Veillonella parvula och Veillonella dispar
Det finns 11 arter inom gruppen Veillonella, där Veillonella parvula och V. dispar är de mest
dominanta (26, 27). Veillonella är obligat anaeroba, gram-negativa kocker som ofta finns på
tunga, buckal mukosa och i dentalt plack som en del av normalfloran (26). Veillonella verkar
dock ha begränsad förmåga att fästa till värdens vävnad. De fäster svagt till salivtäckt
hydroxylapatit, och endast en liten mängd hittas på tandytor en timme efter rengöring. De har
däremot visat sig koaggregera med många orala bakterier, som Streptococcus salivarius, S.
mutans och Actinomyces viscosus. V. parvula utgör större delen av Veillonella-floran i
subgingivalt plack, där de koaggregerar med subgingivala bakterier som Streptococcus
sanguinis och A. naeslundii. V. dispar förekommer också i det subgingivala placket, men är
mer dominant på ställen utanför, och koaggregerar med bakterier exempelvis på tungan.
Veillonella kan inte metabolisera kolhydrater. De konsumerar istället laktat, gruvat, malat,
fumarat, och/eller oxalacetat (26, 28). Slutprodukter från metaboliseringen blir acetat,
propionat, koldioxid, och väte som källa till energi. Deras restprodukter kan ge näring till
bakterier som Porphyromonas och Prevotella. Genom att använda laktat från
kolhydratfermenterande laktobaciller, S. mutans, Actinomyces spp., kan Veillonella minska
laktatkoncentrationen genom att omvandla dessa till svagare syror. Detta kan i sin tur påverka
kariesprocessen, eftersom de svagare syrorna inte kan bryta ner emaljen (27). I försöken
inkluderas V. parvula/dispar, de två vanligaste arterna i gruppen som tillhör normalfloran och
har en känd samverkan med bland annat streptokocker och laktobaciller. Den stam av
Veillonella som används kan inte särskiljas med 16S sekvensering mellan de båda arterna V.
parvula och V. dispar. För att särskilja dem krävs ytterligare sekvensering, därför benämns
de i försöken som V. parvula/dispar.
12
Capnocytophaga gingivalis
Capnocytofager är gram-negativa fakultativt anaeroba
stavar som är en liten del av normalfloran och kan hittas i
subgingivalt plack, men ökar i antal vid gingivit (29, 30).
De är opportunistiska patogener och har isolerats från
flera infektioner hos immunnedsatta patienter. De bildar
enzymer som kan ha virulenta egenskaper genom att
direkt bryta ner parodontal vävnad, men även indirekt
genom att bidra till produktion av bradykinin som har
inflammatorisk potential (29). Vissa stammar producerar
IgA1-proteas som kan inaktivera immunrespons från
mukosan (11). De kräver koldioxid för tillväxt och
fermenterar glukos, maltos, sackaros, och mannos (29),
med acetat och succinat som sura slutprodukter (31, 32). I Figur 8. Fotografi på koloni av C.
gingivalis odlad på blodagar.
försöken används Capnocytophaga gingivalis då det var
den enda arten ur capnocytophaga som fanns sekvenserad på laboratoriet vid
laborationstillfället. I Figur 8 ses ett fotografi av C. gingivalis på blodagar.
Fusobacterium nucleatum
Fusobakterier är gram-negativa, obligat anaeroba stavar och finns ofta i friska
tandköttsfickor. De har inte glukos som främsta energikälla, men kan vid brist på aminosyror
ta upp kolhydrater för syntes av makromolekyler intracellulärt (33-35). Små mängder av det
intracellulära sockret kan utsöndras då det är brist på socker i omgivningen, vilket gynnar
andra bakterier (36). Fusobakterier får sin huvudsakliga energi genom att bryta ner aspartat,
glutamat, histidin och lysin som fås i form av fria
aminosyror eller peptider som innehåller dessa. Största
restprodukten från metabolismen är butyrat. F. nucleatum
är den vanligaste arten i gruppen. F. nucleatum kan bryta
ut svavel från cystein och metionin och producerar då
ammoniak, butyrat, vätesulfid och metylmerkaptan, vilket
ger upphov till lukter som förknippas med halitosis (11).
Fusobakterier kan aggregera med de flesta andra
bakterier, och tros därför vara viktig som förbindelse
mellan tidiga och senare kolonisatörer vid plackbildning.
Fusobakterier har även förmågan att producera
vävnadsirritanter (37-40) och kan leva synergistiskt med
andra bakterier i olika infektioner (41). Dessa egenskaper
9. Fotografi på koloni av F.
och att fusobakterier finns i stort antal i tandköttsfickor, Figur
nucleatum odlad på blodagar.
gör att de kan ha en patogen potential (37, 38, 42). I
tandköttsfickor kan F. nucleatum få peptider från Porphyromonas gingivalis hydrolytiska
aktivitet (43). I Figur 9 ses ett fotografi av F. nucleatum på blodagar.
Syfte
Se hur ett konsortium bestående av nio olika orala bakteriearter påverkas in vitro i olika pH
samt vid närvaro/frånvaro av glukos, avseende samverkan och succession.
Frågeställningar
•
•
Hur påverkas bakteriesammansättningen, det vill säga sker det någon succession, vid
pH 5.5, pH 7.2 och pH 7.2 med glukos?
Kan placksammansättningen manipuleras så den förknippas med oral hälsa?
13
Hypoteser
Succession vid lågt pH
Ju lägre pH desto mer dominanta kommer S. mutans och L. paracasei att vara, dels för att
deras aktivitet fungerar optimalt i en sur miljö, och dels för att de kan börja kolonisera trots
det låga pH-värdet (24). Tack vare kolonisering av syratoleranta bakterier, kommer
bakteriesuspensionens pH att sjunka ytterligare. Övriga bakterier kommer att finnas i mindre
mängd, men då vara inaktiva och inte öka i antal efter 24 timmar.
Succession vid låg glukostillgång
De tidiga fakultativt anaeroba kolonisatörerna S. oralis, S. intermedius och S. gordonii
kommer att vara de dominerande både initialt och efter 48 timmar. De reducerar
syremängden då det används vid metabolism av kolhydrater, vilket gör att även de anaeroba
bakterierna överlever trots aerob miljö. Syran som bildas vid fermenteringen sänker även pHvärdet. Den anaeroba och något surare miljön som utvecklas, ger mer gynnsamma
tillväxtförhållanden för S. mutans och L. paracasei. Tillgången på kolhydrater och
möjligheterna att sänka pH ytterligare är dock för små för att dessa bakterier ska kunna
dominera. F. nucleatum och V. parvula/dispar är anaeroba och trivs bäst i basisk miljö. De
har även stor koaggregationsförmåga med andra bakterier och kan genom samverkan fylla
sina behov. Till exempel metaboliserar V. parvula laktat (44). Dessa förutsättningar gör att de
förekommer vid start, men i mindre mängd senare på grund av pH-sänkningen. Samverkan
mellan de sackarolytiska och proteolytiska bakterierna kommer att ge en viss balans som gör
att pH inte sjunker drastiskt.
Succession vid hög glukostillgång
Då glukos tillsätts får de sackarolytiska bakterierna näring, vilket leder till ökad metabolism
och en mer anaerob miljö som följd. S. mutans och L. paracasei har egenskaper som gör att
deras aktivitet kan fortsätta trots hög glukosnivå (24), vilket gör att de kan dominera till
skillnad från övriga sackarolytiska bakterier. Deras glukosmetabolism kommer att leda till
syrabildning och pH-sänkning som blir större än i föregående medium. pH-sänkningen
kommer att gynna de syratoleranta arterna S. mutans och L. paracasei som har optimal
aktivitet vid lågt pH (24). Till följd av deras aktivitet kommer ytterligare pH-sänkning att ske,
och försämra tillväxtmöjligheter för de bakterier som inte trivs i lågt pH. C. gingivalis, F.
nucleatum och V. parvula/dispar, kommer under de första 24 timmarna inte kunnat växa lika
mycket som resterande bakterier, då de trivs bäst i anaerob miljö.
Material och metod
Beredning av medium
För att skildra olika tillstånd i munnen valdes medium med olika pH-värden. Två av tre
medium gavs ett neutralt pH på 7.2. För att spegla pH-förändring vid förtäring tillsattes
glukos till ett av de två medium med neutralt pH som utgångsläge. Det tredje mediumet fick
pH 5.5 för att återge miljön när pH sjunkit till emaljens kritiska pH-värde (45), eftersom det
är intressant att studera hur bakterierna samverkar i denna miljö.
Medium med pH 5.5
15 g Todd Hewitt odlingsmedium (Becton Dickinson, Sparks, MD 21152 USA) löstes i 500
ml dH2O och steriliserades i 15 minuter i 121°C. Därefter späddes det till 25 % med steril
PBS pH 5.5. pH justerades vid behov med 10 % HCl och sterilfiltrerades med 0,2 µm filter.
14
Medium med pH 7.2
15 g Todd Hewitt odlingsmedium löstes i 500 ml dH2O och steriliserades i 15 minuter i
121°C. Därefter späddes det till 25 % med steril PBS pH 7.2. pH justerades vid behov med
10 % HCl och sterilfiltrerades.
Medium med pH 7.2 med tillsats av glukos
Stocklösning 200 mM glukos sterilfiltrerades (0,2 µm filter), och späddes till 10 mM i 25 %
Todd Hewitt med pH 7.2 precis innan inokulering av mediumet.
Beredning av bakteriellt konsortium med flera arter
Nio bakteriearter från avdelning Oral biologi, Malmö högskola, användes i försöken: S.
mutans (B4B), S. intermedius (31B:D), S. oralis (89C), S. gordonii (JD13A), V.
parvula/dispar (10BB), L. paracasei (B4I), C. gingivalis (BK:F), F. nucleatum (BK:O), A.
odontolyticus (G3H). Stammarna var färska isolat från friska personer. Artbestämning av
dessa utfördes genom sekvensering av 16S rRNA på Klinisk mikrobiologi, Labmedicin
Skåne i Lund. 1µl av varje bakterieart inokulerades med hjälp av en inokuleringsloop till
varje medium. Bakteriesuspensionerna skakades under 30-60 sekunder i ett 15 ml rör.
Inkubation
Bakteriesuspensionen överfördes till 12-Well Tissue Culture Plates (VWR International,
Fagerstagatan 18A, 163 94 Stockholm, Sverige), 2 ml/brunn, och två brunnar per medium.
Från varje bakteriekultur överfördes 100 µl i duplikat till tre Nunc™ MicroWell™ 96-Well
Microplates (VWR International, Fagerstagatan 18A, 163 94 Stockholm, Sverige), en platta
för varje tidpunkt. Som kontroll användes medium utan bakterier. Plattorna med 12
respektive 96 brunnar inkuberades i 0, 24 och 48 timmar i 5 % CO vid 37 °C. För att
förhindra avdunstning placerades plattorna i en fuktkammare. Varje försök gjordes minst i
duplikat, två gånger oberoende av varandra. En illustration av arbetsgången ges i Figur 10a-b.
2
Figur 10a. Arbetsgång för inkubation i försök A.
15
Figur 10b. Arbetsgång för inkubation i försök B.
Bakteriell sammansättning av konsortium
200 µl av varje bakteriekultur späddes ut efter 0, 24 och 48 timmar i 1800 µl prereducerat
dilution blank, en buffrande salt- och minerallösning med reduktionsmedel (L-cystein) för att
bibehålla viabiliteten av framförallt anaeroba bakterier. I försök A späddes provet 106 gånger.
Från bakteriekulturer spädda 105 och 106 sattes 200 µl ut på blodagar och inkuberades
anaerobt under 7 dagar i 37 °C. Vid 24 och 48 timmar avlägsnades biofilmen i brunnarna
med en cellskrapa och suspenderades i mediumet innan efterföljande utspädningar. I försök B
späddes varje bakteriekultur 105 gånger. Bakteriekultur 103, 104 samt 105 sattes sedan ut på
blodagar. En illustration av arbetsgången ges i Figur 11.
Figur 11. Arbetsgång för odling.
Efter 7 dagars växt på blodagar, artbestämdes bakteriekolonierna med hjälp av gramfärgning, morfologi och flertalet biokemiska test. Gram-positiva, katalas-negativa kocker i
16
kedjor antogs vara streptokocker och identifierades ner på subspecies-nivå med biokemiska
test (19). Gram-negativa kocker identifierades som Veillonella baserat på morfologi samt
anaerob växt stimulerad av laktat, ej av glukos. Gram-negativa långa smala stavar särskildes
mellan Capnocytophaga och Fusobacterium genom morfologi, lukt samt förmåga att växa
aerobt. Actinomyces och Lactobacillus, som båda är gram-positiva stavar, identifierades
genom morfologi, gramfärgning samt biokemiska test (46-48).
pH-mätning
pH mättes i 96-brunnsplattorna vid start, 24, och 48 timmar, med hjälp av en pH-meter. En
illustration av arbetsgången ges i Figur 12.
Figur 12. Arbetsgång för pH-mätning.
Resultat
Förändring i bakteriesammansättning över tid
Redovisning av resultat fokuserar på förhållanden efter 24 timmar. Vid 48 timmar hade
merparten bakterier dött eller minskat avsevärt i antal till följd av kontinuerlig celldelning, en
situation som inte hade uppstått i en verklig oral miljö. Förhållanden efter 48 timmar är
därför inte relevanta att analysera vidare. Resultaten tolkas utifrån två kategorier; bakterier
som överlevt och bakterier som haft en tillväxt efter 24 timmar jämfört med start.
Bakterieöverlevnad definieras som en skillnad understigande en tiopotens eller att bakterien
minskat i antal men finns kvar över detektionsnivå. Bakterietillväxt definieras som en ökning
av minst en tiopotens.
Försök A
Försök A:1 och A:2 gav varierande resultat vid undersökning av bakteriesammansättningen
vid start och 24 timmar. Odling av bakteriekulturerna vid start visade en blandad
sammansättning av de nio tillsatta bakterierna i alla tre bakteriekulturer.
Försök B
Försök B:1, B:2 och B:3 visade alla en dominans av L. paracasei och en variation på
resterande bakterier. Vid odling av bakteriekulturerna vid start var L. paracasei mest
förekommande, följt av S. gordonii. I Figur 13, 15 och 17 presenteras medelvärden av
bakteriesammansättningen i varje bakteriekultur i försök A:1 och A:2 respektive B:1, B:2 och
B:3. För exakta siffror samt fotografier av blodagar se Bilaga 1 respektive 2.
Bakteriekultur vid pH 5.5
Vid start i försök A var spridningen av bakterietalen stor, där C. gingivalis förekom i störst
antal cfu (9.5 x 106). Därefter förekom bakterier i fallande ordning; F. nucleatum, L.
paracasei, A. odontolyticus, S. oralis, S. gordonii, V. dispar/parvula (2.5 x 105). Ingen S.
17
mutans förekom över detektionsnivå > 5x103 cfu/ml. Vid 24 timmar var spridningen mindre,
med dominans av L. paracasei (3.2 x 107), följd av S. oralis (1.1 x 107), och enstaka kolonier
av A. odontolyticus (2.0 x 106) och S. gordonii (1.0 x 106). Sammanfattningsvis överlevde A.
odontolyticus, och S. gordonii efter 24 timmar, medan S. oralis och L. paracasei dessutom
hade ökad tillväxt. Vid start i försök B förekom L. paracasei i störst antal (6.2 x 107), följd av
enstaka kolonier S. gordonii, V. dispar/parvula, S. mutans, A. odontolyticus, S. intermedius
och F. nucleatum (1.5 x 105). S. oralis och C. gingivalis förekom ej över detektionsnivå >
5x103 cfu/ml. Vid 24 timmar var L. paracasei fortsatt dominant (6.8 x 107), och endast en
koloni A. odontolyticus (2.5 x 105) förekom. Sammanfattningsvis överlevde L. paracasei och
A. odontolyticus efter 24 timmar. L. paracasei dominerade stort i både försök A och B vid pH
5.5. Se Figur 13-14.
Bakteriekultur vid pH 7.2
Vid start i försök A dominerade S. mutans (1.8 x 107), följd av F. nucleatum, C. gingivalis, L.
paracasei, S. intermedius, S. oralis, S. gordonii och V. dispar/parvula (1.3 x 106). A.
odontolyticus förekom inte över detektionsnivå > 5 x 103 cfu/ml. Vid 24 timmar dominerade
S. oralis (2.8 x 107), följd av L. paracasei (6.0 x 106). Sammanfattningsvis överlevde L.
paracasei efter 24 timmar, medan S. oralis hade en ökad tillväxt. Vid start i försök B
dominerade L. paracasei stort (5.7 x 107), följd av S. gordonii och ett fåtal kolonier av V.
dispar/parvula, A. odontolyticus, S. intermedius, S. mutans, och F. nucleatum (1.5 x 105).
Ingen S. oralis eller C. gingivalis förekom över detektionsnivå > 5 x 103 cfu/ml. Vid 24
timmar dominerade L. paracasei (1.9 x 107), och enstaka kolonier av S. oralis (2.8 x 105) och
S. gordonii (6.7 x 104) fanns. Sammanfattningsvis överlevde S. gordonii och L. paracasei,
medan S. oralis hade en ökad tillväxt. Sammantaget för både försök A och B överlevde L.
paracasei, och S. oralis ökade i tillväxt. Se Figur 15-16.
Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
Vid start i försök A var samtliga bakterier representerade. Vid 24 timmar förekom L.
paracasei i störst antal (1.2 x 107) följd av S. gordonii (5.8 x 106), S. oralis (1.0 x 106) och S.
intermedius (7.5 x 105). Sammanfattningsvis överlevde S. gordonii, S. oralis och S.
intermedius efter 24 timmar medan L. paracasei hade en ökad tillväxt. Vid start i försök B
förekom L. paracasei i störst antal (4.2 x 107), följd av S. gordonii (4.0 x 106) och enstaka
kolonier A. odontolyticus, V. dispar/parvula, S. mutans och S. intermedius (5.0 x 104). Vid 24
timmar var L. paracasei fortsatt dominant (5.7 x 107), följd av S. gordonii (3.0 x 106), S.
oralis (1.2 x 106) och A. odontolyticus (1.0 x 106). A. odontolyticus, S. gordonii och S. oralis
överlevde efter 24 timmar, medan L. paracasei hade en ökad tillväxt. Sammantaget för både
försök A och B överlevde S. gordonii och S. oralis, medan L. paracasei ökade i tillväxt. Se
Figur 17-18.
18
pH 5.5 - Försök B:1, B:2 och B:3
pH 5.5 - Försök A:1 och A:2
100
100
90
3.2x107
80
70
70
60
60
Procent
Procent
80
50
40
30
9.5x106
50
40
30
4.0x106
20
10
6.8x107
7
90 6.2x10
1.1x10
7
20
10
1.0x106
4.3x106
<5x103
0
0
0h
24h
0h
24h
Figur 13. Fördelning av bakterier angivet i procent från försök A respektive B (medelvärde), i bakteriekultur vid pH 5.5.
Siffror angivna vid punkterna motsvarar det reella antalet bakterier.
A. odontolyticus
L. paracasei
F. nucleatum
L. paracasei
S. oralis
A. odontolyticus
Figur 14. Fotografi på blodagar efter odling (0 respektive 24 timmar) i bakteriekultur vid pH 5.5, i försök A.
19
pH 7.2 - Försök B:1, B:2 och B:3
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
50
40
2.8x107
1.9x107
5.7x107
50
40
1.8x107
30
20
Procent
Procent
pH 7.2 - Försök A:1 och A:2
30
2.3x10
6
20
6.0x106
10
10
0
0
5.2x106
2.8x105
Figur 15. Fördelning av bakterier angivet i procent från försök A respektive B (medelvärde), i bakteriekultur vid pH 7.2.
Siffror angivna vid punkterna motsvarar det reella antalet bakterier.
S. oralis
L. paracasei
S. mutans
S. oralis
L. paracasei
Figur 16. Fotografi på blodagar efter odling (0 respektive 24 timmar) i bakteriekultur vid pH 7.2, i försök A.
20
pH 7.2 + glukos - Försök A:1 och
A:2
pH 7.2 + glukos - Försök B:1, B:
2 och B:3
100
100
90
90
80
80
70
60
Procent
Procent
5.7x107
70
1.2x107
60
50
40
5.8x106
30
20
4.2x107
50
40
30
6.3x106
20
1.0x106
10
4.0x10
6
10
1.2x106
0
0h
24h
3.0x106
0
Figur 17. Fördelning av bakterier angivet i procent från försök A respektive B (medelvärde), i bakteriekultur vid pH 7.2 med
tillsats av glukos. Siffror angivna vid punkterna motsvarar det reella antalet bakterier.
L. paracasei
S. oralis
L. paracasei
F. nucleatum
A. odontolyticus
Figur 18. Fotografi på blodagar efter odling (0 respektive 24 timmar) i bakteriekultur vid pH 7.2 och tillsats av glukos, i
försök A.
21
Förändringar av pH över tid
Följande diagram visar medelvärden av försök A för respektive bakteriekultur. Resultat för
försök A återspeglade sig i försök B. Vid mätning av pH efter 0, 24 och 48 timmar kunde en
sänkning av pH ses i alla tre bakteriekulturer, där största sänkningen sågs i bakteriekulturen
vid pH 7.2 med glukostillsats, följt av bakteriekulturen vid pH 5.5 och sist bakteriekulturen
vid pH 7.2. Störst sänkning av pH ägde rum inom 24 timmar i samtliga bakteriekulturer. pH i
kontrollerna hade också sänkts något. Resultaten redovisas i Figur 19. För exakta värden se
Bilaga 2.
pH
pH 5.5
pH 7.2
pH 7.2 + glukos
8
8
8
7,5
7,5
7,5
7
7
7
6,5
6,5
6,5
6
6
6
5,5
5,5
5,5
5
5
5
4,5
4,5
4,5
4
4
4
3,5
3,5
3,5
3
3
0h
24 h
48 h
3
0h
24 h
48 h
Tid
Tid
Kontroll
0h
24 h
48 h
Tid
Bakteriekultur
Figur 19. pH-förändringar i respektive bakteriekultur (+/- 1 S.D).
Diskussion
I studien har biologiskt material använts, det vill säga något levande som inte har ett konstant
tillstånd, vilket kan begränsa reproducerbarheten. Användning av bakteriekonsortium är en
standardiserad metod, men kräver rätt förutsättningar för att bli reproducerbar, exempelvis är
det fördelaktigt om samma personer utför försöken. Dessutom gör ett definierat konsortium
att försöken blir mer reproducerbara än om naturligt dentalt plack hade använts. Fördelen då
är att samma bakterierarter kan användas och att man kan kontrollera att de finns med i varje
försök. I denna studie utfördes dock försök A och B med en tids mellanrum, vilket kan ha
gjort att bakteriernas skick skiftat. I försök B observerades en påtaglig dominans av L.
paracasei, jämfört med i försök A, trots nära på identiskt utförande. Vad detta beror på kan
enbart hypotetiseras om, men möjligtvis fick de övriga bakterierna minskad motståndskraft
med tiden, alternativt har L. paracasei fått ökad motståndskraft. Något som emellertid
upptäcktes var liknande tendenser inom försöken, vilket tyder på en viss reproducerbarhet
inom samma försökstillfälle.
22
pH
Vid mätning av pH sågs en sänkning i samtliga bakteriekulturer, i synnerhet inom de första
24 timmarna. Störst procentuell pH-sänkning sågs i bakteriekulturen vid pH 7.2 med tillsats
av glukos. Minst procentuell pH-sänkning sågs i bakteriekulturen vid pH 7.2 utan tillsats av
glukos. Dessa resultat stämmer i stort sett överens med hypoteserna och tillgänglig faktabas
om sackarolytiska bakteriers egenskaper. pH sjönk aldrig under 4.0, möjligtvis eftersom L.
paracasei slutat att bilda syror och därmed bibehållit denna nivå. Skälet till att pH-värdet inte
sjönk avsevärt efter 24 timmar i någon av bakteriekulturerna kan bero på att alla de
sackarolytiska bakterierna initialt bidrog till en radikal pH-sänkning genom sina metaboliter.
Vidare har inte alla bakterier förutsättningar att överleva i ett lågt pH, vilket kan ha lett till en
mer homogen sammansättning med stor dominans av L. paracasei, som har dokumenterad
hög syratolerans. Denna teori stämmer framför allt för bakteriekulturerna vid pH 5.5 och pH
7.2 med tillsats av glukos, där L. paracasei blev mest framträdande i samband med den stora
pH-sänkningen. pH sjönk även i kontrollsuspensionerna, men sänkningen kan inte ha varit
bakteriellt betingad, då odling på suspensionerna inte visade på kontaminering. Skälet till pHförändringen är sannolikt kopplat till temperaturen under inkubationen. Värme ökar
molekylära rörelser i en lösning vilket ger färre vätebindningar, varpå vätejoner frigörs och
pH sjunker.
Bakteriekultur vid pH 5.5
I hypotesen förväntades dominans av S. mutans och L. paracasei. Detta verifierades delvis då
L. paracasei dominerade i samtliga försök, vilket bekräftar kunskapen om att de är de mest
syratoleranta bakterierna, men det kan även tyda på att stammen som användes var väl
anpassad till de förutsättningar som fanns, och bra på att utnyttja det dextran som fanns i
Todd Hewitt-lösningen. S. mutans framträdde däremot inte i förväntad utsträckning. En
möjlig orsak kan vara att färre S. mutans oavsiktligt tillsatts, i relation till de andra
bakterierna. En annan förklaring kan vara att S. mutans eventuellt är beroende av adhesion till
en yta för att syratolerans ska utvecklas, och tveksamhet råder kring vilka förutsättningar till
adhesion som de har haft i studiens tester. I tester där glasplattor använts finns en adekvat yta
för S. mutans adhesion (49). Ytterligare en förklaring till resultaten kan vara att stammen som
användes hade sämre syratolerans. Eftersom resterande bakteriearter inte anses ha lika stor
syratolerans som S. mutans och L. paracasei förväntades det inte att de skulle överleva efter
24 timmar. Till skillnad från hypotesen fanns små mängder S. oralis, S. gordonii och A.
odontolyticus efter 24 timmar. Anledningen till att svagt syratoleranta S. gordonii
identifierades efter 24 timmar trots pH-sänkningen kan vara bakteriens förmåga att
neutralisera syran lokalt, men även dess antagonistiska effekt mot S. mutans kan ha spelat roll
i att öka chanserna för andra mindre syratoleranta arter. F. nucleatum, C. gingivalis, S.
intermedius och V. dispar/parvula förekom vid start, men inte över detektionsnivå efter 24
timmar, vilket överensstämmer med hypotesen. En förklaring kan vara att de är mindre
syratoleranta än de bakterier som överlevde efter 24 timmar. F. nucleatum fanns troligen
initialt tack vare sin förmåga att koaggregera med olika bakterier, vilket möjliggör
synergistiska interaktioner. Dessutom behövde de inte konkurrera om proteinerna, då de var
de enda proteolytiska bakterierna i bakteriekulturen. Dessa faktorer verkade dock inte vara
tillräckliga för att bakterierna skulle klara pH-sänkningen under längre tid.
Bakteriekultur vid pH 7.2
I hypotesen förväntades S. oralis, S. intermedius och S. gordonii dominera i bakteriekulturen
vid alla tidpunkter, vilket inte kunde bekräftas. Dessa tre bakteriearter fanns i varierande
mängd, men generellt kunde ingen tydlig dominans av dem ses förutom i ett av försöken där
S. oralis var störst i antal. Orsaken till att S. intermedius och S. gordonii inte förekom i större
23
mängd har inte identifierats. En tydlig dominans av L. paracasei kunde ses efter 24 timmar i
övriga försök, och ytterst få kolonier av S. gordonii och S. oralis i förhållande till mängden L.
paracasei. S. oralis var dock den enda bakterien som hade en tillväxt efter 24 timmar.
Bakteriekulturens pH sjönk som mest de första 24 timmarna, men inte lika mycket som
övriga medium vilket stämmer överens med hypotesen. pH-sänkningen och de anaeroba
förhållandena förväntades gynna S. mutans och L. paracasei, men inte så pass mycket att de
skulle ta över helt med tanke på de begränsade mängderna kolhydrater. Det sågs dock ingen
ökning av S. mutans, trots att de förekom vid start. Det kan, som tidigare nämnts, möjligen
bero på att just den stammen var mindre anpassad till förutsättningarna. Även närvaron av S.
gordonii, som har en antagonistisk effekt mot S. mutans, kan ha begränsat S. mutans tillväxt.
Anledningen till att L. paracasei dominerade kan i sin tur återigen bero på att stammen hade
god förmåga att klara av förutsättningarna. I övrigt stämde hypotesen om att F. nucleatum
och V. parvula/dispar kunde förekomma utan att växa i mängd efter 24 timmar, med
motiveringen att V. parvula/dispar kan metabolisera laktat från de sackarolytiska bakteriernas
fermentering, men har svårt att utstå vidare pH-sänkning på grund av sin begränsade
syratolerans.
Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
I hypotesen förväntades att S. mutans och L. paracasei skulle vara dominerande tack vare
förmågan att fermentera kolhydrater vid stor glukostillgång, och möjligheten att överleva i
sjunkande pH. L. paracasei dominerade i försöken efter 24 timmar, medan S. mutans
förekom i varierande mängd vid start och ökade inte efter 24 timmar. I försök A fanns S.
mutans i större mängd än L. paracasei vid start. Trots att antalet S. mutans varit stort vid
start, har det alltså inte ökat chanserna för överlevnad och tillväxt efter 24 timmar. I försök A
kan dominansen av L. paracasei inte förklaras av att de varit fler till en början. Anledningen
till att S. mutans och L. paracasei inte utvecklats likartat över tid, skulle även i detta fall
kunna förklaras av att S. mutans-stammen ej kunnat adaptera sig till förutsättningarna, att de
inte kunnat utveckla syratolerans då adhesion saknades, och/eller närvaron av S. gordonii.
Mängden L. paracasei kan ånyo bero på att en välanpassad stam använts. Vidare fanns även
S. gordonii, A. odontolyticus, S. intermedius, S. oralis och C. gingivalis i större mängd än S.
mutans efter 24 timmar. Med tanke på pH-sänkningen förväntades omvända förhållanden, då
S. mutans har en högre syratolerans. Detta kan möjligtvis vara ytterligare ett tecken på att det
saknas något för att S. mutans ska trivas optimalt. Som väntat inträffade ingen ökning av F.
nucleatum och V. parvula/dispar efter 24 timmar. Däremot återfanns C. gingivalis vid ett
enstaka tillfälle efter 24 timmar, vilket kan ha varit en tillfällighet, då den generella trenden
visar att C. gingivalis inte överlever efter 24 timmar trots varierande mängd vid start.
Det som har kunnat observeras i studien är att samexistens förekom mellan vissa bakteriearter
i de olika bakteriekulturerna. I bakteriekulturer vid lågt pH samexisterade L. paracasei och S.
gordonii, S. oralis eller A. odontolyticus. I bakteriekulturer vid begränsad glukostillgång
förekom samexistens mellan L. paracasei och S. gordonii eller S. oralis. I bakteriekulturer
vid stor glukostillgång förekom även samexistens mellan L. paracasei och S. gordonii, S.
oralis, S. intermedius, A. odontolyticus eller C. gingivalis. Sammanfattningsvis samexisterade
L. paracasei och S. gordonii eller S. oralis oavsett bakteriekultur. Eventuellt förekommer ett
synergistiskt samspel där streptokockerna sänker pH i närmiljön till lactobacillernas fördel.
L. paracasei hade förmåga att överleva eller växa i alla medium, trots varierande mängd vid
start. Detta eventuellt kan bero på att den stam som användes. I försök B skulle det också
kunna förklaras av att fler bakterier tillsatts. Vid ytterligare studier av denna sort kan det varit
klokt att byta ut denna stam för att kunna studera övriga bakterier bättre. S. mutans hade i
24
försöken inte den slagkraft som förväntats. Anledningarna till detta kan vara att L. paracasei
konkurrerade ut S. mutans, att S. mutans inte fick de förutsättningar som behövs i form av
adhesion till adekvat yta, antagonistisk effekt från S. gordonii eller att en mindre
anpassningsbar stam användes till försöken. Initialt misstänktes det att ett fel hade uppstått
vid loopning, men då S. mutans förekom i varierande mängder vid start utan att senare öka,
har loopingmängd inte påverkat avsevärt mycket. Anledningen till övriga bakteriers närvaro
och frånvaro kan bero på synergistiska och antagonistiska effekter inom bakteriekulturen.
Begränsningar
En faktor som kan påverka reproducerbarheten är looping-mängden vid inokulering. Denna
metod innebär att en likvärdig mängd bakterier på ett ungefär kan mätas upp, men i och med
skillnader i bakteriestorlek och ögonmått kan den exakta mängden inte kontrolleras. Om
mängden bakterier blir för stor eller för liten kan det ändra sammansättningen vid start, vilket
i sin tur skulle kunna påverka resultaten. Vid analys av reella antalet bakterier i studien var
dock skillnaden försumbar.
Spädningen spelar roll för resultatet. Användning av en högre spädning kan göra det svårt att
hitta bakterierna, medan en för låg spädning ibland gör det svårt att kvantifiera bakterierna. I
försök A användes spädningsfaktor 105 och 106, och i försök B 103, 104 och 105. Anledningen
till dessa skillnader var att fel spann användes i försök A, något som kan ha gjort att mängden
bakterier vid odling blivit otillräckliga för identifiering.
De anaeroba arterna F. nucleatum och V. parvula/dispar var relativt frånvarande i resultaten,
något som möjligtvis kan förklaras av att brunnarna inte inkuberades i en syrefattig miljö.
Vid inkubation under mer anaeroba förhållanden hade kanske fördelningen av bakterier blivit
annorlunda.
Artbestämningen kan ha drabbats av observatörsvariationer, och eventuella felräkningar kan
ha gjorts. I och med att vissa kolonier växte ihop eller var för små för att identifieras uteslöts
de från resultaten. I ett fåtal fall tilläts de fortsätta växa i inkubation tills artbestämning var
möjlig. Detektionsgräns var > 5 x 103 cfu/ml, vilket betyder att provet fortfarande kan
innehålla bakterier, men att de inte kan detekteras för att de är för få för analysmetoden.
Med facit i hand hade det varit intressant att studera resultaten flera gånger inom de första 24
timmarna, eftersom det var inom detta tidsintervall som störst pH-sänkning skedde.
Möjligtvis hade trenderna i bakterieskiftningen då kunnat studeras mer noggrant. Detta hade
dock gjort hela studien svårare att utföra.
Eftersom försöken utförts in vitro kan det ifrågasättas hur väl de representerar eventuella
händelseförlopp in vivo. Användningen av Todd Hewitt och selektivt utvalda bakterier
motsvarar inte orala förhållanden helt verklighetstroget. Viabiliteten hos biofilmen är inte
heller enbart beroende på interaktioner mellan organismerna, utan också på interaktioner med
värden. Till exempel finns antimikrobiella ämnen i saliven som påverkar bakterier. Vissa
ämnen från orala vätskor kan även inkorporeras i pellikeln och verka som receptorer för
bakterier, vilket vidare påverkar kolonisering och förökning av dem.
Stundtals har det varit svårt att hitta relevanta fakta om inkluderade bakterier i tillgänglig
litteratur. Detta har gjort att resultaten och bakteriernas beteende inte kunnat förklaras till
fullo. Dessutom har omfattningen av studien inneburit en del svårigheter. I efterhand har vi
kommit till insikten att det inkluderats för många bakterier i konsortiumet, något som
25
komplicerat dels utförandet och dels tolkandet av resultat. Detta har gjort det svårt att dra
slutsatser kring kommunikation i det mikrobiologiska samhället.
Signifikans
Trots begränsningar och brister har vi genom studien förstått att interaktioner mellan olika
bakterier kan ge upphov till egenskaper som inte kan ses individuellt. Det är således viktigt
att studera bakterier i samverkan som komplement till studier på renkulturer, för att spegla de
interaktioner som kan ske i verkligheten. Vi har i denna studie sett att vissa bakterier
förekommer i samexistens med andra. Kan vi med hjälp av denna kunskap förutspå
exempelvis kariesutveckling? Är det möjligt att ta bakterieprover på patienter för att bedöma
risken för patologi? Denna studie utökar faktabasen genom större förståelse för hur utvalda
bakterier samverkar i miljöer med olika pH och glukosmängd. På längre sikt ger detta ökad
kunskap om successionen kan manipuleras till en placksammansättning som förknippas med
oral hälsa. Detta skulle kunna bidra till mer evidensbaserad vård, minska lidande för patienter
samt minska kostnader för både samhället och individen.
Konklusion
L. paracasei hade störst förmåga att överleva i alla bakteriekulturer oavsett miljöförändring,
och visade även på högst syratolerans. Det förekom en samexistens mellan L. paracasei och
S. gordonii eller S. oralis oavsett bakteriekultur. Övriga bakterier klarade sig inte lika bra,
däribland S. mutans som inte överlevde i detta konsortium i den utsträckning som förväntats.
Den procentuella pH-sänkningen var störst i bakteriekulturen med initialt pH 7.2 och tillsats
av glukos, och minst i bakteriekulturen med initialt pH 7.2 utan tillsats av glukos. Vidare
studier av flerartiga bakteriekulturer krävs för att få kunskap om hur bakteriell succession kan
manipuleras.
26
Referenser
1. Theilade E. The non-specific theory in microbial etiology of inflammatory periodontal diseases. J
Clin Periodontol. 1986; 13: 905-911.
2. Marsh PD. Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology. 2003; 149:
279-294.
3. Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent
Res. 1994; 8: 263-271.
4. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology. : Edinburgh : Churchill Livingstone Elsevier, 2009; 5. ed;
2009.
5. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 5 - Dental plaque. 2009: 74-102.
6. Kolenbrander PE, Andersen RN, Moore LV. Intrageneric coaggregation among strains of human
oral bacteria: potential role in primary colonization of the tooth surface. Appl Environ Microbiol.
1990; 56: 3890-3894.
7. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 2 - The mouth as a microbial habitat. 2009: 8-23.
8. Corcoran BM, Stanton C, Fitzgerald GF, Ross RP. Survival of probiotic lactobacilli in acidic
environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Appl Environ Microbiol. 2005; 71:
3060-3067.
9. Bradshaw DJ, Marsh PD. Analysis of pH-driven disruption of oral microbial communities in vitro.
Caries Res. 1998; 32: 456-462.
10. McKee AS, McDermid AS, Ellwood DC, Marsh PD. The establishment of reproducible, complex
communities of oral bacteria in the chemostat using defined inocula. J Appl Bacteriol. 1985; 59: 263275.
11. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 3 - The resident oral microflora. 2009: 24-44.
12. Kreth J, Merritt J, Qi F. Bacterial and Host Interactions of Oral Streptococci. DNA Cell Biol.
2009; 28: 397-403.
13. Dahlén G, Fiehn N, Olsen I. Oral microbiology and immunology : The Scandinavian approach.
2012: s 185.
14. Kuramitsu HK, He X, Lux R, Anderson MH, Shi W. Interspecies Interactions within Oral
Microbial Communities. Microbiol Mol Biol Rev. 2007; 71: 653-670.
15. Whiley RA, Freemantle L, Beighton D, Radford JR, Hardie JM, Tillotsen G. Isolation,
Identification and Prevalence of Streptococcus anginosus, S. intermedius and S. constellatus from the
Human Mouth. Microb Ecol Health Dis. 1993; 6: 285-291.
16. Wells CL WT. Anaerobic Cocci. 1996; In: Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition.
Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston: Chapter 19.
27
17. Ahmed NA, Petersen FC, Scheie AA. Biofilm formation and autoinducer-2 signaling in
Streptococcus intermedius: role of thermal and pH factors. Oral Microbiol Immunol. 2008; 23: 492497.
18. Mishra AK, Fournier PE. The role of Streptococcus intermedius in brain abscess. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2013; 32: 477-483.
19. Whiley RA, Beighton D. Current classification of the oral streptococci. Oral Microbiol Immunol.
1998; 13: 195-216.
20. Liu Y, Burne RA. Multiple two-component systems modulate alkali generation in Streptococcus
gordonii in response to environmental stresses. J Bacteriol. 2009; 191: 7353-7362.
21. Sánchez E, Sanz Y. Lactobacillus. Molecular Detection of Human Bacterial Pathogens. 2011:
257-267.
22. Loesche W. Microbiology of Dental Decay and Periodontal Disease. 1996; In: Baron S, editor.
Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at
Galveston: Chapter 99.
23. Paul D, Reddy D, Mukherjee D, Paul B, Paul D. Actinomyces. Molecular Detection of Human
Bacterial Pathogens. 2011: 23-30.
24. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology Chapter 4 - Acquisition, adherence, distribution and
metabolism of the oral microflora. 2009: 45-74.
25. Vielkind P, Jentsch H, Eschrich K, Rodloff AC, Stingu CS. Prevalence of Actinomyces spp. in
patients with chronic periodontitis. Int J Med Microbiol. 2015; 305: 682-688.
26. Hughes CV, Kolenbrander PE, Andersen RN, Moore LV. Coaggregation properties of human oral
Veillonella spp.: relationship to colonization site and oral ecology. Appl Environ Microbiol. 1988; 54:
1957-1963.
27. Liu D. Veillonella. Molecular Detection of Human Bacterial Pathogens. 2011: 447-452.
28. Delwiche EA, Pestka JJ, Tortorello ML. The veillonellae: gram-negative cocci with a unique
physiology. Annu Rev Microbiol. 1985; 39: 175-193.
29. Winn, Washington C., Koneman, Elmer W.,$d 1932-,. Koneman's color atlas and textbook of
diagnostic microbiology. Chapter 9. 2006: 474-475.
30. Zbinden R, von Graevenitz A. Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, Pasteurella,
and Other Fastidious or Rarely Encountered Gram-Negative Rods*. 2011.
31. Leadbetter ER. The Genus Capnocytophaga. 2006: 709-711.
32. Leadbetter ER, Holt SC, Socransky SS. Capnocytophaga: new genus of gram-negative gliding
bacteria. I. General characteristics, taxonomic considerations and significance. Arch Microbiol. 1979;
122: 9-16.
33. Robrish SA, Oliver C, Thompson J. Sugar metabolism by fusobacteria: regulation of transport,
phosphorylation, and polymer formation by Fusobacterium mortiferum ATCC 25557. Infect Immun.
1991; 59: 4547-4554.
28
34. Robrish SA, Thompson J. Regulation of fructose metabolism and polymer synthesis by
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953. J Bacteriol. 1990; 172: 5714-5723.
35. Rogers AH, Zilm PS, Gully NJ, Pfennig AL, Marsh PD. Aspects of the growth and metabolism of
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 in continuous culture. Oral Microbiol Immunol. 1991; 6:
250-255.
36. Kolenbrander PE, London J. Ecological Significance of Coaggregation among Oral Bacteria.
1992: 183-217.
37. Bartold PM, Gully NJ, Zilm PS, Rogers AH. Identification of components in Fusobacterium
nucleatum chemostat-culture supernatants that are potent inhibitors of human gingival fibroblast
proliferation. J Periodontal Res. 1991; 26: 314-322.
38. Claesson R, Edlund MB, Persson S, Carlsson J. Production of volatile sulfur compounds by
various Fusobacterium species. Oral Microbiol Immunol. 1990; 5: 137-142.
39. Persson S, Edlund MB, Claesson R, Carlsson J. The formation of hydrogen sulfide and methyl
mercaptan by oral bacteria. Oral Microbiol Immunol. 1990; 5: 195-201.
40. Singer RE, Buckner BA. Butyrate and propionate: important components of toxic dental plaque
extracts. Infect Immun. 1981; 32: 458-463.
41. Brook I, Walker RI. The relationship between Fusobacterium species and other flora in mixed
infection. J Med Microbiol. 1986; 21: 93-100.
42. Bolstad AI, Jensen HB, Bakken V. Taxonomy, biology, and periodontal aspects of Fusobacterium
nucleatum. Clin Microbiol Rev. 1996; 9: 55-71.
43. Rogers AH, Gully NJ, Pfennig AL, Zilm PS. The breakdown and utilization of peptides by strains
of Fusobacterium nucleatum. Oral Microbiol Immunol. 1992; 7: 299-303.
44. Ng SK, Hamilton IR. Lactate metabolism by Veillonella parvula. J Bacteriol. 1971; 105: 9991005.
45. Fejerskov Oe, Kidd EAMe. Dental caries : the disease and its clinical management. 2008: p 197.
46. Kalfas S, Edwardsson S. Identification procedures for oral Actinomyces species. Oral Microbiol
Immunol. 1990; 5: 39-42.
47. MacFaddin JF. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. :
Baltimore (Md.) : Williams and Wilkins; 1985.
48. ROGOSA M, MITCHELL JA, WISEMAN RF. A selective medium for the isolation and
enumeration of oral lactobacilli. J Dent Res. 1951; 30: 682-689.
49. Welin-Neilands J, Svensater G. Acid tolerance of biofilm cells of Streptococcus mutans. Appl
Environ Microbiol. 2007; 73: 5633-5638.
29
Bilaga 1 – Bakteriell sammansättning
Försök A:1 Bakteriekultur vid pH 5.5
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
9
15
S. mutans
nd
nd
S. gordonii
4
7
S. intermedius
nd
nd
S. oralis
3
5
L. paracasei
9
15
C. gingivalis
30
50
V. dispar/parvula
nd
nd
F. nucleatum
8
14
Antal cfu på agar
59
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
2,95 x 107
5
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
4
3
nd
nd
nd
nd
nd
nd
39
31
82
66
nd
nd
nd
nd
nd
nd
125
105
6,25 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
9
20
nd
nd
nd
nd
36
80
nd
nd
nd
nd
nd
nd
45
105
2,25 x 107
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
2
4
nd
nd
3
6
46
90
nd
nd
nd
nd
nd
nd
51
105
2,55 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
8
13
nd
nd
nd
nd
53
87
nd
nd
nd
nd
nd
nd
61
105
3,05 x 107
Försök A:2 Bakteriekultur vid pH 5.5
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
5
16
S. mutans
nd
nd
S. gordonii
nd
nd
S. intermedius
1
3
S. oralis
1
3
L. paracasei
6
19
C. gingivalis
8
26
V. dispar/parvula
1
3
F. nucleatum
8
29
Antal cfu på agar
31
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
1,55 x 107
5
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
30
Försök B:1 Bakteriekultur vid pH 5.5
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
2
1
S. mutans
3
2
S. gordonii
9
5
S. intermedius
nd
nd
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
153
87
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
8
5
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
175
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
8,75 x 107
3
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
62
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
62
105
3,10 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
158
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
158
103
7,90 x 105
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
160
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
160
105
8,00 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
188
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
188
103
9,40 x 105
24 h
Antal
%
1
<1
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
188
99
nd
nd
nd
nd
nd
nd
189
105
9,45 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
141
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
141
103
7,05 x 105
Försök B:2 Bakteriekultur vid pH 5.5
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
2
2
S. mutans
2
2
S. gordonii
12
11
S. intermedius
nd
nd
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
91
82
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
3
3
F. nucleatum
1
1
Antal cfu på agar
111
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
5.55 x 107
nd – not detected (< 5 x 103 cfu/ml)
Försök B:3 Bakteriekultur vid pH 5.5
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
2
1
S. mutans
3
2
S. gordonii
5
4
S. intermedius
1
1
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
129
92
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
nd
nd
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
140
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
7,00 x 107
nd – not detected (< 5 x 103 cfu/ml)
31
Försök A:1 Bakteriekultur vid pH 7.2
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
nd
nd
S. mutans
70
60
S. gordonii
6
5
S. intermedius
12
10
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
5
4
C. gingivalis
21
18
V. dispar/parvula
3
3
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
117
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
5,85 x 107
4
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
110
82
24
18
nd
nd
nd
nd
nd
nd
134
105
6,70 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
0
104
< 5 x 104
24 h
Antal
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
0
104
<5 x 104
48 h
Antal
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
0
104
<5 x 104
Försök A:2 Bakteriekultur vid pH 7.2
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
nd
nd
S. mutans
nd
nd
S. gordonii
3
10
S. intermedius
2
7
S. oralis
5
17
L. paracasei
5
17
C. gingivalis
3
10
V. dispar/parvula
2
7
F. nucleatum
9
31
Antal cfu på agar
29
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
1,45 x 107
4
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
32
Försök B:1 Bakteriekultur vid pH 7.2
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
2
1
S. mutans
1
1
S. gordonii
11
8
S. intermedius
nd
nd
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
101
74
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
4
3
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
137
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
6,85 x 107
3
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
5
2
308
98
nd
nd
nd
nd
nd
nd
313
104
15,65 x 106
48 h
Antal
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
0
103
<5 x 103
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
4
2
nd
nd
nd
nd
220
98
nd
nd
nd
nd
nd
nd
224
104
11,20 x 106
48 h
Antal
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
0
103
<5 x 103
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
12
1
622
99
nd
nd
nd
nd
nd
nd
634
104
31,7 x 106
48 h
Antal
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
0
103
<5 x 103
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Försök B:2 Bakteriekultur vid pH 7.2
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
1
1
S. mutans
nd
nd
S. gordonii
19
15
S. intermedius
1
1
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
100
80
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
3
2
F. nucleatum
1
1
Antal cfu på agar
125
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
6,25 x 107
nd – not detected (< 5 x 103 cfu/ml)
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Försök B:3 Bakteriekultur vid pH 7.2
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
3
2
S. mutans
2
1
S. gordonii
1
1
S. intermedius
1
1
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
139
95
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
nd
nd
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
146
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
7,30 x 107
nd- not detected (< 5 x 103 cfu/ml)
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
33
Försök A:1 Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
7
8
S. mutans
32
38
S. gordonii
8
9
S. intermedius
4
5
S. oralis
5
6
L. paracasei
4
5
C. gingivalis
15
18
V. dispar/parvula
10
12
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
85
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
4,25 x 107
3
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
10
26
nd
nd
4
11
24
63
nd
nd
nd
nd
nd
nd
38
105
1,90 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
9
24
nd
nd
nd
nd
29
76
nd
nd
nd
nd
nd
nd
38
103
1,90 x 107
Försök A:2 Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
1
2
S. mutans
nd
nd
S. gordonii
4
9
S. intermedius
3
7
S. oralis
2
5
L. paracasei
8
18
C. gingivalis
10
23
V. dispar/parvula
1
2
F. nucleatum
15
34
Antal cfu på agar
44
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
2,20 x 107
3
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
13
33
3
8
nd
nd
23
59
nd
nd
nd
nd
nd
nd
39
105
1,95 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
13
42
nd
nd
nd
nd
17
55
1
3
nd
nd
nd
nd
31
105
1,55 x 107
34
Försök B:1 Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
4
3
S. mutans
3
2
S. gordonii
8
6
S. intermedius
nd
nd
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
122
85
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
7
5
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
144
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
7.20 x 107
3
nd – not detected (< 5 x 10 cfu/ml)
24 h
Antal
%
6
2
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
281
98
nd
nd
nd
nd
nd
nd
287
105
1,44 x 109
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
84
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
84
105
4,20 x 107
Försök B:2 Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
1
1
S. mutans
1
1
S. gordonii
15
11
S. intermedius
nd
nd
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
120
88
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
nd
nd
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
137
Spädningsfaktor
105
Antal bakterier (cfu/ml)
6,85 x 107
nd – not detected (< 5 x 103 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
19
33
nd
nd
7
12
32
55
nd
nd
nd
nd
nd
nd
58
104
2,90 x 107
48 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
21
100
nd
nd
nd
nd
nd
nd
21
103
1,05 x 105
Försök B:3 Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h
Arter
Antal
%
A. odontolyticus
2
2
S. mutans
nd
nd
S. gordonii
12
9
S. intermedius
3
2
S. oralis
nd
nd
L. paracasei
112
87
C. gingivalis
nd
nd
V. dispar/parvula
nd
nd
F. nucleatum
nd
nd
Antal cfu på agar
129
Spädningsfaktor
104
Antal bakterier (cfu/ml)
6,45 x 106
nd – not detected (< 5 x 103 cfu/ml)
24 h
Antal
%
nd
nd
nd
nd
10
15
nd
nd
nd
nd
55
85
nd
nd
nd
nd
nd
nd
65
105
3,25 x 107
48 h
Antal
%
1
3
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
30
97
nd
nd
nd
nd
nd
nd
31
105
1,55 x 107
35
Bilaga 2 – Odling av bakteriekulturer
Försök A:1 och A:2 – Bakteriekultur vid pH 5.5
0h 24h 48h
I
105
105
105
105
105
105
II
Figur20.Blodagarsomvisartillväxtefter0,24respektive48timmar.Spädningsfaktorstårundervarjebild.
36
Försök B:1, B:2 och B:3 – Bakteriekultur vid pH 5.5
0h 24h 48h
I
105
105
103
105
105
103
105
105
103
II
III
Figur21.Blodagarsomvisartillväxtefter0,24respektive48timmar.Spädningsfaktorstårundervarjebild.
37
Försök A:1 och A:2 – Bakteriekultur vid pH 7.2
0h 24h 48h
I
105
105
II
105
Figur12.Efter24timmarsyntesingacfupåförsökII.Efter48timmarsyntesingacfupånågotförsök.
Spädningsfaktorstårundervarjebild
38
Försök B:1, B:2 och B:3 – Bakteriekultur vid pH 7.2
0h 24h 48h
I
105
105
103
105
105
103
105
105
103
II
III
Figur23.Blodagarsomvisartillväxtefter0,24respektive48timmar.Efter48timmarsyntesingacfupånågot
försök.Spädningsfaktorstårundervarjebild.
39
Försök A:1 och A:2 – Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h 24h 48h
I
105
105
105
II
105
105
105
Figur24.Blodagarsomvisartillväxtefter0,24respektive48timmar.Spädningsfaktorstårundervarjebild.
40
Försök B:1, B:2 och B:3 – Bakteriekultur vid pH 7.2 med tillsats av glukos
0h 24h 48h
I
105
105
105
105
104
103
104
105
105
II
III
Figur25.Blodagarsomvisartillväxtefter0,24respektive48timmar.Spädningsfaktorstårundervarjebild.
41
Bilaga 3 – Förändring av pH över tid
Medelvärden av försök A:1 och A:2.
pH
pH 5.5
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
5,65
5,63
5,49
5,71
0h
Kontroll
Kontroll
Bakteriekultur
Konsortium
4,46
4,45
24h
48h
pH 7.2
7,5
7
6,5
7,26
6,89
6,26
6,21
7,26
6
pH
7,00
5,5
Kontroll
Kontroll
5
Bakteriekultur
Konsortium
4,5
4
3,5
3
0h
24h
48h
pH
pH 7.2 + glukos
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
7,29
6,92
7,29
Kontroll
Kontroll
Bakteriekultur
Konsortium
0h
6,95
4,36
4,23
24h
48h
42
Medelvärden av försök B:1, B:2 och B:3.
pH
pH 5.5
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
5,58
5,58
5,56
5,56
0h
Kontroll
Kontroll
Bakteriekultur
Konsortium
4,19
4,18
24h
48h
pH
pH 7.2
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
7,38
7,11
7,04
6,42
6,3
7,39
Kontroll
Kontroll
Bakteriekultur
Konsortium
0h
24h
48h
pH
pH 7.2 + glukos
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
7,42
7,1
7,41
Kontroll
Kontroll
Bakteriekultur
Konsortium
0h
7,16
4,32
4,23
24h
48h
43
