dna-laboration

Författare: xxx, yyy, zzzz, nnn
Grupp: NR, DFM1, termin???
Namn och OBS student e-mail för de medlemmar i gruppen som godkänt
rapporten skall stå på framsidan.
DNA-LABORATION
Southern blot / PCR
Stockholm 2008
ABSTRAKT
PCR (Polymerase Chain Reaction) och Southern Blot är två vanliga DNA-tekniker. I denna
labb används PCR för att detektera eventuella mutationer i det läkemeteboliserande enzymet
CYP2D6 hos en försöksperson. Southern Blot användes för att urskilja två olika allela former
(1 och 2) av det vanliga leverenzymet (klass 1 ADH), som är en alkoholdehydrogenas som
spjälkar alkohol. Det visade sig att försökspersonen hade både av de möjliga mutationerna
samtidigt som han hade friska alleler (vildtyper) och därför var det omöjligt att bestämma om
han var snabb hydroxylerare eller inte. Southern Blot resultatet visade att det gröna provröret
innehöll en 2-allel medan det gula innehöll en 1-allel.
1
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
1. SYFTE
s.1
2. BAKGRUND
s.1
2.1. CYP2D6
s.1
2.2. ADH
s. 2
3. METOD OCH MATERIAL
s. 2
3.1. PCR
s. 2
3.1.1. Dag 1
s. 2
3.1.2. Dag 2
s. 3
3.1.3. Dag 3
s. 4
3.2. Southern Blot
s. 4
3.2.1. Dag 1
s. 4
3.2.2. Dag 2
s. 5
3.2.3. Dag 3
s. 5
3.3. PCR / Southern Blot
s. 6
4. RESULTAT OCH DISKUSSION
s. 7
4.1. PCR
s. 7
4.2. Southern Bloth
s. 8
4.3 Felkällor
s. 9
5. SLUTSATS
s. 9
Innehållsförteckningen felaktigt gjord skall göras med funktionen I Word så att
den uppdateras automatiskt
2
1. SYFTE
Att teoretiskt och praktiskt utöka vårt kunnande inom två vanliga DNA-tekniker; PCR
(polymerase chain reaction) och Southern Blot. Samt skapa en förståelse om varför dessa två
tekniker är viktigt för en läkare
2. BAKGRUND
I den här labben används PCR för att detektera eventuella mutationer (typ A och B) på det
läkemedelsmetaboliserande enzymet CYP2D6. Southern Blot används för att detektera två
olika humana allela varianter som kodar för att alkolholdehydrogenas (ADH).
De här metoderna kan vara av betydelse för en läkare vid t.ex. dosordinering av olika
mediciner. Southern Blot - resultatet i denna laboration skulle kunna underlätta förståelsen för
varför en patient svarar på alkohol som denne gör – vilket kan vara relevant vid t.ex.
leverskador pga. alkohol. Den specifika mutation som PCR-metoden påvisade är viktig för att
läkare ska veta hur mycket av ett läkemedel som bör ordineras, p.g.a. hur snabbt personen i
fråga kan bryta ner läkemedlet, snabb respektive långsam hydroxylerare.
Anna Stenqvist 07-3-14 11.53
Borttagen:
2.1. CYP2D6
Varför det kan vara intressant att analysera CYP2D6-genen, (vars enzym har samma namn) är
för att om båda allelerna är defekta kommer enzymet inte att ha någon funktion. Det är alltså
ett recessivt arv d.v.s. defekten måste finnas på båda allelerna. Alleler är två olika variationer
av en gen med samma lokus (samma plats på de två olika kromosomerna). Genotypen som
uttrycks m.h.a. båda allelerna kommer ge upphov till en specifik fenotyp, karaktär, hos
försökspersonen.
För att återgå till enzymerna, deras uppgift är att metabolisera flera olika läkemedel. Genom
att enzymaktiviteten t.ex. är nedsatt kan inte läkemedlet brytas ner och utsöndras med urinen,
utan kommer istället att ansamlas i blodet. Det kan alltså vara av mycket stor betydelse för en
läkare för att han/hon ska dosera lämpligt vid en längre tids behandlig beroende på om
patienten har en defekt gen eller inte.
Anna Stenqvist 07-3-14 11.54
Borttagen: det att ge upphov till nedsatt funktion
hos enzymerna
Det finns två typer av genetiska defekter hos långsamma hydroxylerare:
Typ A: De har sex procent av defekta alleler där en adenin i exon fem är borttagen, s.k.
basdelation. Vid syntetisering av enzymet CYP2D6 kommer en förskjutning att ske,
s.k. frameshift. Vilket i sin tur leder till att avläsningen inte blir exakt eftersom
kvävebasen adenin är borttagen.
Typ B: Där har det skett ett basutbyte av guanin till adenin vilket leder till att splitsningen av
mRNAt blir felaktig.
Laborationen med PCR-teknik kan användas för att avgöra vilken CYP2D6-genotyp (genetisk
uppsättningen hos en individ) som finns hos försökspersonen för att sedan kunna avgöra om
denna är en snabb eller långsam hydroxylerare, d.v.s. fenotypen.
Anna Stenqvist 07-3-14 11.56
Borttagen:
Anna Stenqvist 07-3-14 11.56
Borttagen:
3
2.2. ADH
ADH (Alkoholdehydrogenas) är en human enzymfamilj som består av olika enzym som
oxiderar alkoholer (blir aldehyder). Enzymerna inom familjen liknar varandra, men deras
primärstruktur och substratspecificitet (alkoholen som de oxiderar) skiljer sig något.
I kroppen sker den största delen av alkoholmetabolismen i levern och därför finns det en hel
del ADH där. Det vanligaste leverenzymet (klass 1 ADH) är en dimer som består av
subenheterna , eller . Dessa subenheter kan kombineras på olika sätt och det finns en gen
som kodar för var och en av dem. Dessutom finns det allela former (samma locus men något
skiljd uppbyggnad) och det är just det som ska undersökas i denna labb. Närmare bestämt ska
de allela formerna av (1 och 2) undersökas. Inom ett visst DNA-område klyver speciella
restriktionsenzymer (både området och enzymerna är valda på förhand) i ett känt mönster. Då
det är en 2-allel klyver enzymet med ett 400 baspar mellanrum och då det är en 1-allel klyver
den två gånger med ett mellanrum på 275 respektive 125 baspar. Detta faktum kommer att
användas i slutet av denna labb för att bestämma vilken allel det är i respektive provrör (se
resultat nedan).
3. METOD OCH MATERIAL
3.1. PCR
3.1.1. Dag 1
En person ur gruppen gurglade i 30 sekunder med saltlösning (0,9 procent) för att få ett prov
av de epitelceller som finns i munnens slemhinnor. Saltlösningens koncentrationen var
anpassad så att cellerna skulle överleva och inte förstöras, d.v.s. en fysiologisk lösning.
Lösningen spottades i en steril bägare och därefter överfördes den till ett eppendorf-rör som
centrifugerades för att skilja celler från natriumkloridlösningen. En pellet och en supernatan
centrifugerades fram, där endast pelleten kom att användas och supernatanten hälldes bort.
Till pelleten tillsattes (100μl) uppslammad ”InstaGene Matrix” (denna innehöll Chelex-kulor
som adsorberar produkter som frigörs då cellerna förstörs). Lösning inkuberades i 30 minuter
vid 56˚ C i värmebad, för att Chelex-kulorna skulle bli aktiva. Hur denna process går till väga
och annan intressant information har företaget som syntetiserar kulorna patent på och det fick
vi inte ta del av. DNA-lösningen måste blandas väl med matrixen för annars kan det
sedimentera och lägga sig på botten. Efter att lösningen vortexats (blandats) kokades provet
för att cellerna skulle lysera och DNA extraheras ur provet. Men före extraktionen av DNAt
centrifugerades provet ytterligare en gång för att kulorna som har absorberat produkter som
frigjorts vid cellyseringen, som inte är intressanta för laborationen, ska trilla till botten.
Supernatanten kommer alltså att innehålla det som är intressant, bland annat DNAt. En del av
denna supernatant (30 μl) överfördes till ett eppendorf-rör.
Genen som vi är intresserade av CYP2D6, är mycket lik två pseudogener (gener som p.g.a
mutationer inte kan koda för proteiner). För att inte blanda ihop dem med den riktiga genen
användes två primerpar (A, A´och B, B´) som masskopierar just de två regioner i CYP2D6
som vi är intresserade av, d.v.s. regionerna med exonerna 3, 4 (samlades i ett endorfrör A) och
regionen med exonerna 5,6 (samlades i endorfrör B). Eftersom ett polymeras inte kan
syntetisera på ett ”naket” DNA utan behöver en startplats, en primer, dv.s en kort sekvens
4
Anna Stenqvist 07-3-14 11.57
Borttagen: På
som redan basparar till DNAt. Med hjälp av primer kan man på detta sätt styra var
syntetiseringen startar.
Kopieringen skedde i 35 PCR-cykler.
En cykel innebär tre steg:
1. Denaturering. Detta innebär att DNA strängarna ”smälts” isär genom att temperaturen
höjs till 95˚C.
2. Hybridisering. Under denna process binder primrarna (m.h.a. vätebindningar) specifikt
till DNAt. Detta sker optimalt vid 55˚C.
3. Syntes. Vid 72˚C syntetiserar polymeraset en komplementär sträng, vilket innebär att
för varje ny cykel kommer antalet sekvenser att dubbleras.
Nu har alltså att pseudogener sållats bort (ependorfrör A innehåller regionen av genen med
exonerna 3 och 4 samt ependorfrör B innehåller regionen av genen med exonerna 5 och 6)
och proverna innehåller endast det DNA som vi är intresserade av. Pseudogenernas DNA
finns kvar men har inte duplicerats vilket betyder att de sekvenserna är obefintliga.
3.1.2. Dag 2
Efter PCR I innehöll våra prover masskopierade sekvenser av exonerna 3, 4 (endorfrör A) och
5, 6 (endorfrör B). Vi hade alltså förstärkt de sekvenser vi är intresserade av. Pseudogenerna
masskopierades inte av primrarna A, A´ och B, B´. Man kan sammanfattningsvis säga att PCR
I var nödvändig för att utesluta masskopiering av pseudogenerna.
Nu när vi har masskopierat sekvenserna är det utan vetskap om de är muterade eller inte. Som
tidigare nämnts är de muterade då guanin blir till adenin på exon nr. 4 (Typ B) eller då adenin
”försvinner” genom deletion i exon nr. 5 (Typ A). Än så länge kan inte någon mutation
detekteras p.g.a att primerna A, A´, B och B´ masskopierar både den vilda och muterade
sekvenser. Därför pipetterade vi under dag 2 med primers för masskopiering av både vildtyp
och muterade sekvenser, se figur 1.
Kopieringen skedde i 15 PCR-cykler som ovan beskrivits under dag 1, med den lilla skillnad
att under dag 2 användes en hybridisering temperatur på 52˚C.
Anna Stenqvist 07-3-14 12.00
Borttagen: G
Anna Stenqvist 07-3-14 12.00
Borttagen: Adenin
Anna Stenqvist 07-3-14 12.01
Borttagen: Adenin
Anna Stenqvist 07-3-14 12.01
Borttagen: både
Anna Stenqvist 07-3-14 12.02
Borttagen: regioner
5
Figur 1: Pipettering från endorfrör A och B till rör med de olika primrarna som masskopierar
för de olika regioner
•
•
•
•
Mutation typ A på båda allelerna, leder till att vi få en masskopiering i det gula röret
och inte i det rosa.
Mutation typ A på en allel och ingen mutation på den andra, leder till att vi får en
masskopiering i både det gula och det rosa rören.
Mutation typ B på båda allelerna ger masskopiering i det gröna röret och inget i det
blåa.
Mutation på typ B på en allel och inte på den andra ger masskopiering i både det gröna
och blåa röret.
3.1.3. Dag 3
Det första som förbereddes under dag tre var gelen som ska användas vid elektroforesen.
Elektrofores innebär en separation av DNA-molekyler med avseende på storlek m.h.a. att en
spänning läggs på en gel och fragmenten vandrar olika snabbt beroende på storlek mot
anoden, stora långsamt och små snabbt.
Anna Stenqvist 07-3-14 12.02
Borttagen: é
Därefter pipetterade vi 4 μl av en färglösning (som innehöll glycerol för att öka densiteten, så
att lösningen kunde sjunka ner i gelens brunnar) till vardera PCR-produkt och 2 μl till
storleksmarkören. När proverna blandats pipetterade vi ner dem i gelen. Sedan lades en
spänning över gelen och de större molekyler vandrade långsammare än mindre. På så sätt får
man en separation i storlek. Utifrån denna separation kan man sedan se vilken/a utav proverna
1 – 4 som har masskopierats. Fragmenten för alla kombinationerna för ependorf-rören i figur
1 (blå, grön, rosa och gul) bör vara 564 baspar långa.
3.2. SOUTHERN BLOT
3.2.1. Dag 1 vad hände dag 0?
Till att börja med gjöts en gel som skulle kunna användas senare i elektroforesapparaten. Tre
stycker rör erhölls från amanuens där två innehöll DNA-prover av olika sammansättning (2
och 1) och det tredje en storleksmarkör. Till 1 och 2 tillsattes 2 l färglösning och till
markören 3 l. Geltråget sänktes ned i elektroforesapparaten varvid polariteten kontrollerades
så att DNAts negativt laddade fosfatgrupper skulle kunna vandra mot pluspolen. De tre
proverna laddades i gelen med automatpipett varvid strömmen slogs på (100 V) och proverna
fick möjlighet att vandra under en timme.
Då tiden var ute behandlades gelen med etidiumbromid i ett bad under 5min. Efter det
avfärgades gelen med vatten i 10 minuter varefter den fotograferades på ett UV-bord och efter
det kapades kammen. En markering i övre högra hörnet, som skars bort, gjordes också för att
under resterande tid av laborationen kunna hålla reda på rikting.
Steget som följde var denatureringen där man gör DNA:t enkelsträngat för att det ska
kunna komplettera??? den komplementära sekvensen på filtret????. Vi täckte gelen med 40
ml 0,5M NaOH+1,5M NaCl i 15 minuter. Innehållet skakades lätt på ibland för att vätskan
skulle fördelas jämt över gelen innan vi senare sköljde denna tre gånger i vatten. För
neutralisering användes 40 ml 0,5M Tris-Cl pH7,5+1,5M NaCl i 15 minuter.
Vi byggde därefter upp en blottningspacke med 250 ml 20xSSC (20xSSC=3M NaCl+0,3M
natriumcitrat) i en plastbytta. Packen bestod (nerifrån och upp) av wettexduk på plastbytta (i
kontakt med bufferten), 3MM papper, gelen, nylonfilter (luftbubblor stryktes ut), remsor avc
plastfilm (ram ovanför gelen), två 3MM-papper, 20 stycken vikta papperhandukar och
6
Anna Stenqvist 07-3-14 12.04
Borttagen: ett
Anna Stenqvist 07-3-14 12.04
Borttagen: tråg
slutligen en 1-literskolv fylld med vatten (stabiliserad med hjälp av ett stativ). Denna packe
fick sedan stå över natten så att DNA:an med hjälp av kapillärkrafter (uppstår från tyngder på
gelen) kan vandra upp till nylonfiltret.
3.2.2. Dag 2
Blottpacken från gårdagen monterades ner och nylonfiltret fick torka på en pappershandduk.
Efter det belystes nylonfiltret med UV-ljus för att korslänka (”fixera”) DNA:t.
Nästa steg var att prehybridisera nylonfiltret. En prehybrediseringsmix (10ml) tillsattes och
detta fick sedan inkubera i rumstemperatur i en timme. Anledningen till prehybrediseringen är
att komma ifrån störande bakgrund. Filtret är något positivt laddat medan DNA:at är något
negativt laddat. Proben (definieras nedan) som ska tillsättas i nästa steg (hybridiseringen) är
något negativt laddad och skulle binda ospecifikt till den positivt laddade filtret om den skulle
tillsättas redan nu (detta skulle i slutändan leda till svårighet att i slutskedet av labben urskilja
DNA:at från bakgrunden). I prehybrediseringsmixen fanns tRNA-molekyler (precis som
proben negativt laddade) som kan binda till den positivt laddade gelen och på så sätt
”neutralisera” den.
Nästa steg är själva hybrediseringen. För att kunna göra det behövs en så kallad prob som
är komplementär (bestämt??? och modifierat på förhand) till de DNA-strängar som är aktuella
i denna labb, alltså DNA-området där restriktionsenzymet klyver antingen med 400bp
(baspar), 275 bp eller 125 bp mellanrum. Proben som användes var kemiskt modifierad band
molekylen dioxigenin (DIG) som kan katalysera fel!!! en färgreaktion i labbens slutskede och
på så sätt bli synlig (se nedan). Den var 400bp och kan binda till både den 400bp, 275bp och
125bp-långa stängarna som restriktionsenzymet gett upphov till.
Det första som gjordes var att proben denaturerades (från dubbelsträngad till enkelsträngad)
så att den kan binda till den aktuella DNA-strängen. Detta gjordes genom att två rör som
innehöll proben värmdes på ett värmeblock 95°C i 10 min. Efter det placerades den
omedelbart på is för att snabbkylas. Sedan hälldes prehybrediseringsmixen av från nylonfiltret
och proben tillsattes. Detta fick sedan inkubera över natten.
Anna Stenqvist 07-3-14 12.16
Borttagen: gelen
Anna Stenqvist 07-3-14 12.17
Borttagen: :a
Anna Stenqvist 07-3-14 12.17
Borttagen: :a
Anna Stenqvist 07-3-14 12.18
Borttagen: så att att skulle binda til
Anna Stenqvist 07-3-14 12.18
Borttagen: l
Anna Stenqvist 07-3-14 12.19
Borttagen: :a
3.2.3. Dag 3
Idag ska proben (som nu kan binda specifikt till det vi söker) och dess DIG-molekyler
detekteras med hjälpa av antikroppar och färgämnen. Första steget för att komma dit var att
tvätta av filtret med hjälp av två tvättlösningar. Först med ”tvättlösning 1” i rumstemperatur
och sedan med ”tvättlösning 2” i ett värmeskåp 68°C i 30 min. Detta gjordes för att få bort
prob som ej bundit till DNA:a strängar. Denna prob skulle annars bli störande bakgrund
senare.
Proben och dess DIG-molekyler kan i slutändan detekteras tack vare att en sorts
antikroppar binder till DIG-molekylerna (som fungerar som antigener till antikropparna). För
att optimera detta genomförs ett moment som påminner om prehybrediseringen dag 2. Två
olika buffertar (buffert 1 och 2) tillsattes (25 ml av varje i 5 respektive 25 min) som skulle få
bort elektrostatiska krafter som skulle kunna få antikropparna att binda ospecifikt. Buffert 1
var maleinsyrabuffert (pH 7,5) och buffert 2 var blockningsreagens samt anti-DIG fel!!! Vad
vore meningen med detta? kunjugerad till alkaliskt fosfatas i maleinsyrabufferten.
Efter det hälldes bufferten av och 10 ml av antikropparna (Fab) tillsattes och detta fick
sedan inkuberas i rumtemperatur i 30 min. Sista steget innan färgreaktionen (som gör DNA:a
längderna åskådliga) var att tillsätta 15 ml av en tredje buffert varför då?.... och denna
blandning fick inkuberas i rumstemperatur i 5 min.
Sedan hälldes bufferten av och 10 ml grön färglösning (X-fosfat + NBT i tris buffert)
tillsattes för reagera med antikropparna. Detta fick inkubera i 30 och då bufferten är
7
Anna Stenqvist 07-3-14 12.24
Borttagen: buffert
Anna Stenqvist 07-3-14 12.23
Borttagen: s
ljuskänslig fick det stå i ett ljusskyddat utrymme. Reaktionen stoppades genom att sänka
filtret i avjonat vatten. Slutligen fick filtret torka och resultatet kunde åskådas.
3.3. PCR / Southern Blot
Ett sätt att få en djupare förståelse för de här två DNA-teknikerna är att göra en kortare
jämförelse mellan dem. Den stora och uppenbara likheten mellan dem är att de båda används
för att detektera mindre fragment av DNA:t. Vad exakt vill vi detektera?
I båda fallen denatureras DNA:t i fråga för att bli enkelsträngat. Dock skiljer sig
denatureringsmetoderna i de två experimenten åt. I Southern Blot experimentet användes
NaOH (högt pH) medan det i PCR experimentet användes hög temperatur för att denaturera
DNA:t.
Att denaturera är viktigt för att en komplementerande sekvens ska kunna binda till DNA:t. I
Sothern Blot försöket var det en märkt probe som band, medan det i PCR försöket var ett
primerpar som band till den enkelsträngade mallen. Vad proben och primerparet har
gemensamt är att de båda gör det möjligt att detektera den sökta sekvensen. Till skillnad från
proben (som komplementerar till hela den sökta sekvensen) märker primerparet bara ut var
DNA-polymeraset ska börja och behöver därför en mängd fria nukleotidtrifosfater (som blir
nukleotider då de binder till den växande strängen).
En annan gemensam nämnare för de båda metodernas är att gelelektrofores användes för att
detektera de sökta sekvenserna. Detta gjordes i båda fallen genom att tillsätta färglösning med
glycerol (höjer densiteten) och etidiumbromid (som gör DNA:t synligt vid UV-belysning).
4. RESULTAT OCH DISKUSSION
4.1. PCR
Som tidigare nämnts borde fragmenten för alla kombinationerna vara ca 564 baspar långa
vilket de även visade sig vara, se figur 2. Resultatet visade att försökspersonen hade
mutationer på alla fragmenten, alltså både A heterozygot och B heterozygot. I Figur 2 kan
man alltså se att det skett en masskopiering i alla de fyra olika provrören med de olika primers
(se figur 1 för ytterligare information om provrörsubstans). Försökspersonen har alltså
segmenten med Bwt, Bmut, Awt och Amut. Denna metod klargör dock inte på vilka alleler
respektive sitter vilket leder till att ingen slutsats kan dras gällande om försökspersonen är
snabb eller långsam hydroxylerare. Alltså eftersom vi inte vet hur de olika fragmenten
förhåller sig till varandra, vet vi inte heller om det är ett recessivt anlag. Fenotypen kan vara
normal, men också tvärtom. Vi kan alltså inte säga om personen i fråga är en snabb eller
långsam hydroxylerare, men statistik (från laborationsinstruktionshäftet) har visat att det är
större sannolikhet att försökspersonen är långsam hydroxylerare. En metod för att klargöra om
personen är långsam eller snabb hydroxylerare innebär att DNA-prover tas från mamman och
pappan. Om det sedan visar sig att någon av föräldrarna är snabba kan slutsatsen dras att
försökspersonen är snabb och har således ärvt en icke muterad allel.
8
Figur 2: Brunnarna som de olika lösningarna fylldes i befinner sig högst upp på bilden. Längst ner på bilden
fanns den positiva anoden. Lösningarna vandrade alltså uppifrån och ner. Ju mindre segmenten var desto längre
ner mot anoden kom de. Längst till vänster ser vi storleksmarkören. Den tjockare av markörerna på
storleksmarkören har storleken 501/489 baspar och ovanför denna finns 692 baspar. Man ser att fragmenten från
de masskopierade segmenten (från försökspersonen) har storleksordningen mellan dessa markörer och detta
stämmer väl eftersom vi vet att dess storlek ska vara 564 baspar.
4.2. SOUTHERN BLOT
De erhållna resultaten var både tydliga och önskade. Efter elektroforesen, tillsättningen av
etidiumbromid och UV-belysning dag 1, uppstod tre tydliga bandmönster i var av de tre
kolumnerna. Detta var alltså DNA med olika basparlängd från respektive provrör (rosa, grönt
och gult) som hade vandrat i gelen. Dessa band fotograferades och det erhållna fotot kan ses
nedan till vänster (fig. 3). Detta foto visar att det finns DNA i de olika provrören och att dessa
har klyvts av restriktionsenzymet.
Slutresultatet efter färgreaktionen dag 3 var även det tydligt och önskat. Det uppstod tre
kolumner med band som kan ses på fotot nedan till höger (fig. 4). Den första kolumnen från
vänster (rosa provrör) var som tidigare nämnt ”markören”. Basparlängden (som
restriktionsenzymet i ett visst DNA-område gett upphov till) för DNA:t i de två övriga
kolumnerna (grönt- respektive gult provrör) var det som skulle bestämmas i denna labb.
Med hjälp av markören kan man se att det gröna provröret innehöll en DNA-sträng och detta
var ungefär 400 baspar långt medan det gula innehöll två DNA-stränger som ser ut att vara
knappt 300 baspar respektive 100 baspar långt. Utifrån detta kan vi dra slutsatsen att det gröna
provröret innehöll en 2-allel, medan det gula innehöll en 1-allel.
9
Figur 3. Brunnarna syns
högst upp på bilden. De tre
lösningarna har vandrat från
brunnarna mot anoden
(längst ner på bilden). Att
det finns olika långa basparlängder visar att restriktionsenzymerna har verkar.
Figur 4. Bilden visar att lösningen från det gröna provröret innehåller
en DNA-sträng medan lösningen från det gula innehåller två. Lösningen
i det rosa provröret fick fungera som markör. Utifrån detta kan man se
att DNA-strängen från det gröna provröret är ungefär 400 baspar långt
och att strängarna från det gula var ungefär 100 respektive 300 baspar
långt.
4.3. FELKÄLLOR
Slutligen kan något sägas om felkällorna. Exempel på felkällor som skulle kunna uppkomma
under laborationen är att andra celler kommer in i provet och kontaminerar det. Eftersom även
dessa celler i lösningen kan tänkas dupliceras senare under PCR, vilket skulle ge ett felaktigt
resultat av laborationen.
Båda laborationerna innehöll ett stort antal moment och således kan den mänskliga faktorn
inte uteslutas. Pipettering, injicering i gelen vid elektroforesen och felaktigt uppbyggd
blottningspacke är några exempel när detta kan ha haft betydelse.
5. SLUTSATS
På det stora hela gick experimenten väldigt bra. Det visade sig att det inte gick att bestämma
huruvida försökspersonen var snabb hydroxylerare eller inte och att det gröna provröret
innehöll en 2-allel, medan det gula innehöll en 1-allel.
10