Generation of mutated expression plasmid KRT1 and

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete 15 hp, vt 2012
Generation of mutated expression plasmid KRT1 and
comparison of HaCaT cells transfected with
expression plasmid KRT1 or KRT10 concerning
keratin aggregates
Jennifer Eriksson
Handledare: Hans Törmä, Institutionen för Dermatologi och Venereologi, Akademiska
sjukhuset, Uppsala
ABSTRACT
Introduction The genetic skin disease epidermolytic ichtyosis is caused by mutations in
either keratin gene 1 or 10 and leads to blisters and hyperkeratosis of the epidermis. At
cellular level the disease is seen as aggregates in the keratin filaments. There is no good
treatment available for this disease today, mainly due to lack of reproducible model systems
for evaluation of novel drug candidates. In this article we describe how an in vitro model
consisting of cells from a stable cell line transfected with expression plasmids to mimic
patient cells, may be a possible alternative for screening compounds for therapies. The first
step was to generate an expression plasmid required to complete the in vitro model. The
model was tested by a preliminary experiment with 4-phenylbuturate (4-PBA) to see if the
substance had an effect on the amount of cells with keratin aggregates.
Methods The desired 12bp-deletion was incorporated in the wild type keratin 1 plasmid using
PCR and primers to generate the expression plasmid. HaCaT cells were transfected with the
expression plasmid containing mutated keratin 1. The percentage of cells with keratin
aggregates was assessed by fluorescence microscopy.
Results/Conclusion Cells containing mutated plasmid had a higher percentage of keratin
aggregates compared to cells transfected with wild type plasmid. 4-PBA was found not to
affect the amount of cells with keratin aggregates. According to this project the model might
be a useful tool for screening compounds, but it needs to be further optimized.
KEYWORDS
Epidermolytic ichtyosis, keratinocytes, keratinfilaments, keratin gene mutation, 4-PBA
FÖRKORTNINGAR
EGFP- enhanced green fluorescent protein
EI- Epidermolytisk iktyos
K- Keratin
KRT- Keratingen
4-PBA- 4-fenylbutyrat
2
INTRODUKTION
Kroppens största organ, huden, är uppbyggd av lagren epidermis, dermis och subcutis.
Subcutis sammanfäster huden med ben och muskler, försörjer den med nerver och blodkärl
och det är här underhudsfettet finns. Över subcutis finns två lager, stratum papillare och
stratum retikulare, som tillsammans bildar dermis. Dermis är ett slitstarkt lager av bindväv
innehållande fibroblaster, mastceller, makrofager och leukocyter där även bland annat
beröring och smärta registreras av sensoriska nervändar. Över dermis och som kroppens
barriär mot omvärlden finns epidermis som delas in i fyra lager, stratum basale, stratum
spinosum, stratum granulosum och stratum corneum. Epidermis innehåller mestadels
keratinocyter, som prolifierar basalt och differentierar suprabasalt, men även melanocyter,
Langerhans celler och Merkelceller. Stratum corneum, hornlagret, består således av döda
tillplattade keratinocyter som vandrat dit från stratum basale.
I det mänskliga genomet finns bland annat en familj av gener om minst 65 som kodar för
intermediära filament, 54 av dessa gener kodar för intermediära filament av typen keratiner.
Dessa gener som kodar för keratiner delas även in i två grupper där typ I utgör keratin 9-20
och typ II utgör keratin 1-8. Keratinfilament är fibrösa proteiner som bygger upp
keratinocyternas cellskelett genom att bilda ett 10-12nm brett trådlikt nätverk som sträcker sig
från cellkärnan och ut i cellens perifera delar och därmed ger cellen dess stabilitet och
flexibilitet. Keratinfilamenten i en cell utgörs alltid av keratinpar, där parterna är ett protein av
typ I och ett protein av typ II. Paret lindar sig runt varandra och bildar en heterodimer, två
heterodimerer kommer sedan bilda en tetramer och två tetramerer bildar ett protofilament. Ett
keratinfilament i cellen utgörs sedan av åtta protofilament. Ett exempel på ett keratinpar är
keratin 1 (K1) och keratin 10 (K10), som är de keratiner som är genetiskt förändrade vid
hudsjukdomen epidermolytisk iktyos (EI), vilket denna studie kommer att handla om. Ibland
sker mutationer i keratingenerna och detta kan leda till en rad olika hudsjukdomar, beroende
på vilket keratin som blir påverkat [1-2]. Själva keratinfilamenten påverkas på så vis att
proteinet kanske aggregerar och keratinocyterna blir mer ömtåliga och kan gå i cytolys [3].
EI eller även kallad Bullous congenital ichthyosiform erythroderma och epidermolytisk
hyperkeratos, är en ovanlig hudsjukdom som drabbar ungefär 1 på 100 000-300 000 personer.
Sjukdomen nedärvs främst autosomalt dominant men 50% av fallen beror på spontana
mutationer och det finns även enstaka fall med autosomalt recessiv nedärvning rapporterade.
EI uppstår då det finns en punktmutation, dinukleotidmutation eller deletion i generna för
antingen K1 eller K10, och beroende på typ av mutation och lokalisation i genen blir
sjukdomen olika svår. Hos ett nyfött barn ses EI som rodnad, blåsor och hyperkeratos på
huden och vid milt trauma kan delar av epidermis till och med lossna. Blåsorna uppstår
suprabasalt medan de basala keratinocyterna är normala. Eftersom en av hudens viktigaste
funktioner är att förhindra vattenavdunstning kan den nyfödda också få problem med
elektrolytbalansen. Med åldern minskar bildningen av blåsor och hyperkeratiniseringen
uppstår oftare på vissa områden av kroppen, till exempel där hud kommer i kontakt med hud
[1, 3-5]. Personer med EI kan också drabbas av bakteriella infektioner i de förtjockade
områdena på huden vilket kan leda till en illaluktande odör och i värsta fall sepsis [3].
Det finns olika typer av iktyos, till exempel ’ichthyosis bullosa of Siemens’ som beror på
defekt i keratingen 2e eller ’epidermolytic palmoplantar keratoderma’ som beror på defekt i
keratingen 9. Dessa två har vissa symtomatiska likheter med EI, så för att ställa diagnosen EI
undersöks bland annat hudbiopsier med immunhistokemi, elektron- och ljusmikroskopi. Man
kan även få reda på vilket keratin som är påverkat genom indirekt immunofluorescens där
monoklonala antikroppar mot keratinuttryck används. När det är fastställt vilket keratin som
är påverkat kan man också få reda på exakt var i genen mutationen är lokaliserad genom
mutationsanalys [3].
3
Även om orsaken till EI är känd kan få behandlingar erbjudas för denna livslånga sjukdom
och i dagsläget används mestadels mjukgörande krämer. En del patienter har också blivit
hjälpta av syntetiska retinoider och kalcipotrol (vitamin D3 -analog). Det finns även in vitrostudier som beskriver att en liten molekyl, 4-fenylbutyrat (4-PBA), minskar bildningen av
aggregat av muterade keratinproteiner. Mekanismen för hur 4-PBA fungerar är inte helt
klarlagt men eventuellt fungerar den bland annat som ett kemisk chaperon, det vill säga ser till
så att proteiner veckas på rätt sätt [5].
Genom detta projekt ville man skapa ett verktyg som längre fram kan leda till att olika
substanser kan prövas in vitro på patogena celler i hopp om att hitta en behandling för EIpatienter. För detta arbete användes expressionsplasmider med en fluorescerande tag,
innehållande både keratingen 1 (KRT1) och 10 (KRT10) eftersom de båda är involverade vid
EI. Man vill ha dels vildtypen (normal variant) och dels muterade keratiner i plasmiderna för
att kunna jämföra dessa. Vildtypsplasmider och muterad KRT10 fanns redan att tillgå på
laboratoriet, så som första del i projektet skapades en plasmid KRT1 som hade en deletion på
tolv baspar (KRT1 c.508_519del). Deletionen är densamma som hos en känd svensk patient
vars sjukdom är svår. Genom PCR av plasmid KRT1vt med primrar som inkorporerade
mutationen i PCR-produkten åstadkoms deletionen. För att sedan få större mängd plasmidDNA transformerades detta genom värmechock in i bakterier som sedan fick växa. Efter att
plasmiden renats från bakterier introducerades den sedan till HaCaT-celler, som är en
spontanimmortaliserad keratinocytcell-linje [6], för att dessa skulle uttrycka keratinet. Detta
steg kallas transfektion och metoden som användes bygger på att DNAt bildar ett positivt
laddat komplex tillsammans med ett transfektionsreagens som cellen tar upp genom
endocytos.
Plasmiderna innehåller en kanamycinresistensgen vilken utnyttjas vid transformationen och
odlingen av bakterierna. En CMV-promotor i plasmiderna gör att keratinproteinerna kommer
att uttryckas konstant i cellerna och en EGFP-tag gör att man kan studera förekomsten av
proteinet (EGFP-märkt keratin) i de transfekterade cellerna i ett fluorescensmikroskop. Det
som studerades i fluorescensmikroskopet var antal celler med aggregat bestående av muterat
keratin för att se hur proteinuttrycket påverkas vid mutationer i KRT1 och KRT10, eftersom
det som tidigare nämnts kan bildas aggregat i keratinfilamenten hos dessa celler. Detta
fenomen uppstår ännu hellre om cellen utsätts för stress av något slag och en metod för detta
är att utsätta cellerna för värmestress i till exempel ett 42°C-igt vattenbad, vilket gjordes i
detta projekt.
Eftersom 4-PBA visat sig minska antalet celler med keratinaggregat i en studie på
immortaliserade patientceller [5], ville man i detta projekt se om substansen verkar som ett
chaperon.
Syftena med detta projekt var alltså att 1) ta fram plasmid KRT1 med en deletion c.
508_519del. 2) transfektera in detta konstrukt i HaCaT-celler och jämföra med HaCaT-celler
med KRT10 c.C466G med avseende på keratinaggregat. 3) undersöka om 4-PBA har någon
effekt på antal celler med keratinaggregat.
MATERIAL OCH METOD
Ingen etisk prövning krävdes för projektet eftersom det inte involverade varken människor,
djur eller material som kan härledas till en individ.
Provmaterial
För att framställa expressionsplasmid KRT1 c.508_519del (cDNA) eller K1 p.Asp170_Ile173
(proteinnivå) användes plasmid med cDNA KRT1vt (Dr. Linda Sandblad, Karolinska
Institutet, Sverige) och pEGFP-C1 (Takara bio Europe/Clontech, Frankrike). På laboratoriet
4
fanns redan KRT10vt (Dr. Linda Sandblad, Karolinska Institutet, Sverige) och KRT10 c.
C466G (cDNA) eller K10 p.R156G (proteinnivå) som framställts på laboratoriet. HaCaTcellerna var från Norbert Fusenig, DKFZ, Tyskland och DH5α-bakterierna var från Professor
Gunnar Westin, Institutionen för kirurgiska vetenskaper, Uppsala Universitet, Uppsala.
Framtagning av expressionsplasmid KRT1 c.508_519del
För att ta fram expressionsplasmid KRT1 c.508_519del användes protokollet för
QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies Sweden AB,
Sverige) med undantag för några ändringar: för att introducera deletionen i KRT1vt utfördes
två separata PCR istället för en, en för kodande strängen och en för icke-kodande strängen av
plasmiden, detta för att undvika primerdimer då strängarna är komplementära mot varandra.
Primrarna hade konstruerats så att de innehöll den önskade deletionen och för den kodande
strängen användes 1,25μL av primer 5’CCCCTCAATGTGGAGATTCAAAAGGTGAAGTCTCGA och för den icke-kodande
strängen användes 1,25μL av primer 5’TCGAGACTTCACCTTTTGAATCTCCACATTGAGGGG. Koncentrationen på primrarna
var 100ng/μL. 5μL av KRT1vt med koncentrationen 10ng/μL användes i de båda reaktionerna
och PCR-programmet som kördes var 1 cykel 95°C i 60sek, 10 cykler 95°C i 60sek, 55°C i
90sek, 68°C i 7min, för att avslutas på 55°C. Sedan poolades reaktionerna ihop genom att ta
25μL av vardera reaktionen, kodande sträng och icke-kodande sträng, i ett nytt rör och 0,75μL
Pfu Ultra HF polymeras (QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit, Agilent
Technologies Sweden AB, Sverige) tillsattes eftersom enzymet förbrukats i de tidigare
reaktionerna. Anledningen till att Pfu Ultra HF polymeras användes istället för Taqpolymeras är att det enzymet har högre noggrannhet. Ovanför vätskan tillsattes 30μL
mineralolja och PCR utfördes på PTC 200 DNA engine systems (Bio-rad, USA) enligt 1
cykel 95°C i 60sek, 18 cykler 95°C i 60sek, 55°C i 90sek, 68°C i 7min för att avslutas på 4°C.
För att få bort vildtypsplasmid tillsattes sedan restriktionsenzymet Dpn I. Inga kontroller
användes under PCR.
Plasmid som innehöll deletionen transformerades sedan in i XL10-Gold ultrakompetenta
bakterier (QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit, Agilent Technologies Sweden
AB, Sverige) genom värmechock, det vill säga att provrören var först placerade på is och sen
placerades de i ett 42°C-igt vattenbad under 45sek. Istället för ’NZY+ broth’ användes LBmedium (Lennox broth medium). Plattorna som bakterierna sedan odlades på innehöll 30mL
LB-medium och 30µg/mL kanamycin. Inga kontrollplattor odlades.
Efter att bakterierna fått växa i 37°C över natt plockades en koloni med ögla och
suspenderades i ett provrör med 4mL LB-medium och 4μL kanamycin. Provröret inkuberades
sedan på skak i 225rpm i 37°C över natt.
Rening av plasmid-DNA med QIAprep spin miniprep kit
För att rena plasmiden pelleterades bakterierna i 6min, 3825g. Med pelleten gick man vidare
enligt protokollet för QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, Sverige), genom vilket bakterierna
lyseras alkaliskt så att plasmid-DNAt blir lösligt och sedan kan fästa i en kolonngel och till
sist elueras ut i ett provrör. 35μl EB-buffert, vilket är elueringsbufferten, tillsattes istället för
50μl. För att sedan bestämma koncentration och renhet av plasmid-DNA i provet tillsattes
1,5µL av provet till en Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies,
USA). Koncentrationen DNA i provet bestämdes genom att absorbansen vid 260nm mättes
medan renheten bestämdes genom att räkna ut en kvot mellan absorbansen vid 260nm (DNA)
och 280nm (proteiner). Som blank till instrumentet användes 1,5µL av elueringsbufferten.
5
Amplifiering med realtids-PCR och sekvensering av plasmid
Enligt absorbansmätningarna hade provet tillräckligt hög koncentration plasmid-DNA och
tillräckligt bra renhet (A260/A280 >1,8) efter reningen, så det amplifierades upp med hjälp av
realtids-PCR. Direkt efter realtids-PCR utfördes en smältkurva, vilken visar vid vilken
temperatur DNA-strängarna denatureras. Även KRT1vt togs med i körningen för att kunna
jämföra dess smälttemperatur mot KRT1 c.508_519del. Som negativ kontroll användes vatten
och dubbelprov kördes på samtliga prover. Som forward primer användes 5’CCCTCCTGGTGGCATACAA och som reverse primer användes 5’CAGCAGCTCCCATTTTGTTTG. Proverna späddes 1:5000 med vatten. Till mastermixen
användes för ett prov: 10µL 2x buffert fast SYBRgreen (Applied Biosystems, Sverige), 7,2µL
H2O, 0,4µL forward primer 10µM, 0,4µL reverse primer 10µM. Till 96-hålsplattan tillsattes
20µL (18µL mastermix och 2µL prov) per brunn. Plattan täcktes med självhäftande plastfilm
och centrifugerades i 1700g i 2min innan realtids-PCR med följande inställningar kördes:
95°C i 20sek, 40 cykler 95°C i 3sek, 55°C i 30sek, efterföljt av en smältkurva: 95°C i 15sek,
60°C i 60sek, 95°C i 30sek, 60°C i 15sek.
För att verifiera att mutagenesen lyckats utfördes sedan en sekvensering av provet som
amplifierats med realtids-PCR på Uppsala Genome Center, Rudbecklaboratoriet, Uppsala. För
provet skickades två rör, ett rör med forward och ett rör med reverse primer så att analysen
skedde i två separata reaktioner på båda DNA-strängarna. Provrören innehöll 2µL H20, 12µL
plasmid-DNA och 4µL primer. Som forward primer användes 5’TGTTAACCTTGGTGGCAGTAAAAG och som reverse primer användes 5’CAGCAGCTCCCATTTTGTTTG. Sekvenseringen utfördes med AB13730XL DNA analyzer
och BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) enligt följande: 94°C
i 30sek följt av 35 cykler 94°C i 25sek, 50°C i 15sek, 60°C i 120sek. De erhållna resultaten
analyserades på laboratoriet med hjälp av programmen Chromaspro (Technelysium Pty Ltd)
och BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) och för att jämföra den erhållna sekvensen
med andra användes GenBank (en DNA-sekvensdatabas).
Framställning av mer plasmid-DNA
Då det genom sekvenseringen verifierats att mutagenesen lyckats transfomerades plasmidDNAt in i DH5α-bakterier för att skapa större mängd av expressionsplasmiden. DH5αbakterier är bra på att ta upp en plasmid och sen syntetisera många nya plasmider.
Transformationen gick till enligt följande: DH5α-bakterier som varit frysta i -70°C tinades
långsamt på is. Sedan tillsattes 50µL av bakterierna till ett 15mL falcon polypropylen-rör
(som i förväg hade kylts på is) och röret inkuberades i 2min på is innan 4µL av plasmidDNAt spätt 1:10 tillsattes i röret. Lösningen blandades försiktigt och inkuberades på is i
30min. För att föra in plasmiden i bakterierna värmechockades de genom att röret fördes ned i
ett 42°C-igt vattenbad i 45sek för att sedan ställas på is i 2min. Till röret tillsattes sedan
0,5mL 42°C-igt medium (5ml LB-medium och 0,1mL 1M glukos) och lösningen inkuberades
i 37°C med skak (225rpm) i 1tim. 200µL från röret racklades sedan ut på en LB-agarplatta
innehållande 30µg/mL kanamycin och inkuberades i 37°C över natt.
För att renodla bakterierna suspenderades sedan två kolonier från LB-agarplattorna i ett rör
med 3mL LB-medium och 3µL kanamycin och inkuberades i 37°C, 225rpm i 8tim. Från det
röret togs sedan 200µL och tillsattes i en steril e-kolv innehållandes 100mL LB-medium och
100µL kanamycin, vilket inkuberades över natt i 37°C, 225rpm.
För att få bort DH5α-bakterierna renades plasmid-DNAt enligt protokollet för EndoFree
plasmid maxi kit (Qiagen, Sverige) med undantag för att den slutliga pelleten löstes i 75µL
buffert TE. Koncentrationen och renheten på plasmid-DNAt kontrollerades därefter som
tidigare beskrivet med Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies,
USA).
6
För att amplifiera plasmid-DNAt utfördes återigen en realtids-PCR och efterföljande
smältkurva. Denna gång kördes triplikat av KRT1 c.508_519del och KRT1vt och som negativ
kontroll användes vatten. Proverna späddes så att de hade någorlunda lika DNA-koncentration
innan körningen. Till mastermixen användes för ett prov: 10µL 2x buffert fast SYBRgreen
(Applied Biosystems, Sverige), 7,2µL H2O, 0,4µL forward primer 10µM, 0,4µL reverse
primer 10µM. Som forward primer användes 5’-CCCTCCTGGTGGCATACAA och som
reverse primer användes 5’-CAGCAGCTCCCATTTTGTTTG. Till 96-hålsplattan tillsattes
sedan 20µL (18µL mastermix + 2µL prov) per brunn. Plattan täcktes med självhäftande
plastfilm och centrifugerades i 1700g i 2min innan realtids-PCR med följande inställningar
kördes: 95°C i 20sek, 40 cykler 95°C i 3sek, 55°C i 30sek, efterföljt av en smältkurva: 95°C i
15sek, 60°C i 60sek, 95°C i 30sek, 60°C i 15sek.
Härmed var framtagningen av expressionsplasmid KRT1 c.508_519del utförd och del två i
projektet, att lyckas transfektera den till HaCaT-celler så att de uttrycker proteinet, kunde
påbörjas.
Cellodling
Celler från cellinjen HaCaT odlades i 75cm2 -flaskor med 10mL medium vilket innehöll
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), 10% FCS (fetal calf serum), 2mM Lglutamin, 0,1mM NEAA (non essential amino acids), 50 enheter penicillin, 50µg/mL
streptomycin. Mediet i odlingsflaskan byttes varannan dag och cellerna fick växa i 5% CO2
och 37°C tills de blev cirka 70% konfluenta.
För försöket placerades 13 runda 12mm täckglas i en 24-brunns platta och 200µL ’dilution’
medium och 2µL ’coating matrix’ (Cascade Biologics, USA) tillsattes till samtliga täckglas så
att cellerna sedan ska fästa bättre på dem. Detta ska stå i minst 30min. Cellerna i
odlingsflaskan splittades sedan för att de skulle kunna sås ut på täckglasen, enligt följande:
Mediet i odlingsflaskan sögs bort med en pasteurpipett och därefter tvättades cellerna med
10mL 0,05% EDTA/PBS genom rotation av odlingsflaskan varefter lösningen sögs av. Efter
tvätten tillsattes 10mL 0,05% EDTA/PBS och odlingsflaskan inkuberades i 5% CO2 och 37°C
i 15min för att cellerna skulle dra ihop sig och släppa lite från varandra. 0,05% EDTA/PBS
sögs av och istället tillsattes 4mL trypsinEDTA och odlingsflaskan inkuberades i ca 2min 5%
CO2 och 37°C för att lösgöra cellerna. Genom att slå lätt på flaskans sida lösgjordes cellerna
ytterligare. Trypsineringen avbröts med 6mL komplett medium (mediet innehåller serum som
inhiberar trypsinaktiviteten) och cellerna separerades från varandra genom pipettering.
Cellsuspensionen pipetterades över till ett 15mL-rör och 10µL av suspensionen pipetterades
till en klack på en Bürkerkammare medan resterande vätska centrifugerades i 180g i 7min.
För att få reda på antal celler i 15mL-röret räknades fem stycken B-rutor i Bürkerkammaren
med ett mikroskop.
Supernatanten från det centrifugerade röret sögs av med en pasteurpipett och pelleten
resuspenderades sedan i 10mL HaCaT-medium. ’Dilution’ medium och coating matrix’ sögs
av med en pasteurpipett från täckglasen och istället tillsattes cellsuspension så att det blev
5000 celler/täckglas. 24-brunns plattan inkuberades sedan i 5% CO2 och 37°C under fyra
dagar så att cellerna fick växa.
Transfektion av plasmider till HaCaT-celler med jetPEI reagent
Till cellerna som vuxit på täckglasen transfekterades plasmiderna enligt protokollet för jetPEI
in vitro DNA transfection reagent (In Vitro Sweden AB, Sverige) med undantag att bara
0,5μg plasmid-DNA användes per täckglas. För varje plasmid KRT1vt, KRT1 c.508_519del,
KRT10vt och KRT10 c.C466G transfekterades 3 täckglas och ett täckglas transfekterades med
båda muterade plasmider KRT1 och KRT10. Då transfektionsreagenset och plasmid-DNAt var
7
tillsatt inkuberades 24-brunns plattan i 5% CO2 och 37°C under 48tim.
Med hjälp av en pincett och en kanyl fördes åtta täckglas (två per olika plasmid) över till en
ny 24-brunnsplatta med 0,5mL HaCaT-medium/brunn, cellerna uppåt. Denna platta fick sedan
flyta i ett 42°C-igt vattenbad i 30min för att värmestressa cellerna. Täckglaset som innehöll
båda muterade plasmiderna behölls ostressat. Efter värmestressen placerades 24-brunnsplattan
i 5% CO2 och 37°C under 15min för att cellerna skulle få återhämta sig. För att sedan fixera
cellerna gjordes följande: mediet sögs bort från täckglasen med en pasteurpipett och 0,5mL 1x
PBS tillsattes till varje täckglas som tvättning. 1x PBSen sög därefter av och istället tillsattes
0,5mL 50:50 aceton/metanol-lösning (som stått i frysen) och plattan fick stå 10min i frysen
för att fixera cellerna. Därefter tvättades täckglasen återigen med 1x PBS innan de slutligen
tvättades med vatten. Täckglasen monterades med cellerna nedåt mot objektglas med en
droppe monteringsmedel Vectashield with DAPI (Vector Laboratories, USA). DAPI (4’, 6diamidino-2-phenylindole) i monteringsmedlet binder till cellkärnorna och gör så att de
fluorescerar blått. Sedan räknades antal celler med keratinaggregat utav tvåhundra
transfekterade celler (ses som gröna på grund utav att plasmiderna innehåller en EGFP-tag)
per täckglas, med ett fluoroscensmikoskop (Zeiss Axiophot, Carl Zeiss AB, Sverige).
Behandling av transfekterade celler KRT1 c.508_519del och KRT10 c.C466G med 4-PBA
Cellerna splittades, såddes ut och transfekterades som tidigare beskrivet, men denna gång
såddes 30 000 celler/täckglas ut och de fick växa under ett dygn innan transfektionen. Totalt 4
täckglas transfekterades, 2 täckglas per plasmid KRT1 c.508_519del och KRT10 c.C466G.
Cirka 24tim efter transfektionen tillsattes sedan till ett täckglas av varje plasmid 1µL 4-PBA
(Sigma Aldrich, USA) 537mM och plattan inkuberades i 5% CO2 och 37°C tills det gått
48tim. Ett täckglas av varje plasmid behölls obehandlat. Täckglasen fixerades och monterades
sedan som tidigare beskrivet, innan återigen antal celler med keratinaggregat utav 200
transfekterade celler per täckglas räknades i fluorescensmikroskop (Zeiss Axiophot, Carl
Zeiss AB, Sverige).
RESULTAT
Framtagning av expressionsplasmid KRT1 c.508_519del
Som indikation på att mutagenesen lyckats PCR-amplifierades vildtyp och muterad
expressionsplasmid och PCR-produkternas smälttemperatur analyserades. Smälttemperaturen
för KRT1vt (Figur 1a) var 79,58°C men för KRT1 c.508_519del (Figur 1b) var den 0,34°C
lägre (79,24°C), vilket gav en indikation på att den var några baspar kortare, eftersom en lite
kortare sekvens borde denatureras vid lite lägre temperatur. Sekvenseringsanalyserna visade
att provet innehöll KRT1-DNA med en deletion (c.508_519del).
8
Figur 1. Smältkurvsanalys för vildtyp- och muterad KRT1 -expressionsplasmid. Figuren visar medelvärdet
av smälttemperaturen, vid vilken DNA-strängarna denatureras för triplikatprov av a) KRT1vt och b) KRT1
c.508_519del. (n=3).
Transfektion av plasmider till HaCaT-celler med jetPEI reagent
Expressionsplasmiden som tagits fram transfekterades in i HaCaT-celler med hjälp av jetPEI
DNA transfection reagent (In Vitro Sweden AB, Sverige) men transfektionsgraden av cellerna
var låg. Uppskattningsvis var endast 5-10% av cellerna på ett täckglas transfekterade. Men
oberoende av vilken expressionsplasmid de transfekterade cellerna innehöll så uttryckte de
proteinet och bildade keratinfilament och även olika grad av keratinaggregat (Figur 2).
Aggregaten uppstod oftast perifert i cellerna men ibland sågs även keratinfilament med
aggregat vid cellkärnan, se ett exempel på detta samt en cell utan aggregat i figur 2.
Figur 2. Detektion av EGFP i HaCaT-celler transfekterade med KRT10vt. Bilden visar värmestressade
celler som tagit upp plasmid KRT10vt (gröna). Cellen till vänster uppvisar tydliga keratinfilament men innehåller
inga keratinaggregat medan cellen till höger innehåller keratinaggregat både perifert och vid cellkärnan.
Av de 200 räknade cellerna (per plasmid), sågs att i ostressade celler som innehöll KRT1vt
hade 16% av cellerna keratinaggregat men vid värmestress var andelen något högre (Figur
9
Celler med keratinaggregat
(%)
3a). I ostressade celler som innehöll KRT1 c.508_519del däremot hade strax över hälften av
cellerna keratinaggregat och vid värmestress var andelen lite högre (Figur 3a). För celler som
var ostressade och innehöll KRT10vt var det också 16% av cellerna som hade keratinaggregat
men vid värmestress var andelen högre (Figur 3b). I celler som transfekterats med KRT10
c.C466G hade de flesta cellerna keratinaggregat och det var ingen nämnvärd skillnad på om
cellerna var värmestressade eller inte. Celler som innehöll KRT10 c.C466G jämfört med
KRT1 c.508_519del hade 24% mer aggregat utan värmestress och 13% mer vid värmestress
(Figur 3a och b).
100
Ej VS
80
VS
60
40
20
0
KRT1vt
KRT1 508-519del
Celler med keratinaggregat
(%)
Plasmid
100
Ej VS
80
VS
60
40
20
0
KRT10vt
KRT10 C466G
Plasmid
Figur 3. Procentuell andel av celler transfekterade med a) KRT1vt och b) KRT1 c.508_519del som
uppvisade keratinaggregat med och utan värmestress (VS). Data redovisar medelvärdet för 200 EGFPpostitiva celler på 1-2 täckglas (n=2 när standardavvikelse är inkluderad). VS står för värmestress.
Celler som innehöll både KRT1 c.508_519del och KRT10 c.C466G överlevde och uttryckte
proteinet. De skiljde sig inte till utseende från de andra cellerna. Keratinaggregat kunde ses i
81% av cellerna (visas ej).
Behandling av transfekterade celler KRT1 c.508_519del och KRT10 c.C466G med 4-PBA
Eftersom 4-PBA visat sig kunna minska antalet celler med keratinaggregat i en tidigare in
vitro studie behandlades celler med 4-PBA under ett dygn innan de fixerades. I detta försök
sågs dock ingen nämnvärd skillnad i antal celler med keratinaggregat. Keratinaggregaten blev
heller inte synbart mindre i storlek eller färre per cell.
10
DISKUSSION
Utbudet av behandlingar för patienter med EI är låg och detta projekt var en del i arbetet att
skapa en bra modell för att testa olika substanser som potentiellt skulle kunna komma att ingå
i en behandling. Andra modeller som prövats för detta ändamål är bland annat en modell där
patientceller immortaliserades för att skapa en cellinje [5]. Nackdelarna med en sådan modell
är besväret det innebär för patienten, samtidigt som det inte finns så många patienter, samt att
den kräver mycket tid. Ännu en annan modell är att använda sig av möss, till vilkas genom en
muterad keratingen är introducerad [7], men att använda en sådan modell för att screena
massor av substanser skulle vara oetiskt samt tidsödande och väldigt kostsamt. Musmodellen
är mer lämplig för att verifiera positiva resultat som framtagits med en smidigare modell, till
exempel där plasmider transfekteras in i en stabil cellinje, därav detta projekt.
HaCaT-celler, vilket användes i detta försök, är svårtransfekterade, så den uppskattade
transfektionsgraden på 5-10% var inte så förvånande. Även om jetPEI in vitro DNA
Transfection Reagent (In Vitro Sweden AB) som användes för transfektionen rekommenderar
1µg plasmid-DNA användes det i försöket endast 0,5µg. Anledningen till att en lägre mängd
plasmid-DNA användes i försöket var att om för mycket DNA tillsätts till cellerna kan det få
konsekvensen att proteinet aggregerar på grund av det, vilket gör att cellen inte mår bra. Så
kanske skulle mängden plasmid-DNA om något varit ännu lägre för att få bättre
transfektionsgrad. Vad sedan gäller stressen av keratinocyter för att de ska bilda
keratinaggregat så finns det olika sätt att göra detta. Ett exempel är genom osmotisk stress, där
cellerna till exempel kan behandlas med 150mM urea [8]. I detta försök användes istället
värmestress, där cellerna inkuberades i ett 42°C-igt vattenbad under 30min. Men enligt
resultaten i detta försök skulle modellen kunna användas utan att värmestressa cellerna
eftersom det hade sådan liten effekt på celler med muterad plasmid. Det blev mycket celler
som hade keratinaggregat även utan stressmomentet. I celler med vildtypsplasmid däremot
vill man ha så få celler som möjligt med aggregat eftersom de ska representera friska celler.
Men i försöket var det dock en ganska stor andel celler med vildtypsplasmid som hade
keratinaggregat och speciellt om de var värmestressade. Detta kan eventuellt bero på att även
om vildtypsplasmiden inte innehåller någon muterad gen så innehåller den bland annat en
EGFP-tag, vilken kanske påverkar cellskelettet så att det blir mindre stabilt och därmed gör att
även dessa celler bildar aggregat vid stress. Men skillnaden i hur mycket keratinaggregat som
bildas i celler med muterad jämfört med vildtypsplasmid är fortfarande så pass stor att
modellen inte blir opålitlig. Resultaten visar alltså att celler som transfekterats med muterad
plasmid bildar keratinaggregat i mycket högre utsträckning än celler som transfektereats med
vildtypsplasmid. En observation var också att celler som innehöll KRT1 c.508_519del oftare
hade fler och kraftigare keratinaggregat än celler med KRT10 c.C466G. De verkade alltså mer
påverkade i det avseendet.
Transfekterade celler med KRT1 c.508_519del och transfekterade celler med KRT10
c.C466G behandlades med 4-PBA då denna substans visat sig minska bildande av
keratinaggregat [5] samt ha chaperonliknande egenskaper [9]. I detta försök sågs dock ingen
nämnvärd skillnad mellan celler som behandlats eller inte. Så med tanke på detta försöks
resultat tillsammans med resultaten från in vitro-studien på patientceller [5] så är det då troligt
att 4-PBA inte verkar på ett redan uttryckt protein utan att det snarare har en effekt på
gennivå.
Det finns även andra förslag för behandlingar än att använda sig av substanser. Till exempel
forskas det i om man kanske kan använda sig av ’short-interfering’ RNA (siRNA). siRNA är
dubbelsträngade RNA-molekyler som har nitton nukleotider med ett överhäng på två
nukleotider i 3’-ändarna och dessa skulle då användas som en metod för att allelspecifikt
11
kunna tysta en muterad gen på proteinnivå utan att det har någon nämnvärd påverkan på den
normala allelen [10]. Studier med just siRNA har prövats vid en annan keratingenssjukdom,
pachyonychia congenita, och fått positiva resultat. De studierna, där modeller med både
HaCaT-celler och möss använts, pekar på att specifika siRNA’s är effektiva för att hämma
uttrycket av muterade gener [11].
Sammanfattningsvis så tog vi i detta försök fram sista verktyget i form av expressionsplasmid
KRT1 c.508-519del, för att kunna skapa en modell som innehåller expressionsplasmider och
en stabil cellinje, samt gjorde ett mindre försök med 4-PBA för att se om modellen fungerar
att screena substanser med. Modellen behöver i framtiden prövas och utvecklas mera för att
säkerställa dess användbarhet och specificitet.
ACKNOWLEDGEMENTS
Jag skulle vilja tacka alla på institutionen för dermatologi och venereologi vid Akademiska
sjukhuset i Uppsala som gjort min tid för examensarbetet spännande och mycket trevlig. Tack
för all handledning så väl praktisk som teoretisk, de givande diskussionerna och allt det roliga
jag haft! Jag vill även tacka mina nära och kära som alltid ger mig stöd, hopp och kärlek.
REFERENSER
[1] J C Chamcheu, I A Siddiqui, D N Syed, V M Adhami, M Liovic, H Mukhtar. Keratin gene
mutations in disorders of human skin and its appendages. Archives of biochemistry and
biophysics, 2011(508), p.123-137
[2] E B Lane, W H I McLean. Keratins and skin disorders. Journal of pathology, 2004(204),
p.355-366
[3] N L Lacz, R A Schwartz, G Kihiczak. Epidermolytic hyperkeratosis: a keratin 1 or 10
mutational event. International journal of dermatology, 2005(44), p.1-6
[4] H Törmä. Regulation of keratin expression by retinoids. Dermato-Endocrinology,
2011(3), p.136-140
[5] JC Chamcheu, I Pihl Lundin, C E Mouyobo, T Gester, M Virtanen, A Moustakas, H
Navsaria, A Vahlquist, H Törmä. Immortalized keratinoctes derived from patients with
epidermolytic ichthyosis reproduce the disease phenotype: a useful in vitro model for testing
new treatments. British journal of dermatology, 2011(164), p.263-272
[6] P Boukamp, R T Petrussevska, D Breitkreutz, J Hornung, A Markham, N E Fusenig.
Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell
line. The journal of cellbiology, 1988(106), p.761-771
[7] M J Arin, D R Roop. Inducible mouse models for inherited skin diseases: implications for
skin gene therapy. Cells tissues organs, 2004(177), p.160-168
[8] D R Beriault, O Haddad, J V McCuaig, Z J Robinson, D Russell, E B Lane, D S Fudge.
The mechanical behavior of mutant K14-R125P keratin bundles and networks in NEB-1
keratinocytes. PLoS One, 2012(7), e31320
12
[9] D H Perlmutter. Chemical chaperones: a pharmacological strategy for disorders of protein
folding and trafficking. Pediatric research, 2002(52), p.832-836
[10] W H I McLean, C B T Moore. Keratin disorders: from gene to therapy. Human
molecular genetics, 2011(20), p.189-197
[11] F J D Smith, R P Hickerson, J M Sayers, R E Reeves, C H Contag, D Leake, R L Kaspar,
W H I, McLean. Development of therapeutic siRNAs for Pachyonychia congenita. Journal of
investigative dermatology, 2008(128), p.50-58
13