Forskningsprogram

1
Forskningsprogram
Studie om bennedbrytningsfaktorer i tandköttsexudat och
blod före och efter behandling hos patienter med
tandlossningssjukdom
Projektledare
Professor Ulf H Lerner
Övertandläkare, med dr, Anders Holmlund
2
Specifik målsättning: Att studera benresorptionsaktiviteten (BRA) och halterna av
cytokinerna (interleukin-1(IL-1), IL-6 och (tumör nekrotiserande faktor alfa (TNF-) i
fickexudat från parodontalt sjuka tandköttsfickor före och 3, 6, och 12 månader efter
parodontalbehandling med avseende på om
1. det finns någon korrelation mellan BRA och nivåerna av dessa cytokiner
2. det finns någon korrelation mellan BRA, cytokiner och kliniska tecken på inflammation
3. BRA och/eller nivåerna av cytokiner kan prediktera sjukdomsprogression
4. det finns någon samvariation mellan vissa bakterier i fickan och halterna av
inflammationsmediatorer samt BRA
Att studera parodontitens eventuella systemisk påverkan genom att undersöka
5. hur antikroppsnivåerna mot bakterierna Porphyromonas gingivalis (pg) och
Agrgregatebacter actinomycetemcommitans (Aa) som anses viktiga för uppkomsten av
parodontit samt olika inflammationsmarkörer i serum förändras efter behandling.
6. Finns det någon samvariation i förekomst av cytokiner i tandköttsfickan och hur dessa
förändras med behandling till förekomsten av samma cytokiner i serum.
Bakgrund:
Inom parodontologin har under lång tid forskare försökt klarlägga vilken eller vilka bakterier
som orsakar parodontit utan att lyckas. I dag finns ett antal bakterier som anses vara mer
associerade till uppkomsten av tandlossning. [1]. Av dessa tillhör bakterier Pg och Aa de som
mest förknippats med tandlossning. Aa har varit mer kopplad till den juvenila formen av
sjukdomen, medan Pg associerats till den form som drabbar vuxna individer [2]. Etiologin till
parodontiten är fortfarande till stora delar oklar. På senare tid har ett allt större intresse riktats
mot det inflammatoriska svar som mikroorganismer ger upphov till och det förefaller som att
dessa inflammatoriska mediatorer spelar en stor roll i parodontitens patogenes [3]. Ett flertal
studier har visat att det föreligger väsentliga skillnader mellan friska och sjuka fickor
avseende inflammatoriska mediatorer som IL-1, IL-6, TNF samt prostaglandin E2 (PGE2) [47]. För att en benförlust ska uppstå kunna uppstå vid parodontit krävs en lokal aktivering av
osteoklaster och dessa mediatorer har visat sig stimulera benresorption både in vivo och in
vitro [8, 9] Det finns inte så mycket vetenskap publicerad som undersökt
benresorptionsaktiviteten och halter av inflammatoriska mediatorer i fickexudat före och vid
olika tidpunkter efter behandling. I en tidigare studie denna forskningsgrupp visades att
nivåerna av cytokiner var signifikant reducerade 12månader efter behandling.
Benresorptionsaktiviteten reducerades också men nådde inte signifikanta nivåer troligen
beroende på ett för litet material eller att sjukdomsprocessen återkommit i vissa fickor. I
denna studie fanns ingen korrelation mellan kliniska parametrar och förekomsten av BRA och
cytokiner vilket eventuellt kan bero på att det inflammatoriska svaret kommer mycket tidigare
än förändringen i de kliniska parametrarna [10] För att få en bättre uppfattning om vad som
händer i läkningsförloppet efter parodontalbehandling skulle det vara värdefullt att studera
nivåer av BRA, cytokiner, bakteriologi och kliniska parametrar vid flera tidpunkter efter
behandling.
I den andra delen av denna studie avser vi att studera om det finns en systemisk påverkan av
parodontiten genom att undersöka antikroppsnivåer mot Aa och Pg samt förutom vissa
3
cytokiner som undersöks i fickexudatet också analysera systemiska inflammationsmarkörer
som, C-reaktivt protein, fibrinogen, antal leukocyter, IL-1, IL-6, matrix metalloproteinas-9
(MMP-9) i serum före och efter behandling vid samma tidpunkter som ovan angivits.
Att en låggradig inflammation kan vara en bidragande orsak till utveckling av arterioskleros
är idag väletablerat i litteraturen [11]. Substanser som indikerar låggradig inflammation i
serum är t.ex nivåer av CRP, fibrinogen och olika adhesionsmolekyler och har samtliga visat
sig relatera till förekomst av hjärt-kärlsjukdom[12-16].
Under senaste decenniet har flera studier publicerats som tyder på att det kan finnas ett
samband mellan tandhälsa och hjärt-kärlsjukdom [17-19]. Däremot finns inte så många
studier där tandhälsans systemiska påverkan undersökts, men det finns ett fåtal
behandlingsstudier som indikerar att den orala inflammationen kan ge en systemisk effekt [20,
21].
För att bättre förstå hur den orala inflammationen eventuellt kan medverka till utvecklingen
av ateroskleros är det viktig att vid olika tidpunkter efter behandling studera
inflammationsmarkörer både från både den lokala miljön (gingivalexudat från
tandköttsfickan) och den generella systemiska miljön i form av blodanalyser. Skulle det
förekomma en samvariation i nivåerna av inflammationsmarkörer lokalt och i den systemiska
cirkulationen skulle detta vara en stark indikation på et orsakssamband något som vi idag
saknar bevis för.
Flera studier har visat att det kan finnas ett samband mellan förekomst av cirkulerande
antikroppar mot två bakterier Aa och Pg som anses viktiga för patogenesen när det gäller
parodontalsjukdom [22-24]. Hur nivåerna av dessa antikroppar påverkas efter behandlingen
har inte studerats så vi vet inte vilken effekt behandling har på dessa nivåer. Då båda dessa
bakterier på senare tid isolerats från ateromatösa plack är det tänkbart att de kan ha betydelse
för utvecklingen av ateroskleros [25, 26].
Material och metod:
 Studien planeras omfatta 30 patienter med parodontit. Var och en av patienterna ska ha
minst tre sjuka fördjupade tandköttsfickor (≥ 5mm djup) i två kvadranter som är i behov av
parodontalkirurgi .
 De sjuka fickorna ska på röntgen uppvisa en bennedbrytning på ≥4mm från emaljcementgränsen. Dessa fickor ska också uppvisa kliniska tecken på inflammation (blödning
vid sondering eller var).
 De personer som ingår i studien får inte utsatts för parodontalbehandling i form av
operation eller depuration under de senaste 3 månaderna. Vidare får dom inte behandlats
med antibiotika under de senaste tre månaderna eller antiinflammatoriska preparat under
de två sista veckorna före provtagning.
Klinisk undersökning
4
Denna utförs enligt gällande rutiner för parodontal undersökning på specialistklinik vilket
innefattar anamnes, bettanalys, förekomst av plack, fickdjupsmätning, förekomst av
furkationsinvolveringar, registrering av blödning och förekomst av var från fickorna,
tandmobilitet samt erforderliga röntgen för att kunna avgöra benförlust.
Provtagning av fickexudat.
Prov tas med standardiserade strips under 30 sekunder.
Stripset placeras i en mikrotub. Röret märks. 50l NaCl appliceras över stripset. Stripset
elueras därefter genom centrifugering 20min 3000g vid +5grader Celsius. Ytterligare 50l
NaCl tillsätts och centrifugeringen upprepas. 100l av denna lösning pipetteras upp och förs
över i en ny mikrotub varefter spädning med 100l till görs. Röret fryses därefter in i minus
80grader Celsius.
Efter upptining kommer ytterligare spädningar att göras för att in vitro analysera provets
benresorberande förmåga (för detaljer om analysmetod se [9, 27].
Förutom den bensorberande aktiviteten i proverna planerar vi mäta halterna av
inflammationsmarkörer som IL-1 a, TNF-a och IL-6. Detta kommer att ske med kommersiellt
tillgängliga ELISA kits.
Bakterier provtagning
I samma fickor där fickexudat tagits tas också ett bakterieprov med ett sterilt pappers point
som lämnas i fickan under 30sek. Pointset läggs därefter i VM III medium och skickas för
omgående för odling.
Blodprovstagning
Denna sker vid sjukhusets kemiska laboratorium av personal som normalt sköter denna
verksamhet för sjukhuset.
Såväl prov av fickexudat, bakterieprovtagning och blodprov (cirka 20 ml) kommer att tas före
behandling och 3,6, 12 månader efter den initiala behandlingsfasen avslutats. Vid dessa
tillfällen kommer också kliniska parametrar i form av fickdjup, plackindex, förekomst av var
och blödning vid sondering att registreras.
Analyserna utförs av avdelningen för oral cellbiologi och oral mikrobiologi vid Umeå
universitet och under ledning av professor Ulf Lerner och den bakteriologiska undersökning
en utförs av docent Anders Johansson och Rolf Claesson vid Umeå Universitet.
.
Etiska aspekter.
Enligt vår bedömning föreligger inga etiska betänkligheter. Deltagandet i studien bygger på
att individen efter noggrann information medverkar frivilligt. I samband med att individen
erbjuds tid för den orala undersökningen får de av tandläkare information om studien och
erbjuds möjlighet att deltaga i denna. En skriftlig information kommer också att lämnas ut..
Den orala undersökning kommer att bestå av en klinisk del samt av en röntgen undersökning.
I de fall där aktiv parodontalsjukdom eller andra orala fynd görs som indicerar någon form av
behandling, kommer vi att medverka till att individen erbjuds behandling i enlighet med
vetenskap och beprövad erfarenhet. Blodprovstagning sker på sjukhusets kemiska
laboratorium av personal som normalt sköter denna provtagning för sjukhuset. Etisk prövning
har gjorts och projektet har fått godkänt 2009-03-25 DNR 2009/029
5
Värdet av studien
För att bättre kunna förstå hur den lokala sjukdomsprogression sker vid tandlossning men
också vilket systemiskt engagemang den orala inflammationen kan denna studie där vi mäter
halter av IL-1, IL-6, TNF- i fickexudat och serum före och vid olika tidpunkter efter
behandling bidra med nya kunskaper kring dessa inflammationsframkallande molekyler roll
vid parodontalsjukdom, men också om det finns en systemisk påverkan av de lokalt frisatta
inflammatoriska mediatorer. Möjligheten finns att någon/några av dessa molekyler
samvarierar med sjukdomsprogression/regression. Ett annat fält som ytterligare behöver
belysas är hur nivåer av inflammatoriska mediatorer och BRA förhåller sig till förekomsten av
olika bakterier som misstänks orsaka parodontit. Skulle det visa sig att någon/några av de
undersökta cytokinerna som ökar vid progression också samvarierar med förekomst av vissa
bakterier skulle detta stärka sannolikheten att just dessa bakterier är involverade i
sjukdomsprocessen. Genom att vi under en längre tid (12 månader) följer upp med
återkommande provtagningar får vi också möjlighet att studera om någon/några av dessa
molekyler kan prediktera sjukdomsprogression.
I dagsläget finns det ingen bra metod att differentiera i vilka fördjupade tandköttsfickor vi har
en pågående sjukdomsprocess. Vi saknar också bra metoder att förutsäga var progression
kommer att ske. För att kunna förhindra fortsatt vävnadsdestruktion är det därför av största
vikt att vi kan ta fram metoder som ger en bättre vägledning om var dessa vävnadsdestruktiva
processer pågår och förutsäga var de kan förväntas uppstå. För närvarande får vi helt förlita
oss på kliniska parametrar som blödning vid sondering, ökat fickdjup samt förlorad fästenivå
för att avgöra sjukdomsprogression. Dessa är tyvärr mer ett mått på hur mycket skada som
skett än på var vi har pågående eller riskerar att få sjukdomsaktivitet.
När det gäller andra delen av studien är som tidigare nämnts kunskapen begränsad om vilken
systemisk effekt oral inflammation eventuellt kan ha. Här behövs mer forskning. Eftersom vi i
denna studie undersöker nivåerna av inflammationsmarkörer före och vid olika tidpunkter
efter behandling får vi möjlighet att studera om det kan finnas en samvariation mellan den
lokala och den systemiska förekomsten av dessa markörer. Om så är fallet skulle det vara ett
indirekt bevis för att det kan finnas ett kausalt samband mellan oral hälsa och hjärtkärlsjukdom.
Det som idag är den vanligaste kritiken mot befintliga studier av samband mellan oral hälsa
och förekomst av hjärt-kärlsjukdom är just avsaknaden av bevis för att oral hälsa kan ge en
systemisk påverkan. För att ytterligare studera en eventuell systemisk effekt av oral hälsa
avser vi också att studera nivåerna i serum av antikroppar mot två bakterier som anses orsaka
tandlossning. Här saknar vi också kunskap om hur behandling påverkar systemiska nivåer av
sådana antikroppar. Denna studie skulle ge oss möjlighet att titta på nivåerna vid olika
tidpunkter efter behandling, men också kunna analysera om förändringar i nivåerna av
antikroppar samvarierar med en förändring i den lokala bakteriefloran vilket skulle tala för att
dessa bakterier verkligen har en aktiv del i sjukdomsprocessen.
.
Ekonimisk kalkyl
I första hand gäller det att komma igång och samla in data. Vi ska undersöka och ta prover på
30 patienter med tandlossning före, 3,6 och 12 månader efter behandling. Det innebär
provtagning vid 4 tillfällen.
provtagningskostnad är 400kr/prov vilket ger 48000kr
6
transportkostnad
ca. 2000kr
Analyskostnader för inflammationsmarkörer
3x15000
Analyskostnad för benresorptionsaktiviteten är 30000kr
Totalkostnaden för att få fram data kommer att bli ca. 125.000kr
Referenser
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Socransky, S.S., et al., Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol,
1998. 25(2): p. 134-44.
Slots, J., Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in
periodontal disease: introduction. Periodontol 2000, 1999. 20: p. 7-13.
Page, R.C., The role of inflammatory mediators in the pathogenesis of periodontal
disease. J Periodontal Res, 1991. 26(3 Pt 2): p. 230-42.
Giannopoulou, C., J.J. Kamma, and A. Mombelli, Effect of inflammation, smoking and
stress on gingival crevicular fluid cytokine level. J Clin Periodontol, 2003. 30(2): p.
145-53.
Lerner, U.H., et al., Gingival crevicular fluid from patients with periodontitis contains
bone resorbing activity. Eur J Oral Sci, 1998. 106(3): p. 778-87.
Offenbacher, S., P.A. Heasman, and J.G. Collins, Modulation of host PGE2 secretion
as a determinant of periodontal disease expression. J Periodontol, 1993. 64(5 Suppl):
p. 432-44.
Salvi, G.E., J.D. Beck, and S. Offenbacher, PGE2, IL-1 beta, and TNF-alpha
responses in diabetics as modifiers of periodontal disease expression. Ann
Periodontol, 1998. 3(1): p. 40-50.
Assuma, R., et al., IL-1 and TNF antagonists inhibit the inflammatory response and
bone loss in experimental periodontitis. J Immunol, 1998. 160(1): p. 403-9.
Lerner, U.H., Modifications of the mouse calvarial technique improve the
responsiveness to stimulators of bone resorption. J Bone Miner Res, 1987. 2(5): p.
375-83.
Holmlund, A., L. Hanstrom, and U.H. Lerner, Bone resorbing activity and cytokine
levels in gingival crevicular fluid before and after treatment of periodontal disease. J
Clin Periodontol, 2004. 31(6): p. 475-82.
Danesh, J., et al., Low grade inflammation and coronary heart disease: prospective
study and updated meta-analyses [see comments]. BMJ, 2000. 321(7255): p. 199-204.
Danesh, J., et al., Association of fibrinogen, C-reactive protein, albumin, or leukocyte
count with coronary heart disease: meta-analyses of prospective studies. JAMA,
1998. 279(18): p. 1477-82.
Hwang, S.J., et al., Circulating adhesion molecules VCAM-1, ICAM-1, and E-selectin
in carotid atherosclerosis and incident coronary heart disease cases: the
Atherosclerosis Risk In Communities (ARIC) study. Circulation, 1997. 96(12): p.
4219-25.
John, S., et al., Plasma soluble adhesion molecules and endothelium-dependent
vasodilation in early human atherosclerosis. Clin Sci (Colch), 2000. 98(5): p. 521-9.
Lagrand, W.K., et al., C-reactive protein as a cardiovascular risk factor: more than an
epiphenomenon? Circulation, 1999. 100(1): p. 96-102.
7
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
Sweetnam, P.M., et al., Fibrinogen, viscosity and the 10-year incidence of ischaemic
heart disease [see comments]. Eur Heart J, 1996. 17(12): p. 1814-20.
Beck, J., et al., Periodontal disease and cardiovascular disease. J Periodontol, 1996.
67(10 Suppl): p. 1123-37.
Janket, S.J., et al., Meta-analysis of periodontal disease and risk of coronary heart
disease and stroke. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2003. 95(5):
p. 559-69.
Mattila, K.J., Dental infections as a risk factor for acute myocardial infarction. Eur
Heart J, 1993. 14 Suppl K: p. 51-3.
D'Aiuto, F., et al., Periodontitis and Systemic Inflammation: Control of the Local
Infection is Associated with a Reduction in Serum Inflammatory Markers. J Dent Res,
2004. 83(2): p. 156-60.
D'Aiuto, F., D. Ready, and M.S. Tonetti, Periodontal disease and C-reactive proteinassociated cardiovascular risk. J Periodontal Res, 2004. 39(4): p. 236-41.
Pussinen, P.J., et al., Systemic exposure to Porphyromonas gingivalis predicts incident
stroke. Atherosclerosis, 2006.
Pussinen, P.J., et al., Antibodies to periodontal pathogens and stroke risk. Stroke,
2004. 35(9): p. 2020-3.
Pussinen, P.J., et al., Serum antibody levels to Actinobacillus actinomycetemcomitans
predict the risk for coronary heart disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005.
25(4): p. 833-8.
Dorn, B.R., et al., Invasion of endothelial and epithelial cells by strains of
Porphyromonas gingivalis. FEMS Microbiol Lett, 2000. 187(2): p. 139-44.
Haraszthy, V.I., et al., Identification of periodontal pathogens in atheromatous
plaques. J Periodontol, 2000. 71(10): p. 1554-60.
Ljunggren, O., M. Ransjo, and U.H. Lerner, In vitro studies on bone resorption in
neonatal mouse calvariae using a modified dissection technique giving four samples
of bone from each calvaria. J Bone Miner Res, 1991. 6(6): p. 543-50.