VetMIC CLIN GN Art.nr. 395125 För resistensbestämning av Gram-negativa bakterier från små sällskapsdjur, hästar och lantbrukets djur Foto: Bengt Ekberg, SVA VetMIC CLIN GN är en MIC-baserad (Minimal Inhibitory Concentration) mikrotiterpanel för resistensbestämning av Gram-negativa bakterier som Escherichia coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp. och Enterobacter spp. Panelen är anpassad för kliniska frågeställningar hos alla djur - såväl små sällskapsdjur som hästar och lantbrukets djur. Två bakterieisolat testas på en panel (96-håls mikrotiterplatta). Medier Standardmediet är katjonjusterad Müller Hinton buljong (CAMHB). När trimetoprim och sulfonamider ska testas tillsätts 0,2 IU/ml tymidinfosforylas om inte mediet har testats för tymidininnehåll. Förberedande av inokulat Förodlat inokulat Ta material från 3-5 kolonier (< 7 dagars kultur) med en plastögla och lös upp i 5 ml CAMHB. Efter 3-5 timmars inkubering i 35-37 C uppnås vanligen en koncentration av 108 CFU/ml. besök. Ulls väg 2B post. 751 89 Uppsala telefon. 018-67 40 00 e-post. [email protected] webb. www.sva.se Beroende på koncentrationen i förkulturen förs omkring 10 µl över till 10 ml CAMHB för att få en slutkoncentration som är ca 5 x 105 CFU/ml. Direktspädning En 1 µl ögla fylls med material från minst 3-5 kolonier (< 48 timmars kultur) som sedan löses upp i 4 ml steril 0,9 % NaCl eller buljong för att få cirka 108 CFU/ml. Från den här spädningen förs omkring 20 µl över till 10 ml CAMHB för att få en slutkoncentration som är ca 5 x 105 CFU/ml. Inokulatets täthet ska kontrolleras regelbundet genom bakterieräkning. Ett enkelt sätt är att ta 10 µl av inokulatet och späda i 10 ml 0,9 % NaCl. Från denna spädning tas 100 µl och sprids på en agarplatta. Efter inkubering ska 50 CFU växa på plattan. För vissa bakteriearter blir det ingen pellet utan växten syns bara som en grumling. Se först efter att det är fullgod växt i kontrollbrunnarna. Om det inte växer alls i buffertkontrollen betyder det att isolatet kan vara känsligt för bufferten som används för att lösa ampicillin och amoxicillin/ klavulansyra. Om så är fallet går det inte att avläsa MIC för dessa antibiotika. Gör om testet med 100 µl per brunn för att späda ut bufferten. Inokulering och inkubering Varje brunn fylls med 50 µl inokulat. Plattan täcks med genomskinlig tejp och inkuberas 16-18 timmar i 35-37 C. Ställ aldrig mer än fyra plattor på hög. Efter inokulering sprids 10 µl av inokulatet på en agarplatta för renhetskontroll. Kvalitetskontroll Laboratorier som regelbundet gör resistensbestämningar ska inkludera kontrollorganismer minst varje vecka och för varje ny batch av buljong. Om metoden inte används regelbundet ska varje omgång inkludera kontrollorganismer. Lämpliga kontrollstammar för VetMIC CLIN GN är: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia Coli ATCC 35218 och Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. MIC läses som den lägsta koncentrationen som hämmar synlig växt eller för sulfonamider den lägsta koncentrationen som hämmar 80 % av växten. Förvaring och hållbarhet Panelerna förvaras i rumstemperatur. Hållbarheten är minst tre år. Öppnad förpackning återförslutes och används inom två veckor. Avläsning Panelen läggs på ett rack med en förstorande spegel undertill. En skrivbordslampa som ger indirekt ljus i ett annars mörkt rum underlättar avläsningen. Växt av bakterier är lätt att se i spegeln som en pellet på botten av brunnen. Panel design VetMIC CLIN GN Art. nr. E395125 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Am 16 Ctx 2 A/C 32/16 Cs 8 Ni 64 T/S 4/76 Gm 16 Sm 64 Nm 32 Tc 16 Ef 1 bk B 8 1 16/8 4 32 2/38 8 32 16 8 0,5 dk C 4 0,5 8/4 2 16 1/19 4 16 8 4 0,25 Ef 4 D 2 0,25 4/2 1 8 0,5/9,5 2 8 4 2 0,12 2 E Am 16 Ctx 2 A/C 32/16 Cs 8 Ni 64 T/S 4/76 Gm 16 Sm 64 Nm 32 Tc 16 Ef 1 bk F 8 1 16/8 4 32 2/38 8 32 16 8 0,5 dk G 4 0.5 8/4 2 16 1/19 4 16 8 4 0,25 Ef 4 H 2 0.25 4/2 1 8 0,5/9,5 2 8 4 2 0,12 2 Am, Ampicillin; Ctx, Cefotaxime; A/C, Amoxicillin/Klavulansyra; Cs, Colistin; Ni, Nitrofurantoin; T/S, Trimetoprim/Sulfametoxazol; Gm, Gentamicin; Sm, Streptomycin; Nm, Neomycin; Tc, Tetracyklin; Ef, Enrofloxacin dk, kontroll med destillerat vatten; bk, kontroll med buffert (se text)