Föreläsningens innehåll Rekombinanta läkemedel och Genterapi 7 november 2008 Sissela Liljeqvist [email protected] Rekombinanta läkemedel • Rekombinanta proteiner • Enzymer • Monoklonala antikroppar • Produktion av rekombinanta antikroppar i E. coli • Nukleinsyror som potentiella läkemedel • RNA • RNA-DNA • Genterapi – virusvektorer – icke-virala metoder • Prodrug activation Rekombinanta läkemedel • rekombinant insulin lanserat 1982 • nu över 165 st. rekombinanta läkemedel på marknaden • fVIII, fVIIa, fIX, hGH, FSH, EPO, tPA, INF-,-,-, PDGF, diverse mAb, m.fl. • 750 ’kandidater’ i kliniska prövningar se tab. 10:1 Generella principer Identifiering av protein genetisk kod expressionsvektor klona till värdorganism Modifiering av proteiner produktion och rening av protein Optimering av genexpression och ’delivery’ • • • • värdorganism nativt protein glykosyleringar hela bakterier som uttrycker rekombinant protein • ex. L. lactis IL-10 • Interferoner: blanda delar av gener från olika IFN- • hGH: punktmutationer för att byta aa och minska bindning till Zn2+ (minskad affinitet för prolaktinreceptor) • TNF-: targeting peptide 6 aa stor L. lactis ENZYMER • Behandling mot cystisk fibros: • DNAse I – variant med minskad aktinbindning ENZYMER (forts.) • Phenylalanin ammonia lyase – PKU: brist på fenylalanin-hydroxylas – kapslat enzym ges oralt • Alginate lyase • 1-antitrypsin – antiviralt Antikroppar som läkemedel Antikroppar som läkemedel • Immunoglobulin G • passiv immunisering: • monoklonala antikroppar (mAb) • hästantikroppar mot difteri • chimeric mAb • Gammaglobulin (IgG) mot hepatit A Antikroppar: struktur • Framställning av monoklonala antikroppar Fv CDR1 CDR2 CDR3 Fab Fc Monoklonala antikroppar • förhindra avstötning av transplantat • behandling av hjärntumörer • behandling av bröstcancer Monoklonala antikroppar • mot RSV-infektion hos barn • behandling av kroniska inflammationssjukdomar, tex. Crohns sjd, rematoid artrit Targeting • aktiva substansen når inte målcellerna med tillräckligt hög koncentration • åtgärd: targeting • (liposomer) • (toxingener i tumörinflitrerande lymfocyter) • koppling till monoklonal antikropp (mAb) • enzym som omvandl prodrug till drug kopplad till mAb Human-Mouse monoclonal antibodies • chimeric antibody MUS HUMAN • humanized antibody – generna kodande för CDR1, CDR2, CDR3 är från musmonoklonala antikroppar. – kombineras med gener för humant IgG Humana monoklonala antikroppar • human myeloma cell-linje finns ej • försök med immunisering av människor oetiska • mänskliga stamceller i SCID-möss • transgena möss: humana Ig-gener (sedan standard hybridoma-metoder) Producera antikroppar i E.coli? • borde vara billigare • selektion- det svåra! • produktion Phage display Fag-bibliotek • cDNA från humana B-celler syntetiseras • H- och L-sekvenser amplifieras med PCR, klonas i bakteriofag -vektor • H- och L-kedjor uttrycks under fagens lytiska cykel • bibliotek av kombinatoriska kloner • screening för antigenbindning • subkloning i E.colivektor, uttryck i E.coli av Fv-fragment Filamentous bacteriophages Kombinatoriskt bibliotek av antikroppsfragment • VL och VH cDNA amplifieras med PCR • ligering med linker och sätts in i gen 3 • packas i fag M13 VH VL • single-chain antibody på ytan Nukleinsyror som läkemedel • • • • (DNA-bindare - antigen-oligonukleotid) RNA-bindare - antisense-RNA RNA-bindare - antisense-oligonukleotid (dsDNA-oligonukleotider som binder enzymer) • ribozym • RNA-DNA-komplex • RNAi Antisense • RNA • gen transkriberas till RNA • RNA binder mål-RNA X Ribozymer • katalytiska RNA-molekyler hammarhuvud hårnål • kemisk modifiering: injektion, liposomer • virus • oligonucleotide • binder mål-RNA X • modifierade nukleotider • fosforotioatbindning • peptide nucl. acid RNA-DNA-molekyler • • • • ribonukleotider och deoxyribonukleotider dubbel hårnålsformation metylering av syre på 2’-kolet i ribos central komplementär region, med en mismatch • korrigerar punktmutation TT TT 3’ 5’ TT TT interfererande RNA • • • • • RNAi skyddar växter och djur från virus? nukleas binds till dsRNA dsRNA klyvs och dissocierar till ssRNA ssRNA-nukleas binder till mRNA, som klyvs GENTERAPI Exempel på ärftliga sjukdomar: • 7000 kända monogena sjukdomar • defekter i metabolism – Gauchers sjukdom – Fenylketonuri • felaktigt strukturellt protein – hemofili A (blödarsjuka) Behandling av ärftliga sjukdomar • • • • • • • specialdiet inhibering av enzymer ta bort toxiska ämnen ersättning av saknat/felaktigt ämne förändring av felaktigt ämne transplantation genterapi Kliniska försök med genterapi • • • • ingen dokumenterad behandlingseffekt studier i gene delivery, expression etc 368 kliniska försök (se tab. 10.5) säker metod fram till hösten 1999 2 dödsfall Genterapi • tillförsel av en funktionell gen till en mänsklig cell för att korrigera en gendefekt • somatiska celler (ej ’germ line cells’) • 1990 första människo-genterapi-försöket • virala vektorer • icke-virala metoder Frågeställningar • hur nås målcellerna? • hur ska genen levereras? • hur stor del av målcellerna måste transfekteras? • hur ska transkriptionen regleras? • kommer nya genen behållas av cellen och transkription bli ’livslång’? Selektiv expression i målceller • Isolering av målceller + gene delivery • målsökande vektor • selektiv expression Genöverförings-tekniker • Icke-biologiska metoder – – – – Liposomer och poly-katjoner (lipofection) Elektroporering In situ naked-DNA injektion Gene gun (DNA-coatade guldpartiklar) • Biologiska metoder – Transduktion (virus-medierad överföring) Promoter Suicid / toxisk gene DNA i främmande cell Liposom-DNA complex (lipoplex) • Ingen begränsning i storlek på DNA • Episomal • Expression under kort tid • Många olika målcellstyper • Instabilt in vivo Integration i kromosom Episom Receptor-medierat upptag Endosom [H+] Kärna Lysosom Human artificial chromosomes • ligering av kromosomala byggstenar: centromer, ori, telomer, diverse gener • Deletion av material från en ursprunglig kromosom: trunkering in situ bildar minikromosom Förbättring av receptor-medierat upptag • poly-L-lysin länkat till bindningsmolekylen • DNA binds till + laddat polylysintoroid • peptider som ökar cellspecifik bindning, membranfusion och internalisation av DNA • peptider som stabiliserar DNA och underlättar inträde i kärnan Odlade celler • vävnadsspecifika celler som transfekterats och odlats upp i cellkultur • celler inkapslade i semipermeabelt membran implanteras • immunsystemet ’ser inte’ de inkapslade cellerna • proteiner produceras Retrovirala vektorer • • • • • • • Rekombinanta retroviruspartiklar Storlek på insert 7-8 kb Slumpmässig kromosomal integration Endast integrering i prolifererande celler Expression under kort eller lång tid Olika värdceller Svårt att producera i stor skala Immunogena Prodrug activation therapy: HSV thymidinkinasGanciclovir HSVtk P Endogenous enzyme P P P cell-linje med strukturella virusgener produktion av virusproteiner transfektion med vektor-RNA med packningssignal viruspartiklar sätts ihop innehåller vektor-RNA som packats i partiklarna Sammanfattning • Rekombinanta proteiner • Enzymer • Monoklonala antikroppar • Bakteriofag-system • Nukleinsyror som potentiella läkemedel • RNA • RNA-DNA • Genterapi – virusvektorer – icke-virala metoder • Prodrug activation