Rekombinanta läkemedel och
Genterapi
9 november 2007
Sissela Liljeqvist
[email protected]
Föreläsningens innehåll
• Rekombinanta
proteiner
• Enzymer
• Monoklonala
antikroppar
• Produktion av
rekombinanta
antikroppar i E. coli
• Nukleinsyror som
potentiella
läkemedel
• RNA
• RNA-DNA
• Genterapi
– virusvektorer
– icke-virala metoder
• Prodrug activation
Rekombinanta läkemedel
Rekombinanta läkemedel
• rekombinant insulin lanserat 1982
• nu över 80 st. rekombinanta läkemedel på
marknaden
• fVIII, fVIIa, fIX, hGH, FSH, EPO, tPA,
INF-α,-β,-γ, PDGF, diverse mAb, m.fl.
• 750 ’kandidater’ i kliniska prövningar
se tab. 10:1
Generella principer
Identifiering
av protein
genetisk
kod
expressionsvektor
klona till
värdorganism
produktion
och rening
av protein
Modifiering av proteiner
• Interferoner: blanda delar av gener från
olika IFN-α
• hGH: punktmutationer för att byta aa och
minska bindning till Zn2+
(minskad affinitet för prolaktinreceptor)
• TNF-α: targeting peptide 6 aa stor
Optimering av genexpression
och ’delivery’
•
•
•
•
värdorganism
nativt protein
glykosyleringar
hela bakterier som uttrycker rekombinant
protein
• ex. L. lactis IL-10
L. lactis
ENZYMER
• Behandling mot cystisk fibros:
• DNAse I
– variant med minskad aktinbindning
• Alginate lyase
ENZYMER (forts.)
• Phenylalanin ammonia lyase
– PKU: brist på fenylalanin-hydroxylas
– kapslat enzym ges oralt
• α1-antitrypsin
– antiviralt
Antikroppar som läkemedel
• Immunoglobulin G
• monoklonala antikroppar (mAb)
• chimeric mAb
Antikroppar som läkemedel
• passiv immunisering:
• hästantikroppar mot difteri
• Gammaglobulin (IgG) mot hepatit A
Antikroppar: struktur
•
Fv
CDR1
CDR2
CDR3
Fab
Fc
Framställning av monoklonala
antikroppar
Monoklonala antikroppar
• förhindra avstötning
av transplantat
• behandling av
hjärntumörer
• behandling av
bröstcancer
Monoklonala antikroppar
• mot RSV-infektion
hos barn
• behandling av kroniska
inflammationssjukdomar, tex. Crohns sjd,
rematoid artrit
Targeting
• aktiva substansen når inte målcellerna
med tillräckligt hög koncentration
• åtgärd: targeting
• (liposomer)
• (toxingener i tumörinflitrerande lymfocyter)
• koppling till monoklonal antikropp (mAb)
• enzym som omvandl prodrug till drug
kopplad till mAb
Humana monoklonala
antikroppar
• human myeloma cell-linje finns ej
• försök med immunisering av människor
oetiska
• mänskliga stamceller i SCID-möss
• transgena möss: humana Ig-gener
(sedan standard hybridoma-metoder)
Human-Mouse monoclonal
antibodies
• chimeric antibody
MUS
HUMAN
• humanized antibody
– generna kodande för
CDR1, CDR2, CDR3
är från musmonoklonala
antikroppar.
– kombineras med
gener för humant IgG
Producera antikroppar i E.coli?
• borde vara billigare
• selektion- det svåra!
• produktion
Fag-bibliotek
• cDNA från humana B-celler syntetiseras
• H- och L-sekvenser amplifieras med PCR,
klonas i bakteriofag λ-vektor
• H- och L-kedjor uttrycks under fagens
lytiska cykel
• bibliotek av kombinatoriska kloner
• screening för antigenbindning
• subkloning i E.colivektor, uttryck i E.coli av
Fv-fragment
Filamentous bacteriophages
Kombinatoriskt bibliotek av
antikroppsfragment
• VL och VH cDNA amplifieras med PCR
• ligering med linker och sätts in i gen 3
• packas i fag M13
VH
VL
•
single-chain antibody
på ytan
Nukleinsyror som läkemedel
•
•
•
•
(DNA-bindare - antigen-oligonukleotid)
RNA-bindare - antisense-RNA
RNA-bindare - antisense-oligonukleotid
(dsDNA-oligonukleotider som binder
enzymer)
• ribozym
• RNA-DNA-komplex
• RNAi
Antisense
• RNA
• gen transkriberas till
RNA
• RNA binder mål-RNA
X
• oligonucleotide
• binder mål-RNA
X
• modifierade
nukleotider
• fosforotioatbindning
• peptide nucl. acid
Ribozymer
• katalytiska RNA-molekyler
hammarhuvud
hårnål
• kemisk modifiering: injektion, liposomer
• virus
RNA-DNA-molekyler
•
•
•
•
ribonukleotider och deoxyribonukleotider
dubbel hårnålsformation
metylering av syre på 2’-kolet i ribos
central komplementär region, med en mismatch
• korrigerar punktmutation
TT
TT
TT
3’ 5’
TT
interfererande RNA
•
•
•
•
•
RNAi
skyddar växter och djur från virus?
nukleas binds till dsRNA
dsRNA klyvs och dissocierar till ssRNA
ssRNA-nukleas binder till mRNA, som klyvs
GENTERAPI
Deshaies 02 — Colored human chromosomes #1
Exempel på ärftliga sjukdomar:
• 7000 kända monogena sjukdomar
• defekter i metabolism
– Gauchers sjukdom
– Fenylketonuri
• felaktigt strukturellt protein
– hemofili A (blödarsjuka)
Behandling av ärftliga
sjukdomar
•
•
•
•
•
•
•
specialdiet
inhibering av enzymer
ta bort toxiska ämnen
ersättning av saknat/felaktigt ämne
förändring av felaktigt ämne
transplantation
genterapi
Genterapi
• tillförsel av en funktionell gen till en
mänsklig cell för att korrigera en gendefekt
• somatiska celler (ej ’germ line cells’)
• 1990 första människo-genterapi-försöket
• virala vektorer
• icke-virala metoder
Kliniska försök med genterapi
•
•
•
•
ingen dokumenterad behandlingseffekt
studier i gene delivery, expression etc
368 kliniska försök (se tab. 10.5)
säker metod fram till hösten 1999
2 dödsfall
Frågeställningar
• hur nås målcellerna?
• hur ska genen levereras?
• hur stor del av målcellerna måste
transfekteras?
• hur ska transkriptionen regleras?
• kommer nya genen behållas av cellen och
transkription bli ’livslång’?
Selektiv expression i målceller
•
Isolering av målceller
+ gene delivery
•
målsökande vektor
•
selektiv expression
Promoter
Suicid / toxisk gene
Genöverförings-tekniker
• Icke-biologiska metoder
–
–
–
–
Liposomer och poly-katjoner (lipofection)
Elektroporering
In situ naked-DNA injektion
Gene gun (DNA-coatade guldpartiklar)
• Biologiska metoder
– Transduktion (virus-medierad överföring)
DNA i främmande cell
Integration i
kromosom
Episom
Liposom-DNA complex (lipoplex)
• Ingen begränsning i
storlek på DNA
• Episomal
• Expression under kort tid
• Många olika målcellstyper
• Instabilt in vivo
Receptor-medierat upptag
Endosom
[H+]
Kärna
Lysosom
Förbättring av receptor-medierat
upptag
• poly-L-lysin länkat till bindningsmolekylen
• DNA binds till + laddat polylysin=toroid
• peptider som ökar cellspecifik bindning,
membranfusion och internalisation av DNA
• peptider som stabiliserar DNA och
underlättar inträde i kärnan
Human artificial chromosomes
• ligering av kromosomala byggstenar:
centromer, ori, telomer, diverse gener
• Deletion av material från en ursprunglig
kromosom: trunkering in situ bildar
minikromosom
Odlade celler
• vävnadsspecifika celler som transfekterats
och odlats upp i cellkultur
• celler inkapslade i semipermeabelt
membran implanteras
• immunsystemet ’ser inte’ de inkapslade
cellerna
• proteiner produceras
Retrovirala vektorer
•
•
•
•
•
•
•
Storlek på insert 7-8 kb
Slumpmässig kromosomal integration
Endast integrering i prolifererande celler
Expression under kort eller lång tid
Olika värdceller
Svårt att producera i stor skala
Immunogena
Rekombinanta retroviruspartiklar
cell-linje med strukturella virusgener
produktion av virusproteiner
transfektion med vektor-RNA
med packningssignal
viruspartiklar sätts ihop
innehåller vektor-RNA som packats
i partiklarna
Prodrug activation therapy:
HSV thymidinkinasGanciclovir
HSVtk
P
Endogenous enzyme
P P P
Sammanfattning
• Rekombinanta
proteiner
• Enzymer
• Monoklonala
antikroppar
• Bakteriofag-system
• Nukleinsyror som
potentiella
läkemedel
• RNA
• RNA-DNA
• Genterapi
– virusvektorer
– icke-virala metoder
• Prodrug activation
