Alternativa metoder för att
påvisa antibiotikaresistens
Håkan Janson
Traditionell resistensbestämning
Fenotypisk testning
• Lappdiffusion
• Buljongspädning
– Detektion med utodling (Golden standard)
– Detektion med fotometri
– Detektion med fluorofotometri
– Detektion med turbidometri (VITEK)
– Detektion med kalorimetri
• Agarspädning
Begränsningar med fenotypisk testning
•
•
•
•
•
•
Ett stort inokulat i renkultur krävs
Komplicerad preanalytisk process
Begränsat organism-spektrum
Analytisk variabilitet
Lång tidsåtgång
Relativt hög kostnad (om man inkluderar alla
steg)
Molekylär resistensbestämning
• PCR för enstaka kända resistensgener
–
–
–
–
Makrolider (erytromycin, klaritromycin etc)
Meticillinresistens (mecA, mecC)
Vancomycinresistens (vanA, vanB)
Enstaka betalaktamaser (tex utbrott av ESBL)
• Multiplex-PCR ev medmicro-array om man letar efter flera
– Aminoglykosider, tetracyklin, betalaktamer, kloramfenikol,
erytromycin, kinoloner, sulfa, trimetoprim, rifampicin, isoniazid
– ESBL av olika slag
– ESBL-CARBA av olika slag
Begränsningar med molekylär
resistensbestämning
• Vissa analyser är enkla
– mecA, vanA, vanB,
– Andra är mer avancerade (ESBL mm)
– Somliga är mycket svårtolkade (porin-mutationer etc)
•
•
•
•
•
Ofta måste man sekvensera PCR produkter
Det är svårt att avgöra om genen uttrycks eller ej
Kan inte detektera alla resistensmarkörer
Hög kostnad
Inte allmänt accepterade
Resistensbestämning av bakterier vi
inte odlar
• Antalet agens vi detekterar med molekylärbiologiska
metoder ökar
–
–
–
–
–
–
–
–
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Mycoplasma genitalium
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae
Legionella pneumophila
Clostridium difficile
MRSA, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, EHEC…
• Hur hanterar vi resistensbestämningen av dem?
Makrolidresistens är ett icke
försumbart problem
• I arter som
– Mycoplasma genitalium
– Mycoplasma pneumoniae
– Helicobacter pylori
– Chlamydia trachomatis
• Arterna är svåra att odla men lätta att
detektera med PCR
• Makrolidresistens kan detekteras med PCR
med hög känslighet och specificitet
Traditionell Helicobacter pylori detektion och
resistensbestämning
• Relevant när man misstänker terapisvikt
• Odling av biopsi från magslemhinnan
• Resistensbestämning mot Claritromycin,
Metronidazol och Amoxicillin
• Resistensen är ibland svår att läsa av
– Bl a pga mögelöverväxt
Helicobacter pylori detektion och
claritromycin resistensbestämning
23S rRNA genen
Mutationer
Realtids-PCR
detektion
Smältpunktsanalys
avgör claritromycinkänsligheten
Funderingar kring gonokocker
(enligt Cathy Ison)
• Hur ska man kombinera resistensbestämning och
molekylärbiologi för gonokocker?
– Endast 54% av PCR-fynd kunde konfirmeras med odling
– 72% av de med symptom kunde konfirmeras med odling
• Patientnära test på inmarsch
– GeneXpert för GC/CT har bra känslighet (Tabrizi J Clin Micro
2013)
• Man måste behålla odlingsexpertisen för att kunna
övervaka resistensutvecklingen.
– Sentinelprovtagning för odling under 3 mån/år kan vara en
lösning
• För bedömning av behandlingssvikt fungerar inte PCR utan
där måste man odla och resistensbestämma
Andel MRSA 2011
Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network
(EARS-Net)
MRSA-förekomst i Sverige
Antal MRSA i Sverige (från SMI:s hemsida)
MRSA-screening i realtid
”Halmstadsmodellen”
• Anrikning i selektiv buljong
• DNA-extraktion
• Kvantifiering av S. aureus-specifik gen
– På vissa lab även mecA-gen
– På andra MRSA med SCCmec
• Besvaring av PCR-negativa prov efter 1 dygn
• Utodling av PCR-positiva prov
MRSA screening i Skåne
mecC (LGA251) = en ny variant av
mec gen som vi fn inte hittar i
molbiol screening. Därför odlas alla
buljonger med ”mycket” S. aureus ut
Måste vi överhuvudtaget odla MRSA?
• Med mec och nuc metod – JA
– mecA finns även i andra stafylokockarter ->
blandningar av MRSE och MSSA blir falskt positiva
• Med ”Huletsky-metoden” dvs SCCmec –JA
SCCmec fallgropar
Nya SCCmec-varianter kommer att bli falskt negativa
Kända MRSA-stammar kan mutera och bli methicillin-känsliga
men ändå förbli PCR-positiva
Snabbare MRSAscreening som kan
utföras lokalt
Cepheid® GeneXpert® eller
motsvarande
Låg sensitivitet (61%) och
PPV (38%) enligt Roisin
2012 Eur J Clin Microbiol
Vancomycinresistenta
Enterokocker (VRE)
Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network
(EARS-Net)
Vancomycinresistenta enterokocker
(E. faecium och E. faecalis)
• Två olika resistensgener
vanA
vanB
Resistent mot både
Vancomycin och
Teicoplanin
Resistent mot
Vancomycin men känsligt
för Teicoplanin
• vanA/B gener kan bäras av många andra
bakteriearter (Clostridium, Bacillus, Eggerthella m fl)
– Dessa är ej anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen
Antal VRE i Sverige
Specifika kloner orsakar då och då stora utbrott
Antal VRE i Sverige
700
600
500
400
300
200
100
0
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
VRE - buljonganrikning
Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner
2004
Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner
2011
Kan man detektera ESBL (Extended
Spectrum BetaLactamases) med PCR?
• ESBL – A
– ”Klassisk” ESBL som hämmas av betalaktamasinhibitor (>
100 varianter av t ex CTX-M, SHV, TEM-typ)
• ESBL – M
– Betalaktamas av AmpC- eller OXA-typ. Många varianter.
Hämmas av oxacillin men inte av betalaktamasinhibitorer
• ESBL - Carba
– Den värsta sorten eftersom dessa även är bryter ned
karbapenemer (imipenem, meropenem)
ESBL-CARBA
• Icke metallobetalaktamaser
– Klass A
• KPC (USA, Israel, Grekland), SME, IMI, NMC, GPC
– Klass D (OXA-enzymer)
• OXA-48 (Turkiet, mellanöstern, nordafrika), OXA-23, OXA-24/40,
OXA-51, OXA-58
• Metallobetalaktamaser (Klass B)
– NDM (Indien, Pakistan)
– VIM (endemisk i Grekland, spridd i världen)
– IMP (19 varianter spridda i världen), GIM, SPM, SIM
Många ESBL-stammar är multiresistenta
Vissa ESBL-Carba är totalresistenta
Andel Klebsiella pneumoniae som har nedsatt känslighet för
karbapenemer 2011
Andel Klebsiella pneumoniae som är resistenta mot 3:e
generationens cefalosporiner 2011
ESBL screening direkt från rektal-swab
med multiplex PCR
• Fungerar rent tekniskt bra
– Anrikning behövs ej men bör DNA extraheras
– Färgad pinne bättre än faeces
• Hittar bara de varianter man letar efter
• Hittar inte nya varianter
• Bra vid utbrott av en given klon
– Detekteras med specifik PCR mot just den ESBLvarianten
Fenotypisk resistensbestämning
Metod
Princip
< 105
cfu
Billig
Autom
atisk
Hetero Äkta
gen res MIC
Snabb
Agarspädning
Icke-växt på media
innehållande olika abkoncentrationer
Nej
Ja
Nej
Ja
Ja
Nej
Automatisk
resistenstest
Optisk mätning av tillväxt i
substrat
Nej
Ja
Ja
Ja/Nej
Ja/Nej
Ja/Nej
Buljongspädning
Växtinhibition i buljong
innehållande olika abkoncentrationer
Nej
Ja
Ja/Nej
Ja/Nej
Ja
Nej
Diskdiffusion
Inhibition runt en ab-disk
Nej
Ja
Ja/Nej
Ja
Nej
Nej
E-test
Inhibition runt en remsa
med ab-gradient
Nej
Ja
Ja/Nej
Ja
Ja
Nej
Annan befintlig resistensbestämning
Metod
Princip
< 105
cfu
Billig
Autom
atisk
Hetero
res
Äkta
MIC
Snabb
Kromogena
agarsubstrat
Färgomslag när en produkt
bryts ner
Nej
Ja/Nej
Nej
Ja
Nej
Nej
Fluoroscerande
färgning
Mikroskopi av
levande/döda celler i
närvaro av fluroforer
Ja
Ja
Nej
Nej
Nej
Ja
PCR
DNA amplifiering av
resiistensgener
Ja
Ja/Nej
Ja/Nej
Nej
Nej
Ja
Realtids
mikroskopi
Filmande av bakteriers
delning
Ja
Ja
Nej
Nej
Nej
Ja
Nära förestående resistensbestämning
Metod
Princip
< 105
cfu
Billig
Autom
atisk
Hetero
res
Äkta
MIC
Snabb
Mikrokalorimetri
Detektion av
värmeproduktion
Ja
?
Ja
Nej
Ja
Ja/Nej
Cantilever
teknologi
Vägande av bakterier med
cantilever vibrationer
Ja
?
Ja
Ja/Nej
Ja
Ja/Nej
Flödescytometri
Detektion av
levande/döda celler
Ja
Ja/Nej
Ja
Nej
Ja/Nej
Ja/Nej
Spinn av
magnetiska
kulor
Olika spinn beroende på
hur många bakterier som
fastnat
Nej
?
Ja
Nej
Nej
Ja/Nej
MALDI-TOF MS
Detektion av abdegradering + mönster
Nej
Ja
Ja
Nej
Nej
Ja/Nej
Mikrodroppar
Tillväxt eller
substratkonversion i nl
droppar
Ja
?
Ja
Ja/Nej
Ja/Nej
Ja/Nej
Helgenomsekvensering
Sekvensering av hela
genom
Ja
Nej
Ja
Nej
Nej
Nej
Isoterm mikrokalorimetri
• Man mäter värmeproduktionen/reduktion över
tid (t ex när bakterier tillväxer)
• Tekniken beskrevs 1780 (is i ett utrymme smälte
snabbare ju större djur man lade i)
• Första artikeln är från 1918 (Hill)
• Svenskar bakom den moderna designen (Wadsö
1968)
• Torvald Ripa använde mikrokalorimetri för att
mäta vilka tillsatser som var bäst för blododlingar
(1977)
Design
Man mäter:
Värmeflöde i mW
Energi i Joule
(W x s)
P=E/t
W=J/s
Exempel på resultat
Mycket bra korrelation med
buljongspädning – dock ej mycket
snabbare
Von Ah et al, BMC Microbiology 2009, 9:106
Helgenomssekvensensering av
framvuxna bakteriestammar
• ”Billigt”, enkelt och snabbt
– Det kostar idag ca 60 euro för ett bakteriegenom
– Kan göras på små bordsinstrument
– Resultat inom 24 timmar
• Resultat kan användas till
– Typning och resistensbestämning (se Eyre 2012 BMJ Open)
• 95% sensitivitet och 95% specificitet på ab-bestämning
• 99,7% konkordans mellan fenotypisk AST och WGS AST (Zankari
JAC 2013 på 200 stammar och 3051 tester)
– Utesluta släktskap hos fenotypiskt lika stammar (se Köser
2012 NEJM)
– Fastställa spridningsvägar – både lokalt och globalt
Problem med helgenomssekvensering
• Avancerade förberedelser
• Dyrt om man kör få prov
• Genererar enorma mängder data
• Svårt för lekmän att analysera resultat
• Automation är nödvändig
ResFinder - Gratisverktyg för analys
• Databas med kända resistensgener
• On-line mjukvara som gör en BLAST sökning
gentemot databasen
– Färdiga helgenom
– Ofärdiga helgenom
– Korta eller långa sekvenser
• www.genomicepidemiology.org
ResFinder hittar vad den skall bland
redan sekvenserade bakteriegenom
Test av ResFinder (och MLST)
• 200 isolat (50 var av E. coli, S typhimurium, E. faecalis,
E. faecium) isolerade från danska grisar
• 3051 fenotypiska test gjordes
– 482 blev resistenta
– 2569 blev känsliga
• Konkordans 99,74%
– 7 skilde sig mellan fenotyp och genotyp (6 st var
streptomycin i E. coli)
• MLST och resistensprofil korrelerade dåligt (förutom
för Salmonella typhimurium).
– Resistensmönster är alltså inget särskilt bra
epidemiologiskt verktyg
Zankari et al. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 771–777
Resistensbestämning som kan komma
Metod
Princip
< 105
cfu
Billig
Autom
atisk
Hetero
res
Äkta
MIC
Snabb
Apoptosmarkörer
Detektion av
apoptosmarkörer
Nej
Ja/Nej
Ja/Nej
Nej
Nej
Ja
Bakteriefag
amplifiering
Detektion av
fagreplikering i levande
celler
Ja
Ja/Nej
Nej
Nej
Nej
Nej
Flödescytometri
Detektion av
levande/döda celler
Ja
Ja/Nej
Ja
Nej
Ja/Nej
Ja/Nej
Kolorimetrisk
detektion av
respiration
Optisk detektion av cell
respiration
Ja
Ja
Ja
Nej
Nej
Ja
Elektroniska
näsor
Detektion av flyktiga
organiska ämnen
Nej
Ja
Ja
Nej
Ja
Ja
Impedans
Elektrisk skillnad mellan
levande och döda celler
Nej
?
Ja
Nej
Nej
Ja/Nej
Infraröd
spektroskopi
Absorptionsspektrum av
bakterier under IR-ljus
Ja
Ja/Nej
Ja
Ja/Nej
Nej
Ja/Nej
Resistensbestämning som kan komma
2
Metod
Princip
< 105
cfu
Billig
Autom
atisk
Hetero
res
Äkta
MIC
Snabb
LC-ESI MS
Proteomics av levande
döda celler samt
resistensmarkörer
Nej
Nej
Ja
Nej
Nej
Ja/Nej
Metabolomics
(inkl ROS)
Förändringar i
intracellulära molekyler
Nej
?
Ja
Nej
Nej
Ja
Mätning av
mikroljud
Skillnader i vibrationer
mellan levande och döda
bakterier
Ja
?
Ja
Nej
Nej
Ja/Nej
NMR
Molekylär uppsättning
med magnetresonans
Nej
?
Ja
Nej
Nej
Nej
Raman
spektroskopi
Absorption hos
laserstrålade bakterier
Ja
Ja
Ja
Ja/Nej
Nej
Ja/Nej
RNA
sekvensering
Skillnader i genexpression
Ja
Nej
Ja
Nej
Nej
Nej
Konklusion ett
• Fenotypisk antibiotikaresistenbestämning
kommer att förbi essentiellt för att:
– Hitta nya resistensmekanismer
– Detektera kombinationer av icke resistensgener
som leder till fenotypisk resistens (efflux, poriner)
– Hitta känsliga stammar hos de som bär på
resistensmarkörer
Konklusion två
• Molekylära resistensmetoder är ett viktigt
komplement
– För enkel detektion av vissa markörer/kloner
– För potentialen i helgenomsekvensering
• Många nya spännande alternativa metoder är på
gång
– Det kan dock ta flera år innan de är i rutinbruk på lab
– Ett undantag är MALDI-TOF…
