[SE]
187702/08 – 07/2004
Anti-EBV EBNA IgG ELISA
Enzymimmunoassay för in vitro-påvisning av
IgG-antikroppar mot Epstein-Barr-virus (EBV)
nukleär antigen 1 (EBNA) p72 i serum eller plasma
Förpackning
3
[REF]
807 017
96 tester
[IVD]
Komplett testförpackning
Avsedd användning
Anti-EBV EBNA IgG ELISA är ett in vitro-diagnostikum IVD för påvisning av IgGantikroppar mot EBNA 1 antigen p72 hos EBV. De resultat som uppnås med AntiEBNA IgG-testen är tillsammans med patientens kliniska bild och ytterligare
undersökningar som t ex Anti-EA IgM/IgG eller Anti-VCA IgM/IgG av stor betydelse
för serologisk diagnos av EBV-infektioner. En primärinfektion med EBV kan leda till
infektiös mononukleos (IM=körtelfeber) (1, 2). Denna sjukdom drabbar framför allt
äldre tonåringar och unga vuxna. Den akuta sjukdomen yttrar sig bl a genom
följande symtom: feber, faryngit, tonsillit, lymfadenopati, illamående, huvudvärk,
myalgier, spleno- och hepatomegali, hudutslag och leukocytos (2). Liknande
symtom kan även orsakas av andra patogener som t ex cytomegalovirus,
toxoplasma gondii, rubellavirus, hepatitvirus och HIV. Anti -EBV EBNA IgG ELISA är
lämpad för identifiering av en EBV-infektion. Testen gör det möjligt att skilja mellan
en primär och en redan genomgången infektion och är därför av central betydelse.
Metodbeskrivning
Anti-EBV EBNA IgG ELISA är en högkänslig indirekt enzyme immuno sorbent
assay (ELISA) för påvisning av EBV-specifika antikroppar i serum eller plasma. Om
EBV-antikroppar förekommer i provet interagerar dessa med de rekombinanta
(rec.) antigenerna p72 (4-6) på [MTP]. Ospecifikt bundet material avlägsnas genom
en tvättprocedur. Under det andra inkubationssteget påvisas de bundna
antikropparna. Detta sker genom tillsättning av en specifik, enzymmärkt monoklonal
antikropp riktad mot humant IgG (peroxidas). Ospecifikt bundet konjugat avlägsnas
i ett nytt tvättsteg. För den sista inkubationen fylls substratlösning (TMB, 3,3´5,5´tetrametylbenzidin) i brunnarna. Denna enzymreaktion stoppas genom tillsättning
av svavelsyra och den optiska densiteten (OD) mäts i en spektrofotometer vid 450
nm vid en referensvåglängd på 615-690 nm.
Testförpackningens innehåll och sammansättning
1
Mikrotiterplatta
[MTP]
12 separata strips med vardera 8 brunnar, belagda med rec.
EBV-EBNA p72-protein (koncentration > 0,01 µg/ml).
0,5 ml EBV EBNA IgG-negativ kontroll (bruksfärdig, human)
[NC]
konserveringsmedel: 0,005 % gentamycin, 0,05 %
streptomycin, 0,05 % penicillin V
0,5 ml EBV EBNA IgG-positiv kontroll (bruksfärdig, human)
[PC]
konserveringsmedel: 0,005 % gentamycin, 0,05 %
streptomycin, 0,05 % penicillin V
45 ml
Spädningsbuffert för prov (bruksfärdig buffert)
[DIL]
konserveringsmedel: 0,01 % neomycinsulfat, 0,03 %
kloramfenicol
Anti-human IgG-konjugat (bruksfärdigt)
[CONJ] 15 ml
monoklonal antikropp, peroxidasmärkt
konserveringsmedel: 0,025 % penicillin V, 0,025 %
streptomycinsulfat, 0,2 % proclin-300
6
ml
Tvättlösning (500-faldig)
[WB]
konserveringsmedel: 0,01 % 2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol
13 ml
Substratlösning (bruksfärdig)
[SUB]
3,3´,5,5´tetrametylbensidin (TMB)-lösning < 0,05 % i H 2O.
Beakta kapitlet "Varningar och försiktighetsåtgärder".
Stopplösning (bruksfärdig)
[STOP] 15 ml
svavelsyra < 1N H2SO4
1
Förvaringspåse (polyetylenpåse för förvaring av återstående
[SB]
mikroteststrips)
3
Folie (självhäftande, genomskinlig folie för att täcka över
[FOL]
brunnarna under inkubation)
1
Användarinformation
I
Konserveringsmedel (KVM): total koncentration < 0,11%
Material som erfordras men ej medföljer
Mikropipetter, spektrofotometer (450 nm, referensvåglängd 615–690 nm),
konventionell ELISA-tvättapparat (med bottentvättning) och utrustning för
inkubation (37 °C) av [MTP].
Varningar och försiktighetsåtgärder
Reagenserna får ej förtäras. Undvik kontakt med ögon, hud och slemhinnor. Alla
prov, kontroller och material som används för att utföra testen måste betraktas som
potentiellt infektiösa. Kontrollerna är av humant ursprung och har visats negativa för
anti-HIV-1/-2, anti-HCV, HBSAG, anti-lues och stegrade transaminaser. Pipettera
inte med munnen. Använd skyddshandskar, skyddsklädsel och skyddsglasögon i
enlighet med god laboratoriesed. Vätskor och icke brännbara material skall
dekontamineras med natriumhypoklorit (slutkoncentration: 3 %, inverkningstid:
minst 30 minuter). Flytande avfall som innehåller syror måste neutraliseras innan
det kasseras. Den använda [MTP] liksom allt laboratoriematerial som skall
återanvändas måste autoklaveras vid 121 °C under 1 timme. [SUB] är ljuskänslig
och måste därför skyddas mot ljus. Testen får endast utföras av skolad och
auktoriserad laboratoriepersonal. Var noga med att arbeta så sterilt som möjligt.
Informera tillverkaren om original-testförpackningen är skadad.
Hållbarhet och förvaring
Reagenserna kan användas fram till det bäst-före-datum som anges på respektive
etikett under förutsättning att de lagras vid 2-8 °C. Efter det att komponenterna
öppnats är de hållbara 30 dagar. Om reagenserna används för flera tester skall de
omedelbart lagras vid 2-8 °C efter användning. [MTP] är innesluten i en
aluminiumpåse som även innehåller ett torkmedel. Se till att [MTP] har
rumstemperatur innan påsen öppnas. Lägg tillbaka oanvända strips i ziplock-påsen
med torkmedlet och förvara vid 2-8 °C. Berör inte brunnarnas botten eller övre kant
med fingrarna.
Reagensernas förberedelse
Späd tvättbuffertkoncentratet med avjoniserat eller destillerat H 2O (1:501).
Bruksspädningen är hållbar 1 vecka om den lagras vid 2-8 °C. Om kristallisation
uppträder vid lagring vid 2-8 °C kan tvättbuffertkoncentratet lösas upp vid 37 °C.
Blanda noggrant före spädning. Alla andra testkomponenter är bruksfärdiga. Alla
reagenser är lotspecifika och får inte bytas ut mot reagenser från andra loter eller
tester. Använd inte reagenser från andra tillverkare tillsammans med reagenserna i
detta testkit.
Provtagning, provförvaring och transport
Använd färska serum - eller plasmaprov som inte uppvisar hemolys. Starkt
lipemiska, ikteriska eller mikrobiell kontaminerade serum - eller plasmaprov liksom
koncentrerade immunglobulinpreparationer kan leda till otillf örlitliga testresultat.
Undvik upprepad infrysning och upptining av proven. Om proven skall skickas skall
de förpackas i enlighet med de lagar och bestämmelser som gäller för transport av
infektiöst material. Proven skall inte inaktiveras, eftersom ospecif ika reaktioner i så
fall kan uppstå.
Testutförande
Instruktionerna skall följas strikt (se pipetteringsschema).
Spädning av prov 1:21 med förspädning i rör: Förspäd [PC] , [NC] och prov i
volymförhållandet 1:21 i rör (t ex 25 µl kontrollserum eller prov + 500 µl [DIL] ).
Blanda noggrant.
Spädning av prov 1:21 med spädning direkt i plattan:
Pipettera 200 µl [DIL] i varje brunn. Spädning direkt i mikroplattan är framför allt
lämpligt när man använder automatisk pipetteringsutrustning. Om direktspädningen
i plattan görs manuellt är det viktigt att undvika ospecifika proteinbindningar genom
att iaktta följande: Pipettera först 200 µl [DIL] i brunnarna och tillsätt först därefter
10 µl av prov eller kontrollserum. Blanda 5 till 7 gånger när prov/kontrollserum
tillsätts.
Pipetteringsschema för kvalitativ bestämning (förspädning i rör)
Se till att alla reagenser och prov har rumstemperatur innan testen påbörjas.
Kontrollsera och blank skall pipetteras sist. Börja med inkubationen omedelbart
efter det att kontroller och prov har pipetterats.
Steg 1
Brunn [µl]
A1/B1
C1/ D1
E1/ F1
G1...
200 [DIL]
Blank
[NC] dubblett
--
[PC] dubblett
--
200 [NC]
--
200 [PC]
--
Prov 1:21
--
--
--
200
--
--
Täck [MTP] med folie (bortfaller om processor används)
Inkubation 30 ± 1 min, 37 ±
1 °C
Processor*: 30 ± 1 min, 37 ± 1 °C
Tvätta 5 ggr (se W1 )
[WB]
550
Steg 2
[CONJ]
550
550
100
100
100
Täck [MTP] med folie (bortfaller om processor används)
Inkubation 30 ± 1 min, 37 ±
Processor*: 30 ± 1 min, 37 ± 1 °C
1 °C
Tvätta 5 ggr (se W1)
550
550
550
[WB]
Steg 3
[SUB]
Inkubation 30 ± 1 min
vid rumstemperatur i mörker
[STOP]
550
Brunn [µl]
100
550
Brunn [µl]
100
100
Processor *: 15 ± 1 min
vid rumstemperatur i mörker
100
100
100
100
100
100
Mät absorbansen vid 450 nm så snabbt som möjligt eller inom 15 min efter
teststopp. Referensvåglängd: 615–690 nm.
* Användaren måste validera testen självständigt och under eget ansvar när en
ELISA-processor används.
Tvättprocedur
Tvättstegen är kritiska moment under testen. Otillräcklig tvättning resulterar i
dålig precision och ospecifika reaktioner.
W1: Tvätta 5 gånger med tvättbuffert. För detta ändamål skall vätskan i brunnen
sugas bort. Dispensera med 300 µl tvättbuffert och fyll brunnen med minst 250 µl
tvättbuffert (total volym 550 µl). Upprepa denna procedur 5 gånger. Knacka
försiktigt ren plattan efter tvätt och fortsätt omedelbart med testen. Låt inte plattan
torka ut.
Utvärdering av kvalitativ bestämning
Efter det att alla extinktionsvärden uppmätts vid 450 nm (referensfilter: 615-690
nm), subtraheras medelvärdet för blankprov från extinktionsvärdena för kontroller
och prov. Medelextinktionsvärde för blankprov ? 0,100 OD. Efter det att
medelvärdet för blankprov subtraherats, måste kontrollerna uppfylla följande krav:
OD-medelvärde för [NC] : ? 0,200
OD-medelvärde för [PC]: ? 0,800
Beräkning av cut-off-värdet och gråzonen
Cut -off-värdet beräknas utifrån medelvärdet för den negativa kontrollens optiska
densitet (NKx ) plus 0,200. Cut-off-värde = NK x + 0,200. Gråzonen ligger inom
området mellan cut -off-värdet och cut -off-värdet - 20 %.
Resultatens tolkning
Prov med ett extinktionsvärde som ligger under gråzonen skall bedömas som
negativa. Om ett prov har ett extinktionsvärde som är lika stort eller större än cutoff -värdet, är provet positivt för EBNA IgG-antikroppar. Om extinktionsvärdet för ett
prov fortfarande ligger inom gråzonen efter upprepad testning, rekommenderas det
att testa ett uppföljande prov (osäkert resultat). Ett omfattande och översiktligt
tolkningsschema som möjliggör utvidgad utvärdering av reaktionsmönstren (6) kan
vid behov beställas hos Biotest.
Kvantitativ bestämning av prov med positivt EBV EBNA IgG-resultat
Testutförandet görs på samma sätt som vid den kvalitativa metoden Den negativa
och den positiva kontrollen tjänar som kalibratorer och mäts alltid vid en slutgiltig
spädning av 1:21. Kontrollerna skall köras som dubblett. Ett okänt prov skall först
mätas vid en spädning av 1:21. Den sensitivitet som krävs för att definiera
immunstatus är endast garanterad vid denna spädning. Om OD -värdet för provet >
OD-värdet för den positiva kontrollen mås te provet testas på nytt med en högre
spädning (nästa steg t ex +1:10 förspädning = 1:210 slutgiltig spädning). I en här
testad grupp var det vid en spädning av 1:21 respektive 1:210 möjligt att kvantifiera
ca 85 % av de prov som stammade från individer med en genomgången infektion.
Vid högre provreaktivitet måste emellertid ytterligare spädning göras.
Följande villkor måste alltid vara uppfyllt för att kvantifieringen skall vara korrekt::
Cut -off ≤ OD prov ≤ OD positiv kontroll (1:21)
Kvantifieringen är baserad på en tvåpunktskalibrering, där kalibreringskurvan dras
mellan gränsvärdena cut -off = 1 RU/ml och OD-värdet för den positiva kontrollen
(kalibrator) = RU/ml i enlighet med den lotspecifika informationen. Mätvärdena
mellan gränspunkterna intrapoleras grafiskt eller matematiskt.
Grafisk utvärdering
Kalibreringskurvans gränspunkter förs in i ett koordinatsystem (millimeterpapper).
X-axeln skaleras från 0.000-2.500 OD och y-axeln från 0-120 RU/ml. De två
gränsvärdena förs in vid följande koordinater [X/Y]:
Koordinater för undre gränsvärde = [OD cut -off / 1 RU/ml]
Koordinater för övre gränsvärde = [OD [PC] / RU/ml enligt etikett]
De båda punkterna förbinds med en rät linje. OD -värdena för proven avläses som
RU/ml på kalibreringskurvan (parallellförskjutning till axlarna med linjal). Om proven
hade en högre spädning än 1:21 måste det grafiskt fastställda värdet först
multipliceras med förspädningsfaktorn (t ex x 10 om provet har mätts vid en
spädning av 1:210).
Matematisk utvärdering
RU/ml-värdet för ett prov som mätts vid en spädning av 1:21 beräknas enligt
följande formel::
OD prov – cut -off
RU/ml prov = (RU/ml [PC] - 1) x
+ 1
OD [PC] (1:21)- cut -off
För kvantitativ bestämning av prov som har mätts vid en högre spädning måste det
RU/ml-värde som beräknats enligt formeln ovan multipliceras med
förspädningsfaktorn (t ex x 10 om provet har mätts vid en spädning av 1:210).
Exempel: Om provet har mätts vid en spädning av 1:210 (förspädningsfaktor= 10)
beräknas RU/ml-värdet på följande sätt:
U/ml prov (vid 1:210) = RU/ml prov (beräknat enligt formeln) x 10
Tolkning och anmärkningar beträffande kvantifiering
De kvantitativa värden som räknats fram är testspecifika och kan inte jämföras med
värden som härrör från EBNA-I IgG-tester f rån andra tillverkare. Definitionen av
RU/ml är baserad på en Biotest-intern, EBNA-IgG-specifik serumstandard som
kalibrerar den positiva kontrollen som ingår i testkitet. Rapporterade resultat skall
därför alltid kompletteras med en anmärkning som upplyser om detta faktum (t ex
"Biotest-EBNA-IgG-enheter"). Den kvantitativa metoden garanterar emellertid
konstanta resultat för olika testkitloter inom ramen för tillåtna tillverkningstoleranser.
Det kvantitativa värdet motsvarar inte provets slutpunktstiter. Som en grov
approximation gäller emellertid att det kvantitativa värdet är proportionellt mot
slutpunktstitern. Vid osäkra konstellationer kan svaga kvantitativa värden för EBNAI IgG (<100 RU/ml) ge stöd åt diagnosen primärinfektion. Det gäller framför allt när
en tydlig ökning fastställs vid testning av ytterligare förloppsprov. Höga värden
(>100 RU/ml) talar däremot snarare för en post-akut till en för längre tid sedan
genomgången infektion. Under immunsuppressiv behandling eller vid förvärvad
immunbristsjukdom (AIDS) kan först tydligt positiva kvantitativa värden för EBNA-1
IgG sjunka kraftigt och ibland till och med underskrida påvisningsgränsen.
Dessutom har det visats att ett fåtal friska individer (ca 1,2 %) som är latent
infekterade med EBV visserligen bildar anti-VCA IgG-antikroppar, men att de var
anti-EBNA IgG-negativa. Ännu sällsyntare (<1%) är individer som under hela livet
aldrig bildar EBNA IgG-antikroppar (EBNA Nonresponder) (1). Därför
rekommenderas det att principiellt lägga en EBV VCA IgG-serologi (Biotest arikelnr
807 019) till grund vid bestämning av EBV-immunstatus. Följande
frekvensfördelning för de kvantitativa anti-EBNA IgG-värdena fastställdes hos en
undersökt grupp friska vuxna (n=100, blodgivare) med latent EBV-infektion 38,5 %
(1-100 RU/ml), 55,1 % (100-1000 RU/ml) och 6,4 % (1000-4000) RU/ml. Ca 94 %
av de friska vuxna hade antikroppskoncentrationer mellan 1 och 1000 RU/ml. Detta
kan interpreteras som "normalområde".
Precision
En testpanel på 10 sera bestående av svagt, medelstarkt och starkt reaktiva sera
testades på 10 olika dagar. Interassay -variationen för dessa sera uppgick till 7,7 %16,5 %. Proven i samma testpanel mättes 8 ggr i en testomgång. Intraassay variationen för dessa sera uppgick till 4,8 % –15,4 %.
Förväntade resultat
Totalt undersöktes 99 sera från friska asymtomatiska blodgivare med Anti-EBV
EBNA IgG ELISA. 92 av dessa prov (92,93 %) testades som positiva och 7 (7,07
%) med negativt resultat. Detta resultat överensstämmer med publicerade uppgifter
om prevalensen av EBV-antikroppar hos den vuxna befolkningen (7). Prov från
patienter som genomgått en cytomegaloinfektion (n=20), toxoplasmainfektion
(n=20) och reumatiska sjukdomar (n=20) undersöktes. Härvid kunde EBVprimärinfektioner (n=7), EBV-reaktiveringar (n=17) och genomgångna EBVinfektioner (n=29) identifieras med Anti-EA IgM, Anti-EA IgG och Anti-EBNA IgG
ELISA (5).
Litteratur
1.
Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51.
2.
Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118,
45-58.
3.
DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices.
4.
Gorgievski-Hrisoho, M., Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J.,
Vornhagen, R., Sonneborn, H.-H., H., Wolf, H. and Siegl, G. (1990). J. Clin.
Microbiol. 26, 2305-2311.
5.
Färber, I., Wutzler, P., Wohlrabe, P., Wolf, H., Hinderer, W. and Sonneborn,
H. -H. (1993). J. Virol. Meth. 42, 301-108.
6.
Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Wenger-Süss, R. and
Sonneborn, H. -H. (1993). Biotest Bulletin 5, 33-46.
7.
Tamir, D., Benderley, A., Levy, J. et al. (1974). Pediatrics 53, 330.
Felsökning (Trouble Shooting)
1)
Oväntat stort antal positiva resultat
Prov och kontroller har tillsatts före [DIL] vid spädningen eller otillräcklig
blandning.
2)
3)
Blankvärden över börvärdet ? 0,100 OD
a) [SUB] redan blåfärgad genom oxidering/kontaminering.
b) Tvättfel: Tvätta 5 ggr per tvättsteg. När manuell tvättutrustning används
skall man tvätta 7 ggr. Använd endast Biotest-[WB].
c) Inkubationsfel: Temperaturen för hög eller så har föreskriven inkubationstid
överskridits eller plattorna inte inkuberats omedelbart efter pipettering av
proven.
d) Felaktig våglängd: Vid mätning utan referensfilter ligger alla värden ca
0,120 OD högre.
Gulfärgning i alla brunnar: (se 2a, 2b)
a) [WB] kontaminerad. Bered ny [WB].
b) [DIL] eller [CONJ] kontaminerad. Upprepa testen med reagenser från
oöppnade flaskor. Hantera reagenserna i så steril miljö som möjligt.
4)
[PC] under börvärdet ? 0,800 OD
a) Kitets bäst-före-datum har överskridits.
b) Temperaturen för låg eller så har föreskriven inkubationstid underskridits.
c) Tvättfel: För kraftig tvättning eller mekanisk kontakt mellan tvättkammen
och brunnarnas botten.
d) [PC] kontaminerad eller 3b.
5)
[NC] över börvärdet ? 0,200 OD (se 1 och 2 a-d)
a) [NC] har inte pipetterats efter proven. Pipettera först proven och därefter
kontrollsera och blankprov.
b) Kontaminering genom locket för [PC].
Metodens begränsningar
Ett negativt resultat i Anti-EBV EBNA IgG ELISA utesluter inte med absolut
säkerhet en EBV-infektion. Testresultaten skall alltid tolkas i samband med kliniska
patientdata och andra diagnostiska metoder. Det kan vara svårt att interpretera
testresultat för prov från immunsupprimerade patienter och ibland kan proven vara
negativa (1). Ingen korsreaktivitet för herpes simplex typ1/2 (n=27), varizella zoster
(n=50) och cytomegalovirus (n=16) kunde fastställas i IgG-positiva prov .
Specifikationer
De resultat som uppnås med Anti-EBNA IgG-testen är tillsammans med ytterligare
undersökningar som Anti-EA IgM/IgG och Anti-VCA IgM/IgG ELISA av stor
betydelse för serologisk diagnos av en EBV -infektion (4-7). Sensitiviteten för EA
IgM/IgG- och Anti-EBNA IgG-testsystemen bestämdes hos patienter med infektiös
mononukleos till 99,2 %. Specificiteten uppgick till 98,8 % (5).
B
Biotest
M Biotest,
Landsteinerstr. 5, D-63303 Dreieich, Germany
Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103- 801-140
www.biotest.de, [email protected]
|
