Cellcykel/Celldöd
Laborationsrapport – 20/2-14
Basgrupp 1
Louise Andersson
Alexander Barhebreus
Pontus Boberg
Amanda Dahl
Simon Ingves
Christina Larsson
Kajsa Lethin
Thea Wennman
Syfte
Se skillnad på hur strålning och Nutlinbehandling påverkar cancerceller med både muterad
och ickemuterad p53gen med avseende på cellcykelarest, uttryck av p21 protein och apoptos
av cancercellerna. Dessutom skulle det undersökas om det skett någon mutation i exon 8 i
p53-genen hos någon av de två cellinjer som tilldelats (A och B) samt betydelsen av detta. I
detta ingick att undersöka mutationens placering och dess eventuella funktionella
konsekvenser på proteinnivå.
Hypotes
Cellcykeln kommer stanna i G1fas hos cellinje med wt p53 gen och inte i den med en muterad
p53 gen.
Obehandlade levande cancerceller bör innehålla låga eller inga nivåer av p53 då de inte har
stannat upp i cellcykeln eller gått i apoptos. Celler behandlade med nutlin-3, strålning eller
bägge borde uttrycka högre nivåer av p53 vilket bör leda till fler apoptotiska celler. Detta bör
kunna visualiseras med DAPI-behandling och granskning i fluorescerande mikroskop.
Bakgrund
Cellcykeln består av fyra olika faser som en cell genomgår vid delning. Varje varv i cykeln
slutar med delning av cellen i två. Då miljön är gynnsam sker cellcykeln om igen. De fyra
faserna innebär:
• G1 - Gap phase 1 - Cellen ökar i storlek, beståndsdelar typiska för celltypen tillverkas och
den förbereds för DNA-replikation.
• S - Synthesis phase – Cellen replikerar DNA:t, 92 kromosomer.
• G2 - Gap phase 2 - Kontroll och reparation av nyreplikerat DNA vid behöv. M-fasens
proteiner förbereds.
• M - Mitosis phase – Mitosen sker.
När cellen inte är i cykeln ligger den utanför i G0 fas, permanent eller temporärt. I G0-fas
utförs de fysiologiska uppgifter cellen är ämnad för.
För att inget ska gå fel och för att undvika mutationer finns checkpoints i cellcykeln. Två finns
i slutet av G1 respektive G2. Där undersöktes om DNAt är komplett. I checkpointen vid G1 styr
transkriptionsregulatorn p53. P53 bildas konstant av cellen men inhiberas av MDM2 genom
märkning av p53 med ubiquitin och bryts då ned i protesomen. P53 är en transkriptionsfaktor
för MDM2 genen och MDM2 utgör en negativ feedback loop för p53. Nutlin-3A binder
kompetitivt till MDM2 och hindrar inhiberingen av p53. När celler strålas kan
vätebindningarna i DNAt påverkas och p53 stoppar då cellen i fas G1 för att förhindra att den
skadade celler delar sig. Om skadan inte går att laga kommer cellen att gå i apoptos.
p53 aktiverar flertalet proteiner, däribland p21 som inhiberar cyklin-CDKkomplex vilket
inducerar cellcykelarrest. Exempel på när p53 aktiveras är vid strålningsinducerad DNAskada. Vissa cancerceller kan växa bland annat på grund av defekt uttryck eller effekt av p53.
Apoptos innebär programmerad, kontrollerad, celldöd och sker normalt efter ett förutbestämt
schema. Vid apoptos, till skillnad från nekros, läcker inte cellulärt innehåll ut i
extracellulärutrymmet och därmed induceras inte inflammation. Kromatinet kommer att
kondensera och omhöljas av membran och därmed bilda apoptotiska kroppar.
Apoptos kan induceras av Fas-ligandinteraktion eller intracellulär aktivering.
En mutation innebär att det genetiska materialet har modifierats på något sätt. Detta kan ske
på följande sätt; punktmutation, insertion och deletion där de sista två även kan leda till en
frame-shift.
Vid en frame-shift kommer samtliga kodon efter deletionen eller insertionen att få en ny
sammansättning av nukleotider medan en punktmutation endast påverkar det kodon vars
nukleotid byts ut. Innebörden av att ett kodon får en ny sammansättning kan vara obetydlig
och kodonet fortsätter koda för samma aminosyra, men det kan även innebära att det börjar
koda för en annan aminosyra vilket kan ge proteinet en annan funktion. Detta kan vara
gynnsamt, icke-gynnsamt eller obetydligt för cellens funktion/överlevnad.
Metod
Två cellinjer av bröstcancerceller studerades, cellinje A och B. Varje cellinje fanns som fyra
olika prov där tre genomgått olika behandlingar och ett prov bevarats obehandlat. Ett prov
hade strålats med 10 Gy, ett behandlats med Nutlin och ett hade utsatts för både 10 Gy och
Nutlinbehandling.
Cellcykelanalys
Första steget under laborationen var tillsättning av en detergent och trypsin (lösning A) till
varje prov för upplösning av cellmembranet. Efter 10 minuter tillsattes en trypsinhibitor, för
att förhindra vidare upplösning av kärnan, och ett RNase, för upplösning av RNA, (lösning B).
Proverna förvarades sedan i kyl i väntan på flödescytomtern. Precis innan analysens start
tillsattes av Propidiumjodid (lösning C).
Proverna analyserade sedan i ModFit Software för framtagning av fraktionen mellan antal
celler i de olika cellcykelfaserna. Flödescytometern fungerar så att den energi (ljus) som
skickas mot atomer och träffar en elektron i den yttre orbitalen leder till excitation av
elektronen. Atomens stabilitet sänks och elektronen faller tillbaks. Det resulterar i utsöndring
av ett ljus med aningen längre våglängd (mindre energirikt ljus) än det inskickade ljudets pga.
värmeutsöndring. Propidiumjodid fluorescerar grönt ljus som detekteras i flödescytometern
och är i relation till mängden DNA.
Western Blot
Western Blot utfördes för att detektera nivåer av p-21 i cellysaten i cellinjerna A och B.
Kortfattat utfördes dessa huvudsakliga steg:
•
•
•
•
•
•
•
Protein loading
Electrophoresis
Transfer
Primary antibody (p21) incubation
Secondary antibody incubation
Exposing
Analysis
Elektrofores separerar proteiner baserat på molekylärvikt, där proteiner med lägre
molekylärvikt vandrar snabbare och mer oförhindrat genom gelén. En buffert tillsätts för att
alla proteinerna ska laddas negativt och därmed röra sig då de utsätts för en elektrisk ström.
Som förberedelse för CCD-fotografering görs en transfer från gel till membran. Vid transfern
överförs proteinerna till ett proteinbindande membran. Detta steg baseras också på att
proteinerna kommer röra sig som följd av dess laddningar.
En antikropp tillsätts som är specifik för p21. Den sekundära antikroppen som adderas senare
binder i sin tur till den primära antikroppen. Kopplat till den sekundära antikroppen sitter ett
enzym (horseradish peroxidase) som driver klyvningen av ett HRP-substrat som tillsätts
härnäst. Vid denna reaktion uppkommer chemiluminescence och ljuset som emitteras kan
detekteras via en CCD-kamera.
Figur 1
Apoptos
Celler från cellinje A och B som utsatts för antingen strålning (10Gy), Nutlin-3, både strålning
och Nutlin-3 eller ingetdera, infärgades med DAPI, med hjälp av lösningsmedlet Saponin, för
att detektera dubbelsträngat DNA. DAPI gör cellkärnorna fluorescerande och cellerna
preparerades sedan på mikroskopglas. Cellinje A och B kom från olika bröstcancerceller.
Cellerna undersöktes sedan i fluorescerande mikroskop, där UV-ljus visualiserar
infärgningen, för att jämföra mängd apoptotiska drag i förhållande till normala celler.
Preparaten jämfördes sinsemellan för att man skulle kunna studera hur strålning och Nutlin-3
påverkat cellerna.
Mutationsanalys
Syftet med Sanger-metoden är att inkorporera stoppnukleotider i DNA-sekvensen så att
fortsatt syntetisering inte kan ske. Stoppnukleotiderna hindrar fortsatt syntetisering genom
att de saknar den OH-grupp som är nödvändig för fosfodiesterbindning till nästa nukleotid.
När man har alla stoppnukleotider i tillräckligt hög koncentration kommer man få DNAfragment i samtliga längder. Detta kommer ske genom att en slumpmässig inbindning av
stoppnukleotiderna sker, vilka hindrar fortsatt syntetisering av just sin DNA-sträng.
Stoppnukleotiderna skiljer sig inte enbart från de vanliga nukleotiderna pga OH-gruppen.
Stoppnukleotiderna innehåller även en flouroscerande molekyl som är unik för de olika
nukleotidtyperna (A,T,C,G) och det är denna som kommer ge upphov till de olika färgerna som
syns i elektrofores.
Vid elektrofores kommer de olika DNA-fragmenten att vandra genom en gel som utsätts för
spänning. Eftersom DNA är negativt laddat kommer fragmenten att vandra mot pluspolen.
Hur långt fragmenten kommer röra sig i gelen beror av dess längd; den kortaste kommer att
vandra längst.
Då laborationen påbörjades hade en amplifiering av sekvenserna i cellinje A och B redan
utförts med hjälp av PCR och även en rening från fria nukleotider.
Först placerades cellinje A i två olika provrör och cellinje B i två provrör. Provrören markets
med AF (A forward), AR (A reverse), BF (B forward) samt BR (B reversed).
För att detektera sekvensens nukelotid-ordning användes metoden Sanger-sekvensering.
Denna metod går till på följande sätt:
Först förbereds insertion av stoppnukleotider i PCR-produkten. Detta görs genom att det
tillsätts primer (forward och reversed, så att AF, AR, BF och BR fås), MilliQ-vatten, Sequencing
Buffer och BigDye Terminator till PCR-produkten.
Primer – utgör startpunkt för DNA-syntetisering
MilliQ-vatten – filtrerat och renat vatten
Sequencing buffer
BigDye Terminator – innehåller dNTP (deoxynukleotidtrifosfat), ddNTP
(dideoxynukleotidtrifosfat) och polymerase (anpassat till tidigare nämnda produkter).
Denna blandning innehåller även fluoroform.
Därefter placeras preparatet i en PTC-200 (Peltier Thermal Cycler) som programmerats enligt
följade.
96°C, 1 min (separera DNA)
Repetera följande i 25 cykler
96°C, 10 sek (denaturering av DNA)
55°C, 5 sek (primer binder in till DNA)
60°C, 2 min (syntetisering av komplemtär DNA-sträng)
Då denna process genomförts skall post-reaction clean-up genomföras. Detta steg genomförs
för att avlägsna salter m.m. som kan komma att störa elektroforesen. Post-reaction clean-up
gör man genom att tillsätta milliQ-vatten, EDTA, natriumacetat och etanol (99%). Därefter
skall provröret vändas fem gånger och sedan inkuberas i fem minuter i rumstemperatur och
mörker. Sedan ska proverna centrifugeras på maxhastighet i 15 minuter. Efter
centrifugeringen ska supernatanten avlägsnas från provröret.
Då endast pelleten är kvar i provröret ska den sköljas med etanol (70%) för sedan
centrifugeras ytterligare 5 min och därefter ska supernatanten återigen avlägsnas. Sedan ska
pelleten lufttorka över natten. Sist av allt ska Hi-Di formamid tillsättas och sedan ska
produkten föras över till en speciell 96-wells platta. Därefter förs produkten in i en kapillärelektrofores-maskin som presenterar resultatet i ett datorprogram.
För att tolka resultatet från elektroforesen gjordes följande:
Lägg in sekvensen i BLAST.
Välj complete cds
Detta visar vilken gen sekvensen finns i, i detta fall tp53. Det går även att se var i genen
sekvensen är lokaliserad. Här är det även möjligt att se om det skett några mutationer, dvs. att
sekvensen inte matchar databasens.
Därefter klickar man på Sequence ID och väljer ”visa sekvens”. Det blir då utmarkerat
hur databasens hela sekvens ser ut samt var det aktuella exonet är placerat
(brunmarkerat).
Sedan använder man FASTA formen för sekvensen och klistrar in den i en ny BLASTsökning med aligned sequence med den utvunna sekvensen.
Resultatet av detta är att man ser vilka skillnader som skett i sekvensen (mutationer
och frame-shift).
Material
Se labhandledning.
Resultat
Cellcykelanalys
Diagramtext: A - Cellinje A, B - Cellinje B, N- Nutlinbehandlad, R - Strålningsbehandlad.
B-N
B
G2
18
,6
S%
33
,8
%
G1
47
,6
%
G2
56,
0
%
B-R
G1
25,
5
S
%
18,
5
%
A
G2
47
,8
%
Figur 2
S
0,
0
%
G2
26,
5
%
A-N
G1
27
,0
S%
25
,2
%
G2
66,1
%
G1
22,2
%
B-NR
G1
73,
5
%
G2
62,
4
%
A-R G1
6,4% S
7,3%
S
11,7
%
G2
86,3
%
G1
17,
9 S
%19,
7
%
A-NR G1
9,2% S
11,1
%
G2
79,7
%
Western blot
Nivå 21
kDa
Figur 3 Elektroforesresultat i CCD-kameran där cellinje B ses till vänster och cellinje A till höger. Ordningen i
respektive linje från vänster till höger var: strålning + nutlin-3, strålning, nutlin-3 och obehandlad. Den sista Alinjen fattas.
De tjockaste strecken (längst ner i bilden ovan) ligger på nivån 21 kDa där p-21 förväntas
ligga. Cellinje A uttrycker inte p-21. I cellinje B uttrycks högre nivåer p-21 i cellerna som
behandlades med både strålning och nutlin-3. Cellerna behandlade med Nutlin-3 uttrycker
högre nivåer p-21 än de strålningsbehandlade.
Apoptos
A (kontroll)
A-N
– Runda
– Ej stor skillnad
regelbundna celler från kontroll
– Ej mycket
apoptos
– Utspridda och
växer ej lika
snabbt som
celllinje B
A-R
– En del apoptos
och apoptotiska
kroppar
– Färre celler än i
kontroll
A-NR
– Ej stor skillnad
jämfört med A-R
– En del apoptos
B (kontroll)
– Många, täta
celler
– Ej mycket
apoptos
B-R
– Mer apoptos
– Oregelbundna
celler
– Glesare och färre
celler
– Liknar B-N
B-NR
– Mest apoptos
– Oregelbundna
celler
– Ännu glesare och
färre celler
Tabell 1
B-N
– Mer apoptos
– Oregelbundna
celler
– Glesare och färre
celler
A
Figur 4 Tolkning, se Tabell 1
A-N
A-R
A-NR
B
B-N
B-R
B-NR
Mutationsanalys
Cellinje A forward
Figur 5
Cellinje B forward
Figur 6
Cellinje B reversed
Figur 7
Diskussion
Cellcykel
I cellinje A kan man ana att p53 genen är muterad då cellerna inte stannar i G1 fasen efter
strålbehandling. Detta borde ske då p53 kontrollen finns mellan G1- och S-fas. Efter Nutlin behandling
stannar inte fler celler i G1, vilket borde skett om p53 hade varit funktionellt.
I cellinje B stannar däremot flertalet celler i G1-fas efter strålbehandlingen. Det tyder på att p53 genen
är funktionell och stannat cellcykeln vid checkpointen. I provet som både var strål- och
nutlinbehandlat borde en avstanning i G1 fas också setts. Anledningen till att det inte skett kan vara att
provet behandlats med Nutlin före strålningen. Nutlin har en förmåga att även stanna cellcykeln vid
G2- checkpointen, vilket gjorts innan strålningen utfördes. Då Nutlin redan avstannat cellcykeln i G2checkpointen kommer inte cellerna till G1 fasen där p53 hade haft möjlighet att avstanna cellcykeln.
Western Blot
Resultatet stämmer till viss del överens med hypotesen. I cellinje B uttrycker de behandlade
cellerna mer p-21 som förväntat. Skillnaden i uttryck av p-21 mellan de strålningsbehandlade
och nutlin-3-behandlade B-cellerna kan tänkas bero på variation i tumörernas molekylära
strukturer och strålningskänslighet. Cellinje A uttrycker tillsynes inget P-21 alls. Förklaringen
kan tänkas ligga i defekt P-53-gen men det måste stärkas av andra tester än western blot.
Felkällorna listade nedan kan ha påverkat resultatet (definitivt i obehandlade cellinje A) men
det är svårt att värdera hur mycket om alls. Upprepade studier eller jämförelse med andra
likvärdiga studier behöver göras för att bekräfta deras betydelse.
Felkällor under laborationen kan ha varit:
För liten volym av den obehandlade cancercellen i cellinje A hamnade i brunnen vid
överföringen till elektroforesgelen. Konsekvens: Uteblivet resultat vid mätning av
obehandlade celllinje A-cellerna.
Volymen av den sekundära antikroppen som tillsattes kan ha varit för liten, då
pipetteringen inte skedde direkt i vätskan utan ovanför. Konsekvens: För att
chemiluminescence ska ske måste den sekundära antikroppen binda in. För lite
sekundärantikropp ger mindre eller ingen chemiluminescence.
Apoptos
Cellinje A verkar ha en muterad p53-gen då den inte påverkas av nutlin-3 med avseende
på apoptos, påverkas dock av strålning som inducerar apoptos via andra vägar. Detta kan
ses på preparat A-N att nutlin-3 ej påverkar apoptosmängd (jmf kontroll)
Cellinje B verkar ha starkare proliferativ förmåga än cellinje A och därmed är det viktigt att
fokusera på andel apoptotiska celler och ej antal. Cellinje B verkar ej ha en muterad p53-gen
då den påverkas av nutlin-3 med avseende på apoptos. Både nutlin-3 och strålning kommer
alltså att inducera apoptos. Preparat B-N och B-R har liknande apoptosandel medan preparat
B-NR har överlägsen andel apoptos.
Vid tolkning av resultatet bör följande beaktas:
• Apoptos orsakas även av naturliga orsaker
• Infärgningen kan ha blivit inkorrekt då vi ej är erfarna preparatmakare
• Våra fynd vid mikroskoperingen baseras på subjektiva bedömningar
• Preparaten kan ha skadats fram till mikroskoperingen vilket kan påverka cellernas
beteende
Mutationsanalys
Cellinje A forward (figur 5):
I query har en mutation skett i nukleotid 68 vilket motsvarar nukleotid 71 i subject. Den 71:a
nukleotiden är placerad i mitten på sitt kodon och är G, denna har muterats till ett A.
Orginal-kodon är: AGA (Argenine)
Mutations-kodon: AAA (Lysin)
AGA284AAA
Arg>Lys
Cellinje A reversed:
Det har skett en mutation i vår sekvens i nukleotid 62 vilket motsvarar databasens 71:a
nukleotid. Den 71:a nukleotiden är placerad i mitten på sitt kodon och är ett C, denna har dock
muterats till ett T.
Orginal-kodon: TCT (Serine)
Mutations-kodon: TTT (Phenylalanine)
TCT284TTT
Ser>Phe
Cellinje B Forward (figur 6):
I cellinje B finns det möjlighet att det skett en mutation i subjektets 70:e nukleotid där queryn
svarat med ett M vilket innebär att det antingen är ett C eller M (orginal är A).
Möjlig mutation: den första (70:e) nukleotiden i kodonet har bytts ut mot ett C.
Orginal-kodonet är: AGA (Arginine)
Muations-kodon är: CGA (Arginine)
Detta kommer alltså inte att innebära någon konsekvens eftersom mutationen
kommer att koda för samma aminosyra.
Det innebär även att det är möjligt att det inte skett något nukleotidskifte
Cellinje B reversed (figur 7):
I cellinje B finns det möjlighet att det skett en mutation i subjektets 65:e nukleotid (queryn's
69:e) där queryn svarat med ett S vilket innebär att det antingen är ett G eller C (orginal är C).
Original-kodonet: GGC (Glycine)
Mutations-kodon: GGG (Glycine)
Detta kommer alltså inte att innebära någon konsekvens eftersom mutationen
kommer att koda för samma aminosyra.
Det innebär även att det är möjligt att det inte skett något nukleotidskifte
Enligt ensemble finns ingen polymorfism i detta exon (8) vilket tyder på att detta är en
mutation.
Om salterna inte avlägsnas fullständigt vid post-reaction clean-up kan det störa
elektroforesen, vilket kan yttra sig som en deletion. Detta skulle kunna tolkas som att det
skett en frame-shift, vilket skulle kunna leda till felaktig tolkning av resultatet.
Konklusion
Den slutsats man kan dra av dessa labbar är att p53 genen är muterad hos cellinje A.
I mutationsanalyslabben framkommer det att det har skett en muatation som ger en defekt p53 gen.
Även de andra dellabbarna ger visar indirekt att p53 genen hos celllinje A är muterad. Denna defekt
har gett funktionella konsekvenser i olika moment i cellens livscykel. Dessa konsekvenser kan
sedan observeras i de experiment som utförts i de andra dellabbarna där defekten manifesteras i att
de olika funktionerna som p53 har inte fungerar som de ska.
