ATT ISOLERA PLASMID-DNA FRÅN Escherichia coli –BAKTERIECELLER
1. Allmänt
2. Princip
3. Lösningar, kärl och redskap som behövs
4. Odling av Escherichia coli –celler som innehåller plasmid
5. Isolering av plasmid-DNA
6. Bestämning av plasmid-DNA:s halt och renhet
7. Att uträkna och ange resultaten
8. Att förstöra avfall
9. Källa
1. Allmänt
Plasmiderna är bakteriernas ringformade DNA-molekyler som klarar av att självständigt replikera i
värdcellen. Plasmiderna innehåller ofta gener som är gynnsamma för bakteriecellen som t.ex.
antibiotikaresistenta gener.
2. Princip
Bakteriecellerna sönderdelas med SDS-NaOH -behandlingen. SDS denaturerar bakteriella
proteiner och NaOH denaturerar ett kromosomuppbyggt DNA samt plasmid-DNA. Lösningen
neutraliseras med kaliumacetat, varvid plasmid-DNA renaturerar tillbaka till sin dubbel(fjädrade)
spiralform. Största delen av bakteriernas kromosomuppbyggda DNA och de bakteriella proteinerna
(sedimenteras)
fälls
ut
med SDS
som
bildar
ett komplex
tillsammans
med
kalium.
SDS/kromosomuppbyggt DNA/proteiner –fällningen centrifugeras till bottnen och plasmid-DNA
som blivit kvar i supernatanten (reds) fälls ut med isopropanol och tvättas med 70 % etanol.
3. Lösningar, kärl, redskap och apparater som behövs
Alla de lösningar som används bör vara sterila, varför de är färdigt framställda och
autoklaverade. Även alla glasvaror samt engångstillbehör i plast, såsom pipettspetsar,
Eppendorf- och centrifugrör bör vara sterila.
Under hela arbetet ska man använda
engångshandskar därför att det på huden finns nukleaser som bryter ner nukleinsyror.
LB-(odlingsbad) näringsbuljong
0,5 g
1g
1g
jästextrakt
NaCl
trypton
Tillsätt 50 ml vatten och blanda tills ämnena har löst upp sig, justera pH till 7,0 med NaOH. Fyll på
till 100 ml med vatten och autoklavera. Efter autoklaveringen ska du i lösningen tillsätta ampicillin
(just innan bakterien införs) så att den slutliga koncentrationen i lösningen är 5 mg/100 ml.
1 M Tris, pH 8,0
0,5 M EDTA (dinatrium-EDTA, löses upp först när pH är 8,0)
GTE-buffertlösning dvs. Glukos-Tris-EDTA:
50 mM glukos – 25 mM Tris (pH 8,0) – 10 mM EDTA
3 M Kaliumacetatlösning
Tillverka först en 5 M kaliumacetatlösning och tillverka först därefter 3 M kaliumacetat enligt
följande:
60 ml
5 M kaliumacetat
11,5 ml
isättika
fyll på med vatten till 100 ml och kontrollera att lösningens pH är 4,8.
Lösning P2: 1 % SDS/0,2 M NaOH –lösning
TE-buffertlösning:
1 ml
1 M Tris (pH 8,0)
200 l
0,5 M EDTA
Fylle på med vatten till 50 ml.
Sterilt vatten
(15 ml centrifugrör)
Eppendorf-rör
Pipetter och pipettspetsar (storlek 10 µl – 5 ml)
Bords- och Eppendorfcentrifug
Engångshandskar
Sterila glaskärl
4. Odling av Escherichia coli –celler som innehåller plasmid
E. coli -bakterien som plasmiden innehåller har odlats färdigt.
5. Isolering av plasmid-DNA
1. Från E. coli –bakteriebeståndet som har odlats över natten flyttas 2 ml över i två sterila
Eppendorf-rör (sammanlagt 4 ml) och cellerna centrifugeras 10 000 rpm i 2 - 3 minuters tid.
2. Lösningen hälls bort och rören får rinna torra. Man ska dock akta sig för att lösgöra celler från
rörens botten.
3. Ovanpå båda bottensatserna tillsätts en 200 l GTE-lösning och blandningarna blandas så bra
som möjligt så att inte klumpar blir kvar i lösningen.
4. I blandningarna tillsätts en 400 l P2–lösning (SDS/NaOH) och allt blandas väl.
5. Blandningarna flyttas så noggrant som möjligt i Eppendorf-rör och hålls i kylbad i 5 minuter.
6. I blandningarna tillsätt 300 l iskallt 3 M kaliumacetat och innehållet som blandas väl genom
att man vänder rören 5 gånger upp och ner. I rören borde en vit fällning börja framträda.
7. Proverna hålls i kylbad 5 minuter, varefter provblandningarna centrifugeras 10 000 rpm i 5
minuters tid.
8. Lösningarna förs över från rören i nya Eppendorf-rör och man aktar sig för att pipettera
bottensatserna.
9. I lösningarna tillsätts en lika stor volym isopropanol, korkarna tillsluts och man blandar kraftigt
genom att vända rören 5 gånger upp och ner. Proverna får stå 2 minuter i rumsvärme varvid
isopropanolet fäller ut nukleinsyrorna. Lösningarna får inte stå länge i rumsvärme därför att
även proteiner som eventuellt blivit kvar börjar sedimenteras.
10. Lösningarna centrifugeras 10 000 rpm i 10 minuters tid och lösningarna hälls försiktigt bort
från rören.
11. Ovanpå de bottensatser som erhållits hälls 200 l kallt 70 % etanol och rören vänds några
gånger upp och ner så att bottensatsen tvättas..
12. Proverna centrifugeras 10 000 rpm i 2 - 3 minuters tid och lösningarna hälls försiktigt och så
noggrant som möjligt bort från rören och proverna lufttorkas i rumsvärme ca 15 minuter.
13. Båda bottensatserna som erhållits löses i en 25 l TE-buffertlösning och förenas.
6. Bestämning av halt och renhet i plasmid-DNA
Av provet görs en 1:100 utspädd blandning (1 ml) i sterilt vatten och provet mäts med UVspektrofotometer på våglängden 260 nm och 280 nm (sterilt vatten som nollösning). Av provet
beräknas halten, utbytet och renheten utgående från de erhållna resultaten.
7. Att uträkna och ange resultaten
På basis av de erhållna resultaten beräknas utbytet. På en skild blankett anges DNA:s renhet, halt
och utbyte. På blanketten antecknas även hur utspädningen har gjorts samt även A 260 och A280
värden. Det egna resultatet (renhet) jämförs med värdet i litteraturen.
8. Hantering av avfall
Förstör bakterieavfall samt hantera kärl som varit i kontakt med bakterier på vederbörligt sätt.
9. Källa
Suominen, I. & Ollikka, P. 2004. Yhdistelmä-DNA-tekniikan perusteet. 3-2. painos. Opetushallitus.
