Laboratoriediagnostik av
svampinfektioner
Erja Chryssanthou
Jäst
Unicellulära
Knoppande jästceller (blastosporer)
Foto Dan Eshel
Pseudohyf, förlängda jästceller som bildar
kedjor, förökning genom unipolar
knoppning
Candida albicans äkta hyfer
• Bildas i närvaro av
serum
• Växer apikalt
• Liknar mögelhyfer:
•Aspergillus och Penicillium
• Hjälper C. albicans att
fästa och penetrera
värdceller
Trådsvampar (mögel, dermatofyter)
Multicellulära
Septerade hyfer
Septa med porer
Aspergillus, Fusarium,
dermatofytarter
Osepterade hyfer
zygomyceter: Absidia, Rhizomucor,
Rhizopus, Mucor arter
Svampar
• Karakteristisk livscykel
• Olika morfologiska former
•
•
•
•
Växling mellan sexuell och asexuell förökning
Den sexuellt förökande svampen kallas teleomorf
Den asexuella anamorf
En del har flera olika typer av anamorfer (=synamorf)
• T.ex Pseudoallescheria boydii (teleomorf)
• Synanamorf Scedosporium apiospermum och
Graphium eumorphum
Taxonomi
•
Minst 100 000 olika svampar
•
397 arter i Atlas of Clinical Fungi (de Hoog)
•
Heterotrofiska eukaryota
•
Nomenklatur
•
Hierarkisk indelning
•
•
•
•
•
•
Division
Klass
Order
Familj
Genus
Species
:-mycota
:-mycetes
:-ales
:-acea
Kliniskt viktiga grupper
•
Fungi (svamp) Eumycota
•
•
Äkta svampar
Division
•
•
•
Zygomycota (släkten Rhizopus, Mucor, Rhizomucor,
Absidia)
Ascomycota (släkten Aspergillus, Fusarium, Candida,
dimorfa svampar, dermatofyter)
Basidiomycota (släkten Cryptococcus, Trichosporon,
Malassezia)
Laboratoriediagnostik
Mikroskopi
•Direktpåvisning av svampstrukturer i provmaterial
• Fluorescensmikroskopi känsligare än vanlig ljus
• Fluorescerande färg binder till β-glucan i
cellväggen
• Blankofor, calcofluor white
Foto D. Denning
Nyttan med mikroskopi
• Snabb metod, invasiv infektion
• Skilja jästsvamp från Aspergillus och zygomyceter
• Jästceller + pseudohyfer
• Septerade hyfer med dikotoma (45 gr) förgreningar
• Aspergillus, Fusarium och Scedosporium liknar varandra
• Breda osepterade ”bandliknande” hyfer hos
zygomyceter
• Kan vara svårt
• Odling för zygomyceter kan vara negativ
Jästceller
Aspergillus hyfer
Zygomycet hyfer
Mikroskopi
Diagnostisk för vissa dimorfa (endemiska) svampar
• Coccidioides immitis sferula
• Små Histoplasma capsulatum jästceller i magrofager
Histologisk
undersökning
• Påvisande av svampstrukturer i
vävnadsnitt
Jäst
• Periodic acid schiff (PAS)
•Bakgrundens cellstruktur (t. ex hyfer i
blodådra)
• Silverfärgning (Grocott’s
Methenamine Silver)
•Känsligare
Aspergillus
Immunohistokemi
Henrik Jensen (Avd för Veterinär Patobiologi,
Köpenhamns Universitet)
Specifika antikroppar mot Candida, Aspergillus,
Fusarium och Rhizopus
© H.E. Jensen
Aspergillus
© H.E. Jensen
Odling
Odling
Blododling
•
•
Okänslig markör för invasiv
svampinfektion
Bättre system idag
• BacT/Alert System
(bioMérieux)
• Bactec System (BD)
– Mycosis IC/F medium
för svamp
• Likvärdiga system men
Mycosis flaskan upptäcker
flera fall av blandinfektion
med jäst+bakterier
Odling
• 401 svenska candidemifall 05-06
60.6 % C. albicans
20.2 % C. glabrata
9.0 % C. parapsilosis
3.7 % C. dubliniensis
2.0 % C. tropicalis
2.0 % C. lusitaniae
1.2 % C. krusei
1.0 % andra arter
Fördelning efter klinik på 304 candidemier
1997- juni 2009 vid Karolinska, Solna
43; 14%
18; 6%
16; 5%
8; 3%
7; 2%
7; 2%
1; 0%
IVA
Barn+neonatal+neoiva
82; 27%
Kirurgi
Infektion
Medicin
122; 41%
Urologi
Hematologi+onkologi
Geriatri
Öron
Övervakningsodlingar
Koloniseringsindex
•
•
•
•
Antal koloniserade områden/ provtagna områden
>0.5
Vilka patienter ska provtas?
ECMO, brännskade-, hematologiska patienter
Isolering och artidentifiering viktigt
Olika svampar olika
känslighet för antimykotika
C. albicans känslig
C. glabrata nedsatt känslighet
för flukonazol, itrakonazol och ofta
för vorikonazol
Zygomyceter naturligt resistenta mot
vorikonazol och echinocandiner
Cryptococcus, Fusarium,
Trichosporon naturligt resistenta
mot echinocandiner
Serologisk diagnostik
Immunoelektroosmofores (IEOP)
Antikroppsbestämning
Aspergillus IgG
• Aspergilloma
• CF-patienter
Antikroppsbestämning
Endemiska svampar
• Histoplasma, Coccidioides,
Blastomyces, Paracoccidioides
• IgG 2-6 v
• Känslighet ca 80%
• Korsreaktioner
Antigentest för Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces
(www.miravistalabs.com)
•
Serum/plasma, BAL, likvor, urin
Galactofuranos-antigener
Svampens cellvägg
• Galactomannan
•
•
•
•
•
Utsöndras vid hyfväxt
Polysackarid
Platelia Aspergillus ELISA (Bio-Rad)
FDA godkänd
EORTC/MSG fungal definitions consensus guidelines:
sannolik IFI diagnos
• 1,3-β-D-glucan
• 4 kommersiella testkit
• Fungitell test (Cape Cod)
– EORTC sannolik IFI diagnos
– FDA godkänd 2003
Aspergillus cellvägg
Galactomannan
Galactomannan antigen
Aspergillus
Double sandwich enzym immunoassay
Ett indexvärde
• Provets optisk densitet delas med kitberoende ”tröskel”
serum
• Serum och likvor (gräns för positivt resultat ≥ 0,5),
bal (≥ 1,0)
Aspergillus antigen ELISA
Neg
kontroll
Tröskel
kontroll
Positivt
prov
Pos
kontroll
Galactomannan
Falskt positiva test
• GM eller molekyler som reagerar med EIA antikroppen
• Vissa andra svampar I mat, mjölk, Plasmalyte för Bal
• Bifidobacterium spp. korsreaktiva epitoper
• Mukosit i mag-tarmkanalen
• B-lactam antibiotika
• Piperacillin-tazobactam, amoxicillin-clavulansyra
– Semisyntetiska från Penicillium
Falskt negativa test
• Anti-aspergillus antikroppar
• Profylax eller empirisk behandling med antimykotika
Galactomannan
9Högt negativt prediktivt värde (98,5%) (Maertens
2007)
9Hög specificitet (>95%)
9Surrogat markör för behandlingseffekt
• Flera studier, sjunkande antigennivåer vid positiv
behandlingseffekt
9Upprepad screening med lung-CT och GM
• Mindre empirisk behandling (Maertens 2005)
Galactomannan
9 Screening av serum för tidig detektion av invasiv
aspergillos hos neutropena ell. stamcellstransplanterade
patienter
9 Hur bra är det för icke-hematologiska patienter?
9Analys av bal
9 Känslig metod för hematologiska och ickehematologiska patienter (organtransplanterade, ICU,
AIDS)
9 Högt positivt prediktivt värde
9 Konfirmerande diagnostisk test under pågående
sjukdom
1-3-beta-D-Glucan antigen
• Candida, Aspergillus, Fusarium, Pneumocystis
• Ej hos zygomyceter
• Låga nivåer Cryptococcus
• Serum
β-glucan
En proteas-zymogen-baserad
kolorimetrisk kinetisk analys
β-glucan
• Varierande känslighet i olika studier
• Högt negativt prediktivt värde
• Begränsningar
• Data för nyfödda och spädbarn <6 mån saknas
• Falskt positiva testresultat
• Glukaninnehållande gasväv
• Hemodialyspatienter
• Antibiotika med svampursprung (piperacillin)
• Albumin och immunoglobuliner
• β-glucan reaktivitet hos P. aeruginosa, A. faecalis, S.
pneumoniae
Cryptococcus
Antigen påvisning
Likvor, serum, urin
Latex test
• Kommersiell
• Mycket känslig
EIA test
•
Samma känslighet
som agglutination
Molekylär diagnostik
rDNA av Aspergillus target för PCR
PCR
•
PCR ingår inte i EORTC definition
av sannolik IFI diagnos
• Standardisering av metodik
behövs
• In house
• Få kommersiella metoder
• Europeisk initiativ ISHAM:
• Olika PCR metoder
•
•
Detektion ok
DNA extraktion fungerar sämre
PCR
Kvarvarande frågor:
• Optimal provmaterial
• Serum/plasma: fritt DNA
• Helblod: cell-associerad DNA
• Huddinge analyserar både plasma och cellfraktion
• Likvor: både fritt och cell-ass. DNA
• Biopsier (färska prov)
• Bal: fördel att svamp (jäst, conidia ell. hyfer) finns
• Kinetik av Aspergillus DNAemia i blodet
• Tidpunkt för provtagning
