Domesticering av mikroorganismer

Årsrapport 2003
för
Forskningsprogrammet
DOM
Domesticering av mikroorganismer
MISTRA-stödd forskning
Stiftelsen för miljöstrategisk forskning – MISTRA – bildades 1994 med pengar från de
tidigare löntagarfonderna.
MISTRA stöder miljöstrategisk forskning, varmed avses forskning med ett långsiktigt
perspektiv inriktad på att lösa viktiga miljöproblem
•
av högsta vetenskapliga kvalitet
•
vägledd av en vision om ett mera miljöanpassat samhälle
•
med systemförändringar för resurshushållning, kraftigt minskad miljöpåverkan eller
väsentlig ny kunskap om miljöproblem och deras inbördes vikt som mål
•
med Sveriges konkurrensförmåga för ögonen
•
med tydliga och avläsbara mål, som möjliggör en effektiv uppföljning.
MISTRA finansierar programmet DOM sedan 2002.
MISTRA kan kontaktas på Gamla Brogatan 36-38, 111 20 Stockholm, tel 08-791 10 20,
Webbplats: www.mistra.org
Styrelsen för programmet DOM
Programstyrelsen, som är utsedd av programvärden, SLU, i samråd med MISTRA, har det
övergripande ansvaret för programmet. Den bestod under år 2003 av följande ledamöter:
Ingvar Wiberger, Ordförande
VD, SLU Holding
Kersti Gustafsson
Sakkunnig
Kemikalieinspektionen
Lena Häggström
Professor
KTH, Inst f bioteknologi
Tommy Lundgren
Teknisk chef Marksanering
SITA Sverige AB
Anders Hartman
VD, BioAgri AB
Lennart Persson
VD, MediPharm AB
Bilden på Årsrapportens framsida visar frystorkade mjölksyrabakterieformuleringar mot en bakgrund av celler
av jästsvampen Saccharomyces cerevisae.
Foto Åsa Schoug/Petter Melin
Domesticering av mikroorganismer
DOM
Årsrapport 2003
Innehåll
Sida
Domesticering av mikroorganismer
3
DOM under 2003
Program I och II Fermentering och formulering
av mikroorganismer för nya användningsområden
5
Program III Säkerhet
7
Projekt 1 Biologisk bekämpning
av växtsjukdomar med gramnegativa bakterier
8
Domestication of microorganisms (summary in English)
11
Projekt 2 Konservering av foder och livsmedel
med jästsvamp och mjölksyrabakterier
15
I. Fysiologi och överlevnad hos jästsvampen Pichia anomala
15
II. Formuleringsfysiologi för Lactobacillus plantarum och
Lactobacillus coryniformis Si3
16
Projekt 3 Bioremediering
18
Formella nätverk och kontaktpersoner
21
DOM-programmets maskinpark
22
Ekonomisk redovisning
23
Publikationer
23
Konferenser och workshops
23
Domesticering av mikroorganismer (DOM)
Visionen för MISTRA-programmet Domesticering av mikroorganismer (DOM) är att bygga
upp kunskap och kompetens – både akademisk och kommersiell – som aktivt kan stödja
svensk bioteknikindustri vid odling, formulering och säkerhetsvärdering av nya ”icke-konventionella” mikroorganismer. Sådana organismer kan användas i tillämpningar såsom biologisk
bekämpning av skadegörare, konservering av livs- och fodermedel samt rening av förorenad
jord.
Programmet verkar för att uppnå ett av de 15 nationella miljökvalitetsmålen – en giftfri
miljö – och stöder samtidigt den svenska industrin i strävan att omsätta nya forskningsrön i
konkurrenskraftiga produkter.
- att uppnå de nationella målen gällande
giftfri miljö, genom att mikroorganismer ersätter kemiska medel.
- att utnyttja mikroorganismer för biologisk bekämpning, säker lagring av
foder- och livsmedel samt för nedbrytning av oönskade ämnen i miljön.
Idag fattas det kunskap
Mikroorganismer kan reducera miljöproblem, t.ex. kan de ersätta kemiska
preparat som utnyttjas som bekämpningsmedel och även användas för nedbrytning
av giftiga ämnen i miljön. Detta kräver
storskalig produktion av mikroorganismer
och ett omfattande formuleringsarbete för
att skapa marknadsmässiga, lagringsstabila
och lättanvända produkter. En förutsättning
är också att produkterna, som oftast är
baserade på nyisolerade mikroorganismer,
är säkra. Det gäller såväl säkerhet för
personal vid produktion och användning
som för miljön vid spridning av stora
mängder mikroorganismer i naturen.
Denna svenska kompetensplattform skall
också gynna svenskt företagande på området genom att överbrygga ”dödsdalen”
mellan akademiska forskningsresultat och
kommersiella tillämpningar. I denna brukar
ofta många bra upptäckter och uppfinningar duka under i brist på marknadskunskap, resurser och styrning. Den
kompetens som utvecklats inom DOM
kommer att tillhandahålla effektiva lösningar som medger säkert utnyttjande av
mikroorganismer odlade och formulerade
på ett kostnadseffektivt sätt.
Intresset för biologiska bekämpningsalternativ ökar i samhället, men huvuddelen av våra växtskyddsmedel och
konserveringsmedel är fortfarande kemikalier, exempelvis utgjorde de 1998 hela
98 % av alla sålda bekämpningsmedel.
Runtom i världen har man lyckats isolera
många biologiskt aktiva antagonistiska
mikrorganismer. Fortfarande saknar vi
emellertid mycket nödvändig kunskap om
storskalig
kommersiell
odling
och
formulering liksom rutiner för en relevant
och snabb säkerhetsbedömning.
Nödvändigt med nära samspel mellan
akademi, myndigheter och företag
För att nå målen krävs en systematisk uppbyggnad av kontakter med myndigheter i
Sverige och EU, liksom ny kunskap inom
områden som fermentering (odling),
formulering och säkerhetsvärdering. Brister i dagens kunskap måste identifieras i
samverkan mellan akademi, näringsliv och
myndigheter eftersom lösningarna måste
vara säkra både för miljö och människor
och vara ekonomiskt hållbara. Det kräver
”öppenhet” från industrin kring de ”verkliga problemen”, parallellt med medvetenhet hos universitetsforskare om betydelsen
av sekretess vid hantering av innovativa
idéer i tidiga utvecklingsstadier. Detta
samtidigt som en akademisk publicering är
I morgon ett ”Center of Excellence”
I visionen för forskningsprogrammet
”Domesticering av mikroorganismer ” är
ett slutmål att under den 8-åriga
programperioden skapa ett ”DOM Center
of Excellence”. Detta centrum skall aktivt
medverka till:
3
ställningar är välkomna att bli medlemmar
i ”intresseföreningen”
nödvändig för meritering och snabb
spridning av nya idéer, testning och utveckling i samspel med hela det internationella vetenskapssamhället.
Matrisorganisationen - en förutsättning
för snabbt innovationsarbete
Intresseförening öppen för alla företag
DOM-programmets mål är att bygga upp
högkvalitativ forskning inom de tre centrala områdena, samt mekanismer för att
identifiera och utveckla innovativa lösningar till väl fungerande kommersiella
tjänster och varor. Detta ställer speciella
krav på arbetssätt och organisation.
Medverkan från företagen regleras genom
avtal om sekretess och projektmedverkan,
samt ren uppdragsforskning m.m. Tack
vare att forskargruppen avtalat om en
gemensam hantering av patenterbara uppfinningar och upptäckter kan avtal med
intresseföretagen även omfatta dessa delar
vilka är mycket viktiga ur kommersiell
synpunkt. Gruppen av intresseföretag
består idag av BioAgri AB, Medipharm
AB, SITA Sverige AB, Jästbolaget AB,
Acanova AB, och den växer hela tiden.
Alla företag med intresse av DOM-fråge-
Kunskapsuppbyggnaden inom de tre programområdena, odling, formulering och
säkerhet utgår från fyra typorganismer.
Utmärkande för dessa är att de har belagda
biologiska effekter och representerar olika
taxonomiska grupper av mikroorganismer
med intressanta biologiska egenskaper.
Översikt av delprogram och projekt inom DOM.:
I projekt 1 ”Biologisk bekämpning av växtsjukdomar med gramnegativa bakterier” är modellorganismen Pantoea, en lättodlad, men svårformulerad, gramnegativ bakterie; i projekt 2
”Konservering av foder- och livsmedel med jästsvamp och mjölksyrabakterier” är modellorganismerna en jästsvamp och två mjölksyrabakterier; och i projekt 3 ”Bioremediering”
studeras svårodlade, men stresståliga, grampositva bakterier.
Dessa organismer och de problem de löser beskrivs närmare i de följande delarna av årsrapporten.
4
DOM under 2003
Frågeställningar, aktiviteter och resultat i program och projekt
Program I och II:
Fermentering och formulering av mikroorganismer för nya användningsområden
Personal: Dr Thomas Eberhard, och Dr Sebastian Håkansson är ansvariga seniorforskare för
odling respektive formulering sedan våren 2003.
Begränsad kunskap om odling och formulering
Odling av mikroorganismer i industriell skala har generellt syftat till produktion av metaboliter såsom etanol eller proteiner (enzym), inte till att framställa mikroorganismen som sådan.
Litteraturen om odling av mikroorganismer i syfte att få lagringsstabila, livskraftiga organismer är därför mycket begränsad. Den akademiska forskningen har ofta bedrivits med satsvis
odling i skakflaskor, en billig och enkel metod för småskalig odling. Den ger emellertid låg
reproducerbarhet och mycket begränsade möjligheter att styra tillväxtförhållandena. Den
industriella forskningen har tillgång till fermentorer där odlingen noga kan styras, men få
öppna publikationer om detta finns tillgängliga. Värdet av dessa begränsas också av att man
använder industriella odlingssubstrat med ofullständigt beskriven sammansättning och att det
fysiologiska tillståndet vid skörd sällan beskrivs. Det senare har mycket stor betydelse för
slutresultatet av formuleringen.
och den formuleringsteknik man ämnar
använda.
Tillsatsämnen - behövs de för maximal
överlevnad?
Stress - en förutsättning för överlevnad?
Formulering av mikroorganismer görs för
att få en hanterlig, lättapplicerad och
lagringsstabil produkt. Oavsett vilken
formuleringsteknik och lagringsform man
använder sig av så kommer mikroorganismerna att utsättas för stress. De allra flesta
organismer har inbyggda mekanismer för
att skydda sig mot ogästvänliga yttre förhållanden. Exempelvis kan en period av
tillvänjning med en mild form av stress
såsom svält, högre eller lägre temperatur
samt ökad salthalt (ökat osmotiskt tryck)
ofta leda till bättre förmåga att överleva
hårdare efterföljande stressituationer – s.k.
adaptiv respons. De cellulära skyddsmekanismerna innefattar både produktion av
speciella stressproteiner och lågmolekylära
föreningar – kompatibla substanser –
vilkas roll är att skydda proteiner och cellmembran från denaturering och skadliga
fasomvandlingar. För att uppnå en så hög
överlevnad som möjligt behöver man
därför undersöka vilken förbehandling som
ger bäst resultat för den mikroorganism
Genom att tillsätta ämnen som ger ett yttre
skydd mot miljömässiga och mekaniska
påfrestningar kan överlevnaden förbättras.
Tillsatsämnena kan vara kompatibla substanser som mikroorganismerna själva producerar, som t.ex. disackarider, aminosyror
och aminosyraderivat. Andra tillsatsämnen
har till huvudsyfte att göra produkten mer
användarvänlig (flödighet, lättlöslighet och
reducerad dammbildning). Tillsats av
näringsämnen i formuleringen kan också
förbättra de initiala tillväxtförutsättningarna för mikroorganismerna vid appliceringen. Varje ny mikroorganism kommer
sannolikt att kräva speciella lösningar.
Lagring - torrt, vått eller kallt ?
Med undantag av probiotika och läkemedelsprodukter är de vanligaste mikrobiella
formuleringarna våtformuleringar. Våta
formuleringar är ofta billigare men kräver
5
välutrustat fermenterings- och formuleringslaboratorium, tillgängligt för både
forskare och bioteknikindustri. Vidare
krävs en dokumentation som visar befintlig
kunskap och information om odling och
formulering av olika typer av mikroorganismer samt en rutin för fortlöpande
uppdatering. Detta sker med s.k. syntesdokument som idag finns för jäst och
gramnegativa organismer.
dyr kylförvaring och kan ha begränsad
långtidsöverlevnad. Den vanligaste våtformuleringen är oljeemulsioner där
mikroorganismerna ligger i mikroskopiska
vattendroppar skyddade av den omgivande
oljan. Infrysning – kryopreservering – är
en annan form av våtformulering som
också ställer stora krav på förvaringsförhållanden och hanteringskedja.
Torra formuleringar har flera potentiella
fördelar. Förvarings- och distributionskostnaderna är generellt lägre och långtidsöverlevnaden kan vara bättre om förpackningen av produkten utförs på ett bra sätt,
t.ex. genom vakuumförpackning eller med
kvävemättad atmosfär. Nackdelar kan vara
höga produktionskostnader och problem
med att efter torkning uppnå tillräckligt
hög initial överlevnad.
Utrustning, odling och mätning
Under detta inledande år har ett funktionellt fermenterings- och formuleringslaboratorium etablerats. Två forskare har
ansvar för nödvändig utrustning för laborativt mikrobiologiskt arbete. Maskinparken
består idag av tre 14-liters Belach-fermentorer, varav två tillhör BioAgri, samt en 1liters fermentor. Under året har ett tjugotal
fermenteringar med jästen Pichia anomala
och den gramnegativa bakterien Pantoea
agglomerans utförts. Förutom att träna
handhavandet av apparaturen och odlingsrutiner har de odlade organismerna använts
i både fältförsök och formuleringsexperiment. Användning och utveckling av
industriella medier har påbörjats.
Frystorkning är standardtekniken inom
läkemedelsindustrin och vid probiotikaframställning och anses vara den skonsammaste torkningsformen. Men den kan
vara alltför dyr för priskänslig storskalig
produktion. Olika former av lufttorkning
såsom spraytorkning och fluidiserad bäddteknik används också men kan än så länge
bara utföras med mycket tåliga mikroorganismer. Vakuumtorkning har inte
använts i någon större utsträckning men
har visats vara en lovande teknik för
gramnegativa bakterier.
En utvärdering har inletts av möjligheterna
att använda Nära Infraröd Reflektans
(NIR)-mätningar med ett Foss NIR system
Model 6500, för att följa fysiologiska
tillstånd under olika tillväxtfaser.
Kunskap om mikrobiell formulering finns
framförallt inom starterkulturindustrin.
Den bygger i hög grad på empiriska erfarenheter som betraktas som industrihemligheter. Inom den biologiska vetenskapen är formuleringsfältet starkt eftersatt, men det finns i gengäld stor kunskap
kring stressfysiologi hos flera mikroorganismer, vars tillämpning på formuleringsaspekter ännu inte undersökts.
En anläggning för vakuumtorkning av
mikroorganismer har konstruerats i samarbete med reglerteknikföretaget Eurotherm AB i Malmö.
En pilotfrystork, FTS LyoStar II, har anskaffats av DOM-programmet. Denna har
mycket goda styr- och dokumentationsmöjligheter för forskning och processutveckling. Den har dessutom tillräcklig
kapacitet för produktion av mikrobiella
formuleringar för fältförsök.
Målsättning inom odlings- och formuleringsprogrammet
Vi har även påbörjat kartläggningen av för
formulering relevant stressfysiologi hos de
olika modellorganismerna. Detta beskrivs
närmare under de olika delprojekten.
Det övergripande målet är att finna generellt tillämpliga modeller för att utveckla
de olika stegen i odling och formulering av
nya mikroorganismer. För detta krävs ett
6
Program III - Säkerhet
Personal
Docent Ingvar Sundh är sedan mars 2003 ansvarig senior forskare för säkerhetsfrågor.
Slutförandet av tidigare åtaganden medförde att Sundhs förordnande i DOM stannade vid
50 % under 2003.
Biotekniska mikroorganismer
Användningen av storskaligt odlade mikroorganismer i tekniska tillämpningar regleras i
Miljöbalken (1998:808). Där definieras biotekniska organismer som produkter "som har framställts särskilt i bekämpningssyfte eller något annat tekniskt syfte och som helt eller delvis
består av eller innehåller levande mikroorganismer". Alla mikroorganismer som kan tänkas
vara intressanta för DOM-programmet faller under denna definition. DOM tar sikte på potentialen hos organismer som förekommer naturligt i ekosystemen eller lantbrukets produktionssystem. Genetiskt modifierade mikroorganismer faller under särskild lagstiftning och innefattas inte i biotekniska organismer som de definieras i miljöbalken.
brytning av organiska föroreningar i mark,
produktion av substanser med antagonistiska effekter gentemot andra mikroorganismer, kolonisation och spridning av
mikroorganismer i olika miljöer, samt
grundläggande kunskaper om patogenicitet
hos olika organismgrupper. Fragmentiseringen av kunskapen beror säkert till viss
del på att det vid olika tillämpningar delvis
är olika säkerhetsfrågor som kan förväntas
vara mest aktuella och att kunskapen
stannat inom de olika disciplinerna. Det
finns därför ett mycket stort behov av att
från dessa olika discipliner samla in, syntetisera och utvärdera vetenskaplig information
rörande eventuella risker vid storskalig
odling och bioteknisk användning av
naturligt förekommande mikroorganismer.
Omfattande krav på dokumentation
Kraven på godkänd dokumentation och
registrering (hos regering eller av regeringen utsedd myndighet) av produkter med
biotekniska mikroorganismer formuleras i
direktiv och förordningar på EU-nivå. Lagstiftningen styrs i hög grad av den avsedda
användningen. Exempelvis är kraven för
biologiska bekämpningsmedel, innefattande
både växtskyddsmedel och biocider, högre
än för organismer som är avsedda att användas för att bryta ner giftiga ämnen i
förorenad mark. En förklaring till detta kan
vara att regelverken för biologiska bekämpningsmedel i grunden är desamma som för
kemiska bekämpningsmedel, där användningen varit hårt reglerad under en lång tid.
Det finns alltså inget samlat regelverk för
registrering och godkännande av produkter
med biotekniska organismer. Detta kan
innebära svårigheter ifall en och samma
mikroorganism visar sig vara en intressant
kandidat för flera skilda tillämpningar.
Centrala säkerhetsfrågor för DOMprogrammet
Vid säkerhetsbedömning av produktionen
och användningen av en produkt som
innehåller biotekniska mikroorganismer är
det flera aspekter som måste beaktas:
Säkerhetsfrågor spänner över flera
discipliner
• Eventuella hälsorisker för människor
vid odling, formulering och användning.
Patogenicitet, toxicitet och allergener
måste beaktas, liksom resthalter i växtprodukter och livsmedel.
Den vetenskapliga kunskapen om säkerhetsfrågor vid odling och användning av
biotekniska organismer är spridd inom
flera grenar av det mikrobiologiska forskningsområdet. Exempel är livs- och fodermedelsmikrobiologi, mikrobiella interaktioner i växternas rotzon, mikrobiell ned-
• Risken för negativa effekter i miljön.
Här måste risken för patogenicitet eller
toxicitet mot andra organismer än
7
spridningsvägar för organismerna efter
användning, d.v.s. risken för förekomst
av rester av preparaten, på skördade
växtprodukter eller på livsmedel efter
förädling.
människor beaktas. Det behövs också
information om organismens överlevnad och spridning i ekosystemen och
dess effekter på den naturliga diversiteten hos mikroorganismer och på
viktiga processer i systemet.
Aktiviteter och resultat under 2003
För att klargöra ovanstående är följande
aktiviteter centrala i DOM-programmet:
De viktigaste saker som uppnåtts under
2003 är:
1. Att aktivt påverka och följa utvecklingen
inom de regelverk som reglerar
utsläppandet på marknaden och användningen av biotekniska mikroorganismer.
Detta är särskilt viktigt eftersom registeringsrutinerna inom EU fortfarande är
under utveckling och få produkter
hittills fått ett slutgiltigt godkännande.
• Säkerhetsföreskrifter för laborativt
arbete med mikroorganismer har
sammanställts
• Ett testprogram för bedömning av
toxicitet och patogenicitet hos mikroorganismer har formulerats.
• Kemikalieinspektionen har biståtts vid
diskussioner i EU angående färdigställandet av Annex VIb (Uniform principles for evaluation and authorisation
of plant protection products containing
microorganisms) till direktiv 91/414,
som reglerar utplaceringen av växtskyddsmedel på marknaden.
2. Att designa och sätta upp ett relevant
testprogram för eventuella negativa
humana
hälsoaspekter.
Potentiella
DOM-organismer skall genomgå ett
sådant program på ett tidigt stadium.
3. Att syntetisera och utvärdera den
fragmenterade vetenskapliga kunskapen
om säkerhetsaspekter vid användning av
mikroorganismer (bakterier och jästsvampar) i biotekniska tillämpningar, i
första hand som biologiska växtskyddsmedel, vid biologisk bekämpning av
lagerskadesvampar och vid biologisk
sanering av förorenad mark. Identifiering av de viktigaste säkerhetsfrågorna
för respektive DOM-organism och
bioteknisk användning är centralt för
identifieringen av de mest angelägna
frågeställningarna för experimentell
säkerhetsforskning.
• En meNY-cirkel för biotekniska företag, med arbetsnamnet "Riskvärdering
och registrering av mikroorganismer"
har planerats.
• Regelverk i Sverige och internationellt
har inventerats. Exempelvis EU-direktiv
1994/40 Bedömning av tillsatser i djurfoder, 1998/8 Utsläppande av biocidprodukter på marknaden, 1991/414
Utsläppande av växtskyddsmedel på
marknaden (+ 2001/36 tillägg för
preparat innehållande mikroorganismer
eller virus), och US EPA:s regelverk för
biologiska pesticider.
4. Att för aktuella DOM-organismer och
tillämpningar klargöra överlevnad och
Projekt 1:
Biologisk bekämpning av växtsjukdomar med gramnegativa bakterier
Personal
I projektgruppen har under 2003 ingått professor Berndt Gerhardson och Dr Margareta Hökeberg med delat ansvar som projektledare samt Dr Jens Levenfors. DOM:s programforskare Dr
Thomas Eberhard (fermentering), Dr Sebastian Håkansson (formulering) och Doc Ingvar
Sundh (säkerhetsvärdering) har också varit engagerade i projektet. För teknisk utveckling av
appliceringsutrustning har personal från Institutionen för Lantbruksteknik, SLU, deltagit.
8
Ersätta kemisk behandling av snömögel
Utvintringssjukdomar, orsakade av Fusarium- och Microdochium-svampar, är ett mycket
stort växtodlingsproblem under skandinaviska klimatförhållanden. Det är inte ovanligt att
över hälften av de höstsådda vete- eller rågplantorna på ett fält dör under vintern på grund av
dessa svampar. Lantbrukaren är då tvingad att till höga kostnader så om fältet på våren. Eftersom sjukdomarna riskerar att ge så omfattande skador i höstsådd stråsäd, är användningen av
kemiska bekämpningsmedel stor. Sjukdomsbekämpande mikroorganismer skulle här kunna
utgöra ett miljövänligt alternativ till den kemiska bekämpningen. Gramnegativa bakterier med
god effekt mot dessa utvintringssjukdomar finns, men kunskaper och erfarenheter för att
kunna utveckla dessa bakterieisolat till användbara produkter är tyvärr bristfälliga.
bibehållen
bekämpningseffekt
hos
gramnegativa bakterier?
- Kan nya principer inom appliceringsmetodik ge bättre effekt och effektstabilitet hos gramnegativa sjukdomsbekämpande mikroorganismer?
- Är det möjligt att finna generella
kriterier för säkerhetsbedömning av
mikroorganismer för att underlätta
myndigheternas handläggning utan att
äventyra säkerheten?
Det största problemet med de gramnegativa bakterierna har varit att uppnå tillräcklig lagringsöverlevnad för att möjliggöra praktisk användning. Organismer som
utsätts för kontrollerad stress har visat sig
få ökad stresstålighet, bättre kunna uthärda
olika konserverings- och torkningsmetoder, och därmed efterföljande lagring.
Den formulering man tagit fram måste
också anbringas på växten på ett sådant sätt
att mikroorganismerna befinner sig på rätt
plats vid rätt tid och i rätt fysiologiskt tillstånd. Hittills har främst appliceringsteknik
utvecklad för kemiska bekämpningsmedel
använts för biologiska bekämpning. Vi tror
att det finns möjligheter att förbättra den
biologiska bekämpningens effekt genom
att anpassa den befintliga appliceringsmetodiken till levande mikroorganismer.
De tekniska kvalitetskriterierna hos en
formulering har också ofta underskattats,
vilket lätt leder till sämre acceptans hos
användare. Här är viktigt att man vid val av
formuleringstyp tar hänsyn till tänkt
appliceringsmetod.
Vetekärnor på filterpapper för test av förekomst av
utsädesburen Fusarium spp
Aktiviteter och resultat under 2003
Fermentering och formulering
Som modellorganism använder vi inom
projektet ett gramnegativt bakterieisolat,
Pantoea agglomerans, som kommer från
åkerjord. Inom ett tidigare MISTRAprogram (MAaF) visade detta isolat,
applicerat på frö, en mycket god förmåga
att bekämpa utvintringssjukdomar, s.k.
snömögel i stråsäd orsakade av Fusariumoch Microdochium-svampar.
Ett protokoll för fermentering av P. agglomerans upp till ca 10 liter har utvecklats.
P. agglomerans tål hög saltkoncentration. I
samarbete med Dr Anders Broberg vid
institutionen för kemi, SLU, har bakterieceller som växt vid olika salthalter analyserats med hjälp av proton-NMR (Nuclear
Magnetic Resonance). Denna teknik medger identifiering av substanser som
ansamlas i cellen under stress. Resultaten
visar att främst sockret trehalos och glycinbetain ackumuleras vid osmotisk stress.
Halterna av aminosyrorna glutamin och
glutamat ökar också inuti cellen med ökad
saltmängd i mediet.
Centrala forsknings- och utvecklingsfrågor
- Kan kombination av olika metoder
inom fermentering, stressfysiologi och
formulering ge nya formuleringskoncept med förbättrad lagringsbarhet och
9
H-NMR data från P. agglomerans odlad med 0.8 M
NaCl i mediet.
P. agglomerans ackumulering av trehalos
har betydelse för formuleringsarbetet,
eftersom denna sockerart anses vara den
kompatibla substans som ger bäst cellulärt
skydd vid fullständig uttorkning. Inledande
försök med lufttorkning av bakterien visar
att osmotisk förbehandling har en positiv
effekt på överlevnaden. Tillväxt i närvaro
av en förhöjd saltkoncentration i mediet
resulterar i 20 % överlevnad efter lufttorkning och tre veckors förvaring i rumstemperatur, att jämföra med 2 % hos celler
som ej förbehandlats.
Fältförsök i höstvete, hösten 2003
Den gramnegativa modellorganismen
P. agglomerans, samt några andra gramnegativa bakterier testades med olika
appliceringsregimer i fält mot utsädesburen
Microdochium/Fusarium spp. i vete,
sommar- och vinterfläckar i golfgreener
och mot lackskorv i potatis.
Resultat från lufttorkning av bakterieisolatet
visar att ökad torktolerans korrelerar med
ackumulering av kompatibla substanser
som trehalos och glycinbetain. Lufttorkningsförsöken har även visat att detta bakterieisolat förefaller vara en tämligen härdig organism. Fortsatt optimering av förbehandling, dehydreringsmedier samt användandet av alternativa torkningstekniker bör
kunna öka torkningsöverlevnaden väsentligt.
”Vinterfläck”/Snömögel i golfgreen, hösten 2003,
orsakat av Microdochium nivale.
”Sommarfläck” i golfgreen, hösten 2003.
För att utveckla såmaskinsutrustningen
testades under våren P. agglomerans mot
Drechslera teres och Bipolaris sorokiniana
i korn. Huvudinriktningen har emellertid
varit att testa P. agglomerans mot snömögel (Microdochium nivale) i vete. De
fältförsök i vete som lagts ut i höst med de
olika bakteriekandidaterna är planerade för
att ge svar på behandlingseffekter mot snömögel av olika appliceringsregimer såsom
betning och direktbehandling
Lufttorkade P. agglomerans MF626.
Applicering
En fältmässig prototyputrustning med en
ny appliceringsprincip för direktbehandling
med mikroorganismer har utvecklats inom
projektet. Utrustningen testades och vidareutvecklades i fältförsök som lades ut
under våren och sommaren 2003. Under
hösten 2003 lades fältförsök i vete ut för
att testa bakteriebehandling mot snömögel.
10
Domestication of microorganisms DOM
Bridging the gap between academy and market
Microorganisms are increasingly being used to reduce environmental problems, for example
in biocontrol to replace chemical pesticides and in bioremediation to degrade toxic
compounds in the environment. Many applications require large scale fermentor production of
microbial inoculants, followed by formulation steps for long term stability and ease of
environmental dissemination. Safe use requires careful consequence analyses, often followed
by a registration procedure. Presently, lack of knowledge about fermentation/formulation
technologies and consequence analyses for novel microorganisms, seriously prevents their
implementation to solve environmental problems and to contribute to growth of novel
biotechnology industries. The DOM research programme supports Swedish biotechnology
industries by bridging ”the information gap” between universities, industries and regulatory
authorities.
Generic knowledge about products for biocontrol and bioaugmentation
Three programme researchers are developing generic knowledge on fermentation, formulation
and safety assessments of domesticated microorganisms. This knowledge base will support
initial organism-oriented research projects covering biocontrol, biopreservation and bioremediation applications with both bacteria and fungi. Microorganisms applied in the environment need to maintain viability and metabolic activity after prolonged storage. Their activity
is influenced by fermentation and formulation procedures and substantial effort will go into
understanding microbial stress physiology at the organism, mRNA, protein and metabolite
levels during inoculum development steps. Initially model microorganisms used for biocontrol of agricultural plant pathogens, biopreservation of food and feeds, and bioremediation
of toxic compounds, will be studied. Safety assessments are part of all research projects.
Fermentation and formulation of microorganisms for non-conventional
applications
• Establish a well functioning fermentation and formulation laboratory for the
study of non-conventional microorganisms and support of commercial
development.
Fermentation parameters, such as nutrients,
aeration, temperature and pH, are available
in the literature for some microbial species.
However, this information is biased
towards yeast and some bacteria (E. coli,
Bacillus spp., certain lactic acid bacteria)
that are currently used routinely in food
and biotechnology industries. Less is
known about optimum growth parameters
for fermentation of non-conventional
microorganisms.
Knowledge
about
formulation strategies such as preconditioning of the microorganisms and
use of additives that promote survival,
storage stability and ease of use exists
mainly in the biotechnology industries and
is not generally accessible. The academic
knowledge on stress physiology of certain
model organisms is large, but its applicability to formulation issues is generally not
investigated. Our goals are to:
• Synthesise existing information on
fermentation and formulation for
different types of microbial inoculants
based on lactic acid bacteria, Gram
positive and Gram negative bacteria and
yeasts.
• Create a Center of excellence to support
a world leading Swedish Biotechnology
industry by bridging “the gap” between
university research, industry and
regulatory authorities.
The domestication of microorganisms for
environmental applications will help to
achieve national goals towards a “non
toxic” environment.
11
Equipment
The DOM laboratory is now established with standard equipment used for microbiological
work, necessary machinery such as small and medium scale bioreactors, a vacuum drying
system, an advanced pilot-scale freeze dryer and a flow cytometer. Existing knowledge on
fermentation and formulation of non-conventional yeasts and Gram-negative bacteria have
been synthesized in two documents. The stress-physiology relevant to formulation and
preconditioning is being investigated for the yeast Pichia anomala and the Gram-negative
bacterium Pantoea agglomerans. Initial focus is on the impact of starvation and osmotic
stress on accumulation of compatible solutes and viability and storage stability following
formulation.
Safety assessments of non-conventional microorganisms
• to design a simple program for testing
pathogenicity and toxicity against
humans
• to summarise and evaluate knowledge
regarding safety aspects when using
bacteria or yeasts, as biological plant
protection products, for biopreservation
of feed grain, or for bioremediation of
polluted soil
• to clarify survival and environmental
spread of the organisms after use
For registration of products containing
microorganisms, the need for safety
documentation
regarding
the
microorganism and the product containing
the organism differs depending on the
intended use. Today, the registration of
such products is regulated by several
separate EU-directives. Different aspects
of safety
may be important when
microorganisms
are
used
in
biotechnological
applications.
The
possibilities of patogenicity or toxicity
against humans during handling of the
organisms and products must be
considered. Potential negative effects on
the health of other organisms in the
environment, as well as on ecosystem
structure and function after product
application are also of interest.
During 2003 an overview of regulatory
guidelines for biotechnical organisms was
achieved and a set of tests for toxicity/pathogenicity of DOM organisms was
designed. The planning of a course on
“Risk assessment and registration of microorganisms” for biotechnical companies
was started. DOM assisted the Swedish
National Chemicals Inspectorate with work
on Annex VIb (Uniform principles for
evaluation and authorisation of plant
protection products containing microorganisms) to EU Directive 91/414.
The main aim is to develop a framework
for evaluation of the suitability of certain
microorganisms to be developed into
biotechnical products for biocontrol,
biopreservation or bioremediation. Specific
goals are:
Organism-oriented projects
Project 1. Biological control of plant diseases with Gram negative bacteria
Snow mould and Fusarium-diseases cause severe yield losses in Scandinavian winter wheat
and rye. Therefore, chemicals are commonly used to control the soil- and seed borne plant
pathogens, Fusarium spp. and Microdochium nivale (snow mold), which are responsible for
these yield losses. Certain Gram negative bacterial isolates from soil have suppressive effects
towards these pathogens at the experimental scale. However, it has been difficult to prepare
products from these organisms with sufficient storage stability. Important criteria for
formulation are the technical quality parameters, which have to be compatible with the chosen
application regime. Development of application technology, especially designed for
microbiological products, will increase the effect level and stability of biocontrol products.
12
In this project the Gram negative
bacterium Panthoea agglomerans was
selected as a model-organism. This isolate
can effectively control cereal diseases
caused by Fusarium spp. and Microdochium nivale. A protocol for fermentation
of P. agglomerans has been developed.
Preconditioning experiments revealed that
osmotic stress yields the compatible substances trehalose and glycinbetain, which
improve the survival of the isolate after air
drying. Equipment for seed treatment of
liquid preparations during sowing was
developed. The P. agglomerans isolate,
and some other Gram negative strains,
were tested in field experiments against
snow mould in winter wheat and turf grass
on golf greens. Additional Gram negative
isolates were evaluated for effects against
Rhizoctonia solani on potatoes.
Project 2. Biopreservation of food and feeds
Stress physiology of the biocontrol yeast Pichia anomala
Mould growth can be prevented during airtight storage of moist cereal grain by inoculation
with the yeast Pichia anomala. The main objectives of this project have been to:
•
•
Develop efficient fermentation and formulation processes for P. anomala.
Investigate P. anomala stress responses during fermentation and formulation.
open vials within a larger closed vial with
a defined water activity and atmosphere.
The vials can then be stored at different
temperatures in specially designed
chambers. Normally, survival of yeast cells
is calculated by counting of colony
forming units (cfu). This is time consuming and instead a system using flow
cytometry to estimate the number of
surviving yeast cells has been developed,
using the equipment recently purchased by
the DOM programme.
A primary task is to find optimal liquid and
dry yeast formulations that can tolerate
extreme
storage
conditions.
Dry
formulations are more convenient to
handle and they can probably survive at
higher temperatures for prolonged periods.
The disadvantage of dry formulation is that
cells die during both the formulation and
the rehydration process. Therefore, we
have set up a system to investigate longterm survival of yeast cells under defined
specific conditions. The cells are stored in
Formulation physiology of antifungal lactic acid bacteria
Freeze-drying is a widely used drying technique for stabilizing heat labile material such as
microorganisms. The freeze-dried powder is quite porous and easily rehydrated in water. This
makes it a user friendly formulation. Two drawbacks of the method are the cost and the loss
of viability of certain strains.The freeze-drying process can be divided into three steps;
freezing, sublimation of “free water” (primary drying) and drying of “bound water”
(secondary drying).
Two model lactic acid bacteria with
industrially
interesting
antifungal
properties have been chosen in cooperaton
with
Medipharm
AB,
Kågeröd.
Lactobacillus plantarum 393 shows quite
good
freeze-drying
survival
while
Lactobacillus coryniformis Si3 dies to a
large extent. The knowledge on
optimisation of the freeze-drying cycle of
lactobacilli and mechanisms behind
stabilising additives (lyoprotectants) is
limited. Differential scanning calorimetry
and freeze-drying microscopy can be used
to elucidate the freeze-drying process, but
has until now primarily been used to
optimise the freeze-drying of proteins.
Studying the physiology of the bacteria, i.e
their natural dessication responses, in
relation to the freeze-drying process will
aid our understanding of freeze-drying of
lactobacilli and why the two model
bacteria studied in this project behave so
differently.
13
Project 3. Bioremediation with actinomycetes
Bioremediation of toxic pollutants has been extensively studied as a clean-up strategy over
the last 20 years. However, bioremediation is often limited by a lack of microorganisms
having the genes and corresponding enzymes necessary to degrade recalcitrant compounds.
Another problem is that sometimes the target compound is only partially degraded, leading to
accumulation of toxic metabolites. One way to overcome these limitations is to inoculate the
contaminated site with cells that have the catabolic enzymes required for complete
degradation of those compounds. This is a process referred to as bioaugmentation.
normally adapted to growth at much
higher temperatures in the laboratory.
Therefore, A. chlorophenolicus holds
promise as a treatment strategy for bioaugmentation of chlorophenol contaminated
areas in cold climates, such as Sweden. On
the other hand, A. chlorophenolicus is
limited by its narrow substrate specificity
since it only degrades p-substituted
phenols.
One critical challenge of bioaugmentation
is the selection of appropriate biodegrading
strains. The microbial world has incredible
metabolic diversity that has just begun to
be explored. Only 10% or less of the
microbial species on Earth have yet been
isolated and identified.
Actinomycetes are some of the most
common microorganisms in soil and
include several members that are renowned
for their ability to degrade a large number
of recalcitrant compounds. Therefore, they
are of great interest for bioaugmentation of
contaminated sites.
Since mono-substituted phenols are rarely
found as sole contaminants in Swedish
environments, a decision was made after
discussions with the DOM Board to survey
other promising inoculants that are more
directly applicable for clean up of
contaminated sites in Sweden. Towards
this aim, a mini-symposium was held on
November 4, 2003, with invited speakers
from Sweden and different countries, to
survey the situation in Sweden and to
discuss the most promising microbial
inoculants available for degradation of
problem pollutants in Sweden. Based on
the output of the symposium, we have
decided to focus on two actinomycete
strains for continued study within DOM
Project 3. The first strain, Arthrobacter
aurescens TC1, can degrade atrazine and
related compounds, whereas the second
strain, Rhodococcus strain “L”, can
degrade certain PAH compounds; both of
which are problematic contaminants in
Sweden.
Many actinomycetes not only have the
capacity to degrade a variety of compounds, but they are able to withstand
harsh environmental conditions, such as
cold temperatures. A case in point is the
actinomycete, Arthrobacter chlorophenolicus, that we previously isolated from soil
which can grow on and degrade up to
350 ppm 4-chlorophenol in pure culture
and 180 ppm in soil. This is the highest
4-chlorophenol concentration known to be
tolerated and degraded by a single
organism. We recently determined that
A. chlorophenolicus is a novel Arthrobacter species. A. chlorophenolicus can
degrade 4-chlorophenol in soil at low
temperatures and under extreme temperature fluctuations. This property is rare for
domesticated microbial strains, which are
14
Projekt 2:
Konservering av foder- och livsmedel med jästsvamp och mjölksyrabakterier
Personal
I projektgruppen har under 2003 ingått professor Johan Schnürer som projektledare samt Dr
Petter Melin och doktoranden MSc Pharm Åsa Schoug. DOM:s programforskare Dr Thomas
Eberhard (fermentering), Dr Sebastian Håkansson (formulering) och Dr. Ingvar Sundh (säkerhetsvärdering) har också varit engagerade i projektet.
Gamla trotjänare utgångspunkt för kunskapsuppbyggnaden
Jästsvampen Saccharomyces cerevisiae och mjölksyrabakterier har varit domesticerade under
tusentals år och använts för att tillverka bröd, öl och vin respektive yoghurt, ost, syrade grönsaker och ensilage. Idag vet industrin hur man odlar bagerijästen S. cerevisiae och även vissa
mjölksyrabakterier, t ex Lactobacillus plantarum. För båda organismerna finns också
betydande akademisk kunskap, bl.a. är deras genom sekvenserade. Trots detta finns stora
kunskapsluckor om formulering och långtidsöverlevnad. Under ett tidigare MISTRA-program
(MAaF) identifierades den mögelhämmande förmågan hos jästsvampen Pichia anomala och
isolat av Lactobacillus coryniformis och L. plantarum. I projekt 2 studeras olika aspekter av
formuleringsfysiologi för dessa organismer Tillgänglig kunskap om domesticering av jäst har
sammanställts i ett syntesdokument .
Delprojekt I: Fysiologi och överlevnad hos jästsvampen Pichia anomala
Vi har tidigare visat att P. anomala har stor
förmåga att förhindra mögeltillväxt i
spannmål med hög vattenhalt som lagrats
under syrebegränsning, s.k. lufttät lagring.
Fysiologin hos P. anomala har både likheter och skillnader med bagerijästen S. cerevisisae. Särskilda odlings- och formuleringsbetingelser måste därför utvecklas
för P. anomala, men man kan normalt utgå
från det som gäller för S. cerevisiae. De
båda arterna skiljer sig också åt genom att
P. anomala-celler är betydligt mindre.
mindre öppet kärl som är inneslutet i ett
större slutet kärl där både vattentillgängligheten och gassammansättningen kan regleras. Kärlen förvaras sedan i en specialbyggd värmekammare där värmen kan
regleras från +2 °C till 150 °C.
Kärl för förvaring av jästceller vid testning av
accerlererat åldrande.
Accelererat åldrande och flödescytometri
En formulerad jästsvamp måste kunna tåla
förvaring under lång tid. En utrustning har
därför utvecklats där man kan testa överlevnaden hos P. anomala under extrema
betingelser samt accelerera åldrandet hos
cellerna. Principen är att jäst förvaras i ett
Värmekammare med reglerbar temperatur.
15
I ett första steg mäter vi överlevnad hos
våtformulerad P. anomala, skördad under
olika tillväxtfaser och lagrade i värmekammare vid olika temperaturer. Nästa
steg är att undersöka överlevnaden hos
torkad jäst. Våtformuleringar har fördelen
att färre celler dör under själva formuleringsprocessen. Vid en torrformulering dör
ett stort antal celler både vid torkningen
och vid återfuktningen. Antalet överlevande jästceller mäts normalt som hur
stor andel av cellerna som kan växa på
agarsubstrat efter att de har formulerats och
förvarats. Denna process är omständlig och
resurskrävande. Vi har istället utvecklat en
metod att med flödescytometri snabbt
kunna avgöra hur stor andel av cellerna
som lever. Principen är att de döda cellerna
märks in med ett fluorescerande ämne och
på så sätt skiljs ut från de levande.
Med flödescytometri kan man enkelt skilja mellan
levande och döda jästceller. Region R1 innehåller
levande celler. R2 innehåller döda celler. I detta fall
har cirka 20% av cellerna överlevt en veckas
förvaring i 35 °C.
Proteomik för studier av interaktioner mellan organismer
För att få en ökad förståelse för hur olika mikroorganismer interagerar med varandra,
exempelvis i ett biokontrollsystem, kan man undersöka vad som händer på molekylär nivå i
de involverade organismerna. I närliggande projekt, ett avslutat och ett pågående, studerar vi
de proteiner som produceras av en skadesvamp när den utsätts för tillväxtinhiberande
bakterier. Våra kunskaper om hur man kan använda sig av proteomik för att studera interaktioner mellan mikroorganismer har sammanfattats i en review-artikel.
Delprojekt II:
Formuleringsfysiologi för Lactobacillus plantarum 393 och Lactobacillus coryniformis Si3
coryniformis Si3 dör i så stor grad vid frystorkning att produktutveckling inte
bedömts vara ekonomiskt möjlig. Den mer
robusta Lactobacillus plantarum 393 har
däremot god överlevnad efter frystorkning.
Kommersiell användning av mjölksyrabakterier kräver en hög överlevnadsnivå under
lång tid vid rumstemperatur. Förpackning
och förvaring av produkter i pulverform
har både produktmässiga (lätt att hantera
och frakta) och kemiska fördelar (reducerad
kemisk nedbrytning). De mjölksyrabakterieprodukter som finns på marknaden uppvisar relativt god stabilitet efter formulering och förpackning. Men vissa andra
mjölksyrabakteriearter med intressanta egenskaper dör i så stor utsträckning att det inte
blir ekonomiskt relevant att producera dem.
Frystorkning av mjölksyrabakterier
Frystorkning lämpar sig väl för värmekänsligt material och är den teknik som idag
huvudsakligen används för torrformulering
av mjölksyrabakterier. Torkningen sker vid
låg temperatur och det frystorkade materialet får en hög specifik yta, vilket underlättar snabb återfuktning. Den teoretiska
förståelsen av vad som sker med mjölksyrabakterierna i kombination med tillsatsämnen under processen är dock ännu
begränsad. Den tillämpade utvecklingen
drivs därför mest som ”trial and error”processer.
De mjölksyrabakterier som valts ut till
modellorganismer i detta projekt är framtagna i samarbete med starterkulturföretaget MediPharm AB, Kågeröd. De har
många likheter, båda är svamphämmande
och de tillhör samma släkte, men de beter
sig olika vid torrformulering. Lactobacillus
16
Frystorkningsprocessen kan åskådliggöras
med tre steg. Första steget i processen är en
nedfrysning av formuleringen. Efter nedfrysning följer en första torkningsfas där
”fritt” vatten ångas bort. För att ta bort allt
adsorberat vatten krävs därefter en andra
torkningsfas. Hur denna påverkar mjölksyrabakterierna under formuleringsprocessen är ännu tämligen okänt.
torkningsfasen sker vid temperaturer över
glasomvandlingstemperaturen för formuleringen, kollapsar provet. Kollaps innebär
total förlust av struktur och provet upplevs
som fuktigt.
Hur skall vi förstå vad som sker vid
frystorkning?
Det finns olika tekniker att tillgå för att
förstå vad som händer i en frystork och
karaktärisera formuleringar. Vi har använt
en teknik som kallas mikrokalorimetri
(Differential Scanning Calometry, DSC)
och som också används för optimering av
frystorkade proteinformuleringar. DSC går
ut på att mäta skillnader i värmekapacitet
mellan ett referensprov och formuleringen
och ger information om formuleringens
termiska beteende.
Temperatur
Ca 5 °C under Tg´
Produkt temperatur
0 °C
Nedfrysning
Primär torkning
Sekundär torkning
Generell skiss av en frystorkningscykel. Tg´ = En
glasomvandlingstemperatur.
De stabiliserande ämnen som används vid
frystorkning är framförallt olika sockerarter, men mekanismerna bakom effekten
är dåligt kända. Studier av djur som tål
extrem uttorkning (anhydrobionter) har
bidragit till ökad förståelse. Amorfa ämnen
som vissa sockerarter kan bilda glastillstånd. Glas betecknar en icke-kristallin,
fast fas där kemiska reaktioner sker mycket
långsamt p.g.a. den höga viskositeten.
Glastillstånd förmodas därför ha en stabiliserande roll. Sockerarter anses dessutom
kunna ta vattnets plats i lipidlager och
stabilisera cellväggen vid uttorkning.
Sample: S1
Size: 23.3810 mg
Method: Conventional MDSC
DSC
File: E:\S1.001
Operator: Åsa
Run Date: 07-Nov-03 13:32
Instrument: DSC Q1000 V7.3 Build 249
0.1
Heat Flow (W/g)
0.0
-0.1
-0.2
Glasomvandling
-0.3
-0.4
-60
Exo Up
-50
-40
-30
Temperature (°C)
-20
-10
0
Universal V3.5B TA Instruments
Termogram av en enkel modellformulering, ett
socker-vattensystem
Frystorkade formuleringar av socker och mjölksyrabakterier. De två formuleringarna i mitten har
delvis eller helt kollapsat och upplevs inte som
torra.
Modulerad Temperature Differential Scanninginstrument. (Ta Instruments Q1000 DSC). Materialkemi, Ångströmslaboratoriet, Uppsala Universitet.
En ökad grundläggande förståelse av de
fysikalkemiska processer materialet/produkten genomgår under frysning/torkning
är nödvändig för att säkerställa produktstabilitet. Generell frystorkningskunskap
säger att om förångning av vatten under
DSC-data kommer ut i form av ett termogram där glasomvandlingar och kristalliseringar kan utläsas. Med hjälp av termogrammen kan frystorkningsprocessen optimeras.
17
Vår förhoppning är att kunna karaktärisera
stabiliserande ämnen och komplexa formuleringar med MT-DSC-tekniken och därmed få en ökad förståelse av mjölksyrabakterieformuleringar. I kombination med
NMR-tekniken, där upptag av stabiliserande ämnen kan studeras, hoppas vi nå en
ökad förståelse kring formuleringsstabilitet
och skillnader mellan våra modell-mjölksyrabakterier. Kunskapen kommer att vara
av grundvetenskaplig karaktär men skall
också kunna omsättas direkt av bioteknikindustrin för att utveckla stabila produkter
med olika mjölksyrabakterier.
Projekt 3. Bioremediering
Personal
I projektgruppen har under 2003 ingått professor Janet Jansson som projektledare samt
licentianden Agneta Backman. DOM:s programforskare Dr Thomas Eberhard (fermentering),
Dr Sebastian Håkansson (formulering) och Doc Ingvar Sundh (säkerhetsvärdering) har också
varit engagerade i projektet.
Komplexa föroreningar svårsmälta för mikroorganismer
Bioremediering av giftiga ämnen har under de senaste 20 åren grundligt studerats som en
tänkbar strategi för saneringsarbete. Tyvärr begränsas bioremedieringen av att de naturligt
förekommande mikroorganismerna ofta saknar de enzymer som är nödvändiga för nedbrytning av de mest komplexa organiska föreningarna. Ett annat problem är att nedbrytningen av
de giftiga ämnena i vissa fall är ofullständig, vilket leder till ackumulering av giftiga
nedbrytningsprodukter i marken. Ett sätt att övervinna dessa begränsningar är att tillföra
mikroorganismer som kan producera de enzymer som krävs för fullständig nedbrytning.
Denna process kallas bioaugmentering.
mål för vårt arbete i Sverige. Ett annat
uppenbart problem är appliceringen och
distributionen av mikroorganismen så att
den kommer i kontakt med föroreningen.
Bioaugmentering – tillsats av rätt
mikroorganism
Isoleringen av mikroorganismer som lämpar sig för bionedbrytning utgör ett kritiskt
steg i arbetet med bioaugmentering. Det är
väl känt att den mikrobiella världen har en
enorm metabolisk mångfald vilken endast
helt nyligen har börjat utforskas. Man
beräknar således att högst 10 % av jordens
mikroorganismer har identifierats och isolerats. Under det fortsatta arbetet att isolera
och karaktärisera nya stammar som kan
bryta ner giftiga substanser, finns det även
möjligheter att upptäcka och lära sig att
utnyttja helt nya bionedbrytande funktioner
hos organismerna. En faktor som är särskilt
begränsande och problematisk i de
nordiska länderna, är det kalla vinterklimatet och den stora temperaturvariationen under året. Bionedbrytning i
kalla klimat är därför ett mycket viktigt
Konsekvensanalys – verkan och
säkerhet
Innan de bionedbrytande mikroorganismerna släpps ut i naturen, är det av högsta vikt
att utvärdera deras beteende i den miljö där
den skall verka. Det behövs kunskap om
hur de påverkar den naturliga mikrofloran
för att man ska kunna göra en korrekt konsekvensanalys. Den samlade informationen
kommer att ligga till grund för värdering
av effekt och risk vid spridning av stora
mängder celler. Denna information är även
nödvändig för att kunna optimera effekten
i miljön samt för att utveckla formulering
och ett väl fungerande spridningssystem
för organismen.
18
För säkerhetsbedömning av konsekvenserna vid spridning av mikroorganismer i
miljön krävs exempelvis följande information om organismen:
A. chlorophenolicus kan överleva i ett
vilande tillstånd i kall jord, vilket visar
denna mikroorganisms potential som biosanerare i förorenad jord i kalla klimat,
som till exempel i Sverige.
Proportion of CTC- or PI-stained GFP-
1. Art- och stamidentifiering samt en
beskrivning av egenskaper
2. Överlevnad och spridning i miljön
3. Påverkan på miljön i det tänkta
spridningsområdet
Aktiviteter och resultat under 2003
Nedbrytning vid låga temperaturer
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Påbörjade experimentella studier i laboratoriemiljö av Arthrobacter chlorophenolicus, som tillhör gruppen Actinobakterier,
visar lovande resultat vad gäller nedbrytning av 4-klorofenol och andra p-substituerade föreningar i jord. A. chlorophenolicus
kan bryta ner kombinationer av 4-nitrofenol, 4-klorofenol och fenol i höga koncentrationer såväl i laboratoriemedia som i
jord. Det har även visat sig att denna stam
är ovanligt bra på att bryta ner höga
koncentrationer av klorofenol vid låga
temperaturer, samt vid fluktuerande
temperaturer mellan 5 och 28°C.
0
0
soil)
-1
4-chlorophenol concentration (µg g
160
80
60
40
20
0
6
8
10
12
14
16
18
20
Time (days)
-1
4-chlorophenol concentration (µg ml
)
Nedbrytning av höga koncentrationer 4-klorofenol
med A. chlorophenolicus i jord vid 5 °C (vita) och
28 °C (svarta).
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
6
8
10
11
13
15
20
Vi har utvecklats metoder för att mäta
specifika jordbakteriers fysiologi. Dessa
metoder baseras på användning av kombinerad infärgning med olika färger för att
specifikt färga de levande och döda
cellerna. De färgande cellerna kan specifikt
detekteras och kvantifieras med hjälp av
flödescytometi. En flödescytometer inköptes, delfinansierad av DOM, för detta ändamål. Målsättningen är att använda denna
metod för att mäta modellorganismernas
fysiologi under utvecklingen av fermenterings- och formuleringsteknik. Metoden
kan även användas för specifik mätning av
fysiologin hos de celler som inokulerats i
miljön vid fältstudier. Den information
som genereras vid dessa studier förväntas
bli mycket användbar för optimering av
prestation och överlevnad hos bakterier
som inokuleras i fält.
100
4
5
Mätning av mikroorganismers fysiologi
under odling och formulering samt efter
spridning i jord
120
2
4
Fysiologisk status hos A. chlorophenolicus i jord
som inkuberats vid 5 °C. Svarta staplar = levande
celler; vita staplar = döda celler.
140
0
3
Time (days)
200
180
1
14
Time (days)
4-klorofenol-nedbrytning med A. chlorophenolicus
vid temperaturer som växlar mellan 5 °C (vita) och
28 °C (svarta).
19
Flödescytometri för mätning av levande och döda bakterier. Figuren längst till vänster visar ett område (R3) där
varje punkt motsvarar en bakterie. R1 = intern standard bestående av mikroskopiska ”pärlor”. Figuren till
vänster om mitten visar fluorescenceintensiteten hos en population gröna fluorescerande bakterieceller. Bilden
till höger om mitten visar en typisk levande rödfluorescerande cellpopulation (M1). Figuren längst till höger
visar två delpopulationer med olika fysiologisk status; övre kvadraten visar levande rödfluorescerande celler;
undre kvadraten visar döda celler. FSC-H = ”forward scatter” (partikelstorlek); SSC-H = ”side scatter” (partikelform); FL1-H = grön fluorescensintensitet; Counts = antal räknade partiklar; FL3-H = röd fluorescensintensitet.
SBW25 1.004
100
101
102
FL1-H
symposium för att diskutera detta.
Inbjudna föreläsare, både från Sverige och
andra länder, fick möjlighet att presentera
och diskutera de mest lovande mikrobiella
inokulanter som finns tillgängliga för
sanering av problematiska gifter i Sverige.
Kontroll.001
103
104
100
101
102
FL1-H
103
Utifrån resultaten från symposiet identifierades fem mikroorganismer, vilka alla är
mycket intressanta för framtida utredning
inom DOM. De fem mikroorganismerna
tillhör gruppen Actinomyceter (”Actinobacteria”), som är känd för att vara vanligt
förekommande i jord. Några av dessa har
dessutom förmåga att bryta ner giftiga
ämnen som utgör direkta problem i
Sverige, såsom PAH och atrazine. Den här
organismgruppen är också intressant på
grund av sin förmåga att överleva och utstå
hårda miljöförhållanden. Arbetet kommer
att fokuseras på två organismer
A. aurescens TC1 som kan bryta ned
atrazine och Rhodococcus ”L” som omsätter PAH-er.
104
Markörgen har använts för att följa en specifik
bakteriecellpopulation i jord. Vänster bild visar ett
jordprov inokulerat med grönfluorescerande märkta
bakterier. Varje punkt i rutan visar en grönfluorescerande bakterie. Höger bild visar en kontrolljord
som ej inokulerats med bakterier. FL1-H = grön
fluorescensintensitet; SSC-H = partikelform.
Val av modellorganism – nya kandidater
Eftersom monosubstituerade fenoler sällan
förekommer som föroreningar i Sverige,
bestämdes, efter diskussion med styrelsen
för DOM, att undersöka andra möjliga
inokulanter som är mer direkt användbara
för sanering av förorenade områden i
Sverige och den internationella marknaden.
Den 4 november 2003 hölls ett mini-
20
Tabell. Intressanta mikroorganismer för eventuella bioremedieringsstudier inom DOM.
Egenskap
Arthrobacter
aurescens
TC-1
Rhodococcus
“L”
Gordonia
APB1
Rhodococcus
RHA1
Arthrobacter
chlorophenolicus
Miljöförorenare
Atrazine,
Terbuthylazine
PAH
PCB via coKlorinerade
metabolism
pesticider
*(2,4-D,
2,4,5-T, PCP)
A6
p-substituterade
fenoler (nitrochloro-bromoetc) och fenol
Påvisade i
fältförsök
Ja
Nej
Nej
Ja
Nej
Godkänd
toxitetstest
Ja
Nej
Nej
Ja
Nej
Användbara
egenskaper
Överlever i
+
jord, G
Överlever i
+
jord, G
Överlever i
+
jord, G
Överlever i kall
+
jord, G
Överlever i kall
+
jord, G
Övrigt
Genomsekvensering
pågår (Larry
Wackett,
USA)
Samarbete
med John
Stenström
och Maria del
Pilar Castillo
(SLU)
Genomsekvens
tillgänglig.
Samarbete med
William Mohn
(Canada)
Gener som deltar
i klorofenolnedbrytning är
sekvenserade
* Praet and Jansson- Masters thesis, G+ = grampositiv bakterie
Formella nätverk och kontaktpersoner
Samtliga projektledare har genom pågående EU-projekt som STOVE (Gerhardson),
BIOPOSTHARVEST (Schnürer, Hökeberg) och METACONTROL, BIOCARTE (Jansson)
tillgång till relevanta europeiska forskningsmiljöer. Projektledarna har också direkta
forskningssamarbeten med anknytning till DOM med bl.a. forskningsgrupper i Danmark,
Nederländerna, Frankrike, Polen, Tyskland, Vietnam och USA. Janet Jansson deltar i ett
FORMAS-program om biologisk riskvärdering.
Samarbetet med olika bioteknikföretag är omfattande, bl.a. med Acanova AB, Medipharm
AB, BioAgri AB och SITA Sverige AB inom ramen för DOM-projektets intressentförening.
DOM har under 2003 fått många goda råd inom frystorkningsområdet av Thomas Österberg
(Pfizer, Sverige) och Bengt Fridh (TA Instruments Nordic). Programmet har också etablerat
kontakter med Kemikalieinspektionen och Arbetsmiljöverket.
21
DOM-programmets maskinpark
Datorstyrda fermentorer i 1-liter- (ovan)
respektive 14-literskala (till höger), alla av
fabrikatet Belach
Specialbyggd vakuumtork med temperaturstyrning
Frystork (FTS LyoStar II) med mycket goda
styrmöjligheter
Flödescytometer (FACSCalibur)
Försökssåmaskin (Wintersteiger Plotman) med utrustning
för bakteriebehandling av utsäde under sådd
22
Ekonomisk redovisning
Projektkostnader:
Fermentering
Formulering
Säkerhet
Biologisk bekämpning
Konservering av foder- och livsmedel
Bioremediering
Summa projektkostnader
Programledningskostnader
Utrustning
Övriga gemensamma programkostnader
Lokal- och förvaltningskostnader
670 kkr
525 kkr
229 kkr
932 kkr
538 kkr
279 kkr
3 173 kkr
537 kkr
282 kkr
141 kkr
837 kkr
Totalt
4 970 kkr
Publikationer under 2003
Backman A & Jansson JK. (under tryckning). Degradation of 4-chlorophenol at low temperature and
during extreme temperature fluctuations by Arthrobacter chlorophenolicus A6. Microbial Ecology.
Backman A, Maraha N & Jansson JK (under tryckning). Physiological status of Arthrobacter
chlorophenolicus A6 in soil. Applied and Environmental Microbiology.
Melin P (under tryckning). Proteomics as a tool to study microbial interactions. Current Proteomics.
Syntesdokument
Melin P, Eberhard T & Håkansson S 2003. Domestication of Non-Conventional Yeasts. WEB-DOMRapport nr 1. 65 pp.
Hökeberg M, Eberhard T & Håkansson S 2003. Domestication of gram-negative bacteria. WEBDOM-Rapport nr 2. 63 pp.
Syntesdokument uppdateras kontinuerligt och finns tillgängliga över den interna WEB-baserade
Arbetsplatsen.
Konferenser och workshops
Presentationer vid internationella möten (föredragshållare med fet stil)
Jansson JK. Arthrobacter chlorophenolicus – a model inoculant for bioaugmentation of
chlorophenol-contaminated soil. US-European Workshop on Environmental Biotechnolo-gy. Madrid,
Spain. 2-16 February, 2003. (inbjuden talare)
Schnürer J. Lactic acid bacteria and biopreservation. FEMS 2003 – 1st FEMS congress of European
Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 29 June - 3 July 2003. (inbjuden talare)
Poster-presentationer
Maraha N, Backman A & Jansson JK. Monitoring physiological status of specific bacterial
populations in soil by flow cytometry. FEMS 2003 – 1st FEMS congress of European Microbiologists,
Ljubljana, Slovenia, 29 June - 3 July 2003.
23
Extern information inklusive fortbildning
Höstmötet, Nätverket Renare Mark “Undersökningar- när,vad, hur och varför??” Helsingborg, 7-8
oktober. (JK Jansson, deltagare)
Referensgruppsmöte tillsammans med MAaF. Uppsala, 27 november.
Alla Programmets medarbetare deltog i minisymposiet ”Bioaugmentation for Bioremediation in
Sweden”. Uppsala, 4 november.
Övrigt
Sundh I. Av Kemikalieinspektionen inbjuden expert vid möte i Bryssel om skrivningar i Annex VIb
(Uniform principles for evaluation and authorisation of plant protection products containing microorganisms) till EU-direktiv 91/414.
Deltagande vid vetenskapliga möten under 2003
(Se även presentationer och poster vid internationella möten)
Håkansson S & Schoug Å. CryoBiomol 2003, Coimbra, Portugal, 14-18 september.
Melin P. 21th International conference on yeast genetics and molecular biology, Göteborg, 7-12 juli.
Sundh I. FEMS 2003 – 1st FEMS congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 29 June
- 3 July 2003.
Möten och seminarier inom programmet under 2003
17-19 mars. Kick-off med alla Programmets medarbetare och dess styrelseordförande.
Diskussion om projekt, organisation, arbetssätt samt exploatering av resultat.
3 juni. Halvårsuppföljning som heldagsmöte med alla medarbetare. Resultatpresentation och
planering.
2 september. Planeringsmöte (halvdag) med alla medarbetare. Planering och SWOT-analys.
30 september. Formuleringsseminarium med Mats Silvander (BioAgri) ”Formulering - effekt,
stabilitet, struktur och kundacceptans” och presentation av Åsa Schough "Frystorkning och
formulering".
6 oktober. Studiebesök på SITA:s Jordbehandlingsanläggning i Löt, Vallentuna under ledning
av styrelseledamoten Tommy Lundgren.
14 oktober. Seminarium om patent. Per Svanström från Forskarpatent informerade.
18 november. Projektseminarium. Margareta Hökeberg och Jens Levenfors presenterade
verksamhet och resultat inom projektet ”Biologisk bekämpning”.
25 november. Möte med hela programmet och MISTRA:s VD Måns Lönnroth för ömsesidig
information.
Programmets medarbetare träffades därutöver regelbundet varannan tisdag till informationsoch rapporteringsmöten. I samband med dessa sammanträdde vanligtvis Programmets
ledningsgrupp.
Styrelsemöten
Programmets styrelse sammanträdde under 2003 den 28 januari, 29 april, 10 juni, 6 oktober samt den
5 och 24 november.
24
Organisation och ledning
Programmet är organiserat enligt nedanstående schematiska figur.
Programstyrelse
Referensgrupp
Programchef
Ledningsgrupp
Gemensam programforskning
Forskningsprojekt
Fermentering Formulering
Säkerhetsvärdering
Biologisk bekämpning
X
X
X
Biologisk konservering
X
X
X
Bioremediering
X
X
X
DOMEXPLORE
Programstyrelsen
Se pärmens första insida.
Programchefen
P Är verkställande chef för programmet
P Är ansvarig för verkställandet av programplan och Programstyrelsebeslut
P Ansvarar inför Programstyrelsen för att föreslå förändringar av programplan och
medelsfördelning
P Ansvarar för effektiv intern och extern kommunikation
P Ansvarar för utveckling av former för exploatering av resultat
Ledningsgruppen
P Består av programmets projektledare och sekreterare med programchefen som
ordförande
P Ansvarar för den operativa vetenskapliga ledningen
P Utarbetar programplaner och årsrapporter
P Utarbetar avvikelserapportering till programstyrelsen
P Ansvarar för intern kommunikation i programmet
Referensgruppen
P Består av representanter från jordbruk, skogsbruk, industri och myndigheter
P Är huvudsakligen rådgivande och deltar i diskussioner och informationsmöten.
DOMEXPLORE
P Organisationen för bioteknisk exploatering av resultat från DOM-programmet
Domesticering av mikroorganismer
Programsekreterare
Programchef
Anders Jonsson
Anki Lundquist
Inst f mikrobiologi, SLU
Box 7025, 750 07 Uppsala
[email protected]
Institutionen för mikrobiologi
SLU, Box 7025, 750 07
Uppsala
[email protected]
Fermentering
Thomas Eberhard
[email protected]
Formulering
Säkerhetsbedömning
Sebastian Håkansson
[email protected]
Ingvar Sundh
[email protected]
Projekt 1. Biologisk bekämpning av växtsjukdomar
Berndt Gerhardson
[email protected]
Margareta Hökeberg
Jens Levenfors
[email protected]
[email protected]
Projekt 2. Konservering av foder- och livsmedel
Stf programchef
Petter Melin
Åsa Schoug
Johan Schnürer
[email protected]
[email protected]
[email protected]
Projekt 3. Bioremediering
Janet Jansson
Agneta Backman
[email protected]
[email protected]