Typning av positiva blododlingar med en multiplex
förstärknings-hybridiseringsteknik
Christina Öhrmalm, Ronnie Eriksson, Magnus Jobs, Åsa Melhus, Björn Herrmann, Jonas
Blomberg
Klinisk Mikrobiologi, Akademiska Sjukhuset, och
sektionerna för Klinisk Bakteriologi och Virologi, Institutionen för Medicinska Vetenskaper,
Uppsala Universitet.
Rapport 090929
Metod:
En egenutvecklad metod som bygger på nukleinsyreextraktion, ett valfritt steg med
infångning av målnukleinsyra, förstärkning av målnukleinsyra och påvisning av förstärkt
nukleinsyra med mikrobspecifika prober. En panel av vanliga sepsisbakterier har konstruerats.
Panelen har en hög multiplexitet och av de 22 st mål-generna är 7 antibiotikaresistensgener
och de övriga 15 identifierar 12 st olika bakterier och svampar. Metoden är 22-plex med
avseende på antalet målgener och 12-plex med avseende på antalet bakterier och svampar.
Antalet signaler som fås vid avläsningen i Luminex flödescytometer beror på i. antalet
målsekvenser som vi designat för respektive bakt./svamp, ii. om mikrorganismen har
antibiotikaresistens/toxin-gener, iii. och om det förekommer co-infektion i provet.
Design av primer/probe:
En stor arbetsinsats har lagts på design av de primrar/prober som ingår i metoden. De
mikroorganismer som är av intresse för en sepsispanel har mycket konserverade genom och
ofta är nukleinsyrasekvenserna mycket lika mellan olika arter. Vi har identifierat markörgener
genom litteraturstudier av publikationer, samt insamlande av sekvenser från NCBI NIH
databas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), därefter databehandling i program som Blastn,
ClustalX, och Consort, för att hitta särskiljande sekvenser.
I 22-plex sepsismetoden detekteras tre specifika målgener, nuc, spa och coa, för S. aureus för
att särskilja dem ifrån KNS. Idag används nuc-genen som markör vid identifiering av
S. aureus med PCR vid olika rutinlaboratorier. Spa-genen kodar för Protein A, vilken är
specifik för S. aureus. Spa-genen kan användas för att genotypa bakterier eftersom den har
vissa nukleinsyra-regioner som är mycket variabla. Vår metod bygger på variationstoleranta, men fortfarande specifika, primrar/prober och därmed så kan de olika varianterna
av spa-genen detekteras, men inte särskiljas. Genen coa kodar för koagulas, vilket särskiljer
KNS (Koagulas negativa staphylokocker) från S. aureus.
Resultat: (se figur nedan)
Multiplexitet: Metoden fungerar bra 22-plext och panelen kommer att utökas.
Analytisk sensitivitet: Känsligheten ligger i nuläget på 104-102 nukleinsyrekopior per
reaktion. Det är tillräckligt för att typa blododlingsisolat.
Specificitet: Panelen har visat hög specificitet mot såväl syntetiska målsekvenser,
bakteriekulturer och blododlingar.
7000
nuc
spa
coa
6000
tss1
S.epidermidis
5000
K. pneu/oxy
E. coli
4000
E. faecalis
E. faecium
S. pneumo
3000
P. aerugosa
C. albicans
2000
C. dubliniensis
C. freundii
1000
P. mirabilis
mecA
ampC I
ampC II
ampC III
ctxmI
S. pneumonia
Syntetisk målsekvens
NTC Lum
NTC
Patient #2
Patient #1
MRSA
S. aureus
S. pneumonia
NTC Lum
1x10e0
1x10e1
1x10e2
1x10e3
1x10e4
1x10e5
1x10e6
1x10e7
0
ctxmIV
Bakteriekultur
Blododling
vanA/B
