(13) c2 (11) 515 216

SVERIGE
(12) PATENTSKRIFT
(19) SE
(51) Internationell klass 7
(13) C2
(11) 515 216
CO7K 14/29, A61K 39/02, GO1N 33/569
g äl
PATENT- OCH
REGISTRERINGSVERKET
(45) Patent meddelat
2001-07-02
(41) Ansökan allmänt tillgänglig
(22) Patentansökan inkom
1999-08-21
1998-02-20
(24) Löpdag
1998-02-20
(62) Stamansökans nummer
( 86) Internationell
Internationell
(21) Patentansökningsnummer
9800504-4
Ansökan inkommen som:
r
vningsdag
(86) Ingivningsdag för ansökan
om europeisk patent
(83) Deposition av mikroorganism
❑❑
svensk patentansökan
fullföljd internationell patentansökan
med nummer
omvandlad europeisk patentansökan
med nummer
(30) Prioritetsuppgifter
(57) SAMMANDRAG:
Den aktuella uppfinningen avser en ny peptid, diagnostiskt reagens och kit för
detektion av rickettsioser, närmast för detektion av fästingburna bakterier nära
besläktade med Rickettsia helvetica. Dessutom avser uppfinningen ett vaccin
mot rickettsioser innehållande nämnda peptid.
Siffrorna
ifon inom
nmprne
parentes anger
ne internationell
nentoelietfeigkd
identifieringskod, INID-kod.
NDkd
Bokstav
osa
inom
nmkamragritrainl
klammer anger internationell dokumentkod.
oueto.
515 216
1
Bakgrund till uppfinningen
Den aktuella uppfinningen avser en ny peptid, diagnostiskt reagens för
detektion av rickettsioser, närmare bestämt för detektion av fästingburna
bakterier nära besläktade med Rickettsia helvetica. Vidare avser uppfinningen
ett vaccin mot rickettsioser och en metod för detektion respektive behandling av
rickettsioser.
Fylogenetiskt kan livet på jorden indelas i tre huvudgrupper; eukaryoter,
eubakterier och archeabakterier. Eukaryoterna utgörs av cellkärneförsedda
högre organismer medan archeabakterier består av bakterier som anpassats till
extrema förhållanden i miljön som heta källor, extrema salthalter eller förmågan
att använda metan som kolkälla i sina katabola processer. Det stora flertalet
bakterier och även den så kallade blågröna algen är eubakterier. Av dessa är ett
fåtal (dvs. Rickettsiae och Chlamydiae ) så specialiserade att de är obligat intracellulära parasiter. Eukaryota organeller, som tex mitokondrier har i genetiska
evolutionsstudier visats vara parasiter eller symbionter som lever inne i andra
celler. Dessa har ett nära släktskap med Rickettsiae.
Släktet Rickettsiae har till nyligen ansetts bestå av tre grupper strikt intracellulära bakterier, nämligen tyfus (TG), fläckfeber (SFG) och skrubbtypfus
(STG) grupperna. Klassifikation i species är baserad på geografisk spridning,
artropod värd, intracellulär lokalisation, membranstruktur, odlingsegenskaper
och serologiska mönster.
Tyfusgruppen (TG) inkluderar species R. prowazekii och R. typhi. Medlemmarna
i TG återfinns huvudsakligen belägna i cytoplasman. Ett annat vanligt karakteristika är serologisk korsreaktivitet i Weil-Felix agglutination med Proteus
OX19.
TG Rickettsiae uppträder på spridda håll i världen och överförs till människa
med löss eller loppor. SFG Rickettiae överförs huvudsakligen med fästingar och
omkring 20 skilda species av SFG har hittills beskrivits.
Species-definitionen av SFG har baserats på serotyp bestämning med komplement-fixeringstest, toxin-neutralisationstest hos möss, kors-immunitetstest hos
515 216
2
marsvin, eller mikroimmunofluorescenstest (MIF). Dock är den serologiska
uppdelningen av nyligen isolerade stammar svår beroende på en korsreaktivitet
mellan kända Rickettsiae..
Den tredje gruppen Rickettsiae, skrubbtyfus gruppen, består av enbart ett
beskrivet species, Orientia tsutsugamushi. Detta species uppträder naturligt i
södra och sydöstra Asien och överförs av larven till ett kvalster (Leptotrombidium
spp.). Vidare har skillnader i cellväggsstrukturen och ribosomsekvenserna hos
dessa visats i förhållande till de andra grupperna.
Europeiska fästingar har visats bära SFG Rickettsiae som R. helvetica i
Schweiz, R. slovaca i Ryssland och R. conorii i Frankrike. Dock har ingen
Rickettsiae rapporterats från fästingar i Skandinavien (Sverige, Danmark, Norge,
Finland och Island).
Den kliniska betydelsen av rickettsiainfektioner kan lätt undervärderas . Flera
studier har visat att tecken på och symptom av rickettsia-sjukdom kan variera
avsevärt.
Detta gäller tex för Rocky Mountain "spotless" feber, där den kliniska bilden är
snarlik den klinik man ser vid Lyme's sjukdom, men där de serologiska fynden
talar för en infektion med R. rickettsii. Ett liknande exempel, är studien av ett
nytt rickettsia-agens, "ELB", där den definitiva kliniska diagnosen var murin
tyfus. Utvidgade undersökningar visade att "ELB-ämnet" är ett distinkt
rickettsia species med det föreslagna namnet R.felis.
Behandling av dessa infektioner är idag nästan exklusivt beroende av antibiotika eller kemoterapeutika. Det vanligaste problemet vid antibiotikabehandling är ekologiska rubbningar av normalfloran. Ett annat, ofta svårare, problem
vid behandling av bakteriella infektioner orsakade av intracellulärt växande
bakterier är svårigheten att uppnå tillräckligt höga koncentrationer av
preparatet under tillräckligt lång tid för att avdöda bakterier i stationär tillväxtfas.
Aktuella terapier för rickettsia-infektioner är antibakteriell behandling med
kloramfenikol, tetracykliner och ibland rifampicillin. Diagnos av rickettsiainfektionen kan fås antingen genom odling av organismen eller genom analys av
515 216
3
kroppsvätskor från infekterade individer, det senare alternativet föredras
eftersom odling av Rickettsiae ofta är svårt och osäkert.
För de i Europa icke förekommande, extremt patogena Rickettsiae, som R.
prowazekii (lusburen fläckfeber), R. rickettsii (Rocky Mountain spotted fever)
och Orientia tsutsugamushi (Skrubb tyfus) har diagnostiska kit beskrivits. Se
som exempel, US 7429936 som beskriver ett rekombinant protein för diagnos av
R rickettsii. Detta protein kan även användas för att vaccinera människor mot
Rocky Mountain spotted fever.
I Journal of Clinical Microbiology, Jan 1997, p 243-247, har föreliggande
uppfinnare visat att 1,7% av Skandinaviska Ixodes ricinus fästingar är positiva
för rickettsia DNA. Fästingar är kända för att vara den vanligaste artropodreservoaren och vektorn för SFG Rickettsiae. Ännu är det inte visat att
Rickettsiae förekommer endemiskt eller epidemiskt bland människor eller djur i
Skandinavien.
16S rRNA genen från den isolerade stammen amplifierades och sekvenserades
och en 1380 bp lång sekvens från denna gen jämfördes med motsvarande
sekvens hos tidigare beskrivna rickettsia species. Jämförelsen visade en 100%ig homologi med R. helvetica.
Species av släktet Rickettsiae är nära besläktade och de genetiska skillnaderna
mellan 16S rRNA genen är enbart 2 %. Till exempel skiljer 11 nukleotider detta
isolat från R. conorii, ett species endemiskt i södra Europa och fylogenetiskt, den
mest besläktade karakteriserade SFG Rickettsia och vidare den enda Rickettsia
som har påvisats i I. ricinus än så länge. I jämförelse med R. prowazekii, som är
mindre besläktad och tillhör tyfus-gruppen, så skiljer sig denna stam i 25
nukleotid-positioner.
RFLP-mönstret hos citratsyntetas-genen förbättrar diskrimineringen mellan
Rickettsiales. RFLP mönstret för denna stam, i jämförelse med kända typstammar, är mest lik mönstret för SFG men distinkt skilt från det publicerade
mönstret för R. helvetica. Baserat på nukleotidsekvens resultatet, borde den
detekterade Rickettsia sp. klassificeras som en fläck feber (SFG) Rickettsia.
Vidare talar RFLP-mönstret för att denna stam kan vara en subtyp till R.
helvetica.
515 216
4
Sammanfattning av uppfinningen
Föreliggande uppfmnare har indikationer på att den Rickettsia som hittats i 1.
ricinus fästingar är patogen för människor. Av denna anledning föreligger det
ett behov av diagnostik och behandling av rickettsioser i Skandinavien.
En avsikt med uppfinningen var att möjliggöra riktig diagnostik av rickettsia
infektioner i Skandinavien. En annan avsikt var att tillhandahålla effektiv
behandling av infekterade individer. Dessa och andra avsikter uppnås som en
följd av uppfinningen.
Sålunda avser uppfinningen, i en första aspekt, en peptid/protein innehållande
den aminosyresekvens som visas i Sekvenslista nr 1. Peptiden/proteinet
erhålles från naturliga källor eller produceras på syntetisk eller rekombinant
väg.
I en andra aspekt avser uppfinningen ett diagnostiskt reagens innehållande
ovan nämnda peptid/protein eller immunrespons genererande delar eller
varianter därav för detektion av rickettsioser, i synnerhet för detektion av
infektioner med bakterier nära besläktade med Rickettsia helvetica. Det
diagnostiska reagenset kan vara fritt eller bundet till lipider eller kolhydrater.
I en tredje aspekt avser uppfinningen ett diagnostiskt kit innehållande det ovan
nämnda diagnostiska reagenset som är i form av en lösning eller bundet till
solid fas. I en konkretiserad form av denna aspekt, innehåller det diagnostiska
kittet en märkt anti-Ig antikropp för detektion av däggdjurs IgA, IgG eller IgM
antikroppar mot ett antigen (det vill säga det ovan nämnda diagnostiska
reagenset) från bakterier nära besläktade med R. helvetica. Kitet är lämpligen
utformat för konventionella assays som ELISA, EIA, RIA, IRMA etc. Däggdjurs
antikroppar använda som prov insamlas från kroppsvätskor som serum, blod,
cerebrospinalvätska, tårvätska, semen eller svett.
I en ytterligare utföringsform av denna aspekt innehåller kitet ett märkt T-cells
igenkännande agens för detektion av rickettsioser, i synnerhet för detektion av
det cellulära immunsvaret mot ett antigen (det vill säga det ovan nämnda
diagnostiska reagenset) från R. helvetica eller bakterier nära besläktade med
515 216
5
densamma. I detta fall är kitet utformat som till exempel en konventionell
Immuno Spot Assay.
I en fjärde aspekt avser uppfinningen ett vaccin innehållande den ovan nämnda
peptiden eller immunresponsgenererande delar eller varianter därav för
behandling av rickettsioser. Behandlingen omfattar administrering, till en
individ i behov därav, av vaccin i ett passande adjuvans i en farmakologiskt
effektiv mängd för att framkalla immunrespons hos individen, vilket skyddar
individen mot rickettsios.
Detaljerad beskrivning av uppfinningen
Den typiska kliniska bilden vid rickettsios är hög feber, huvudvärk och utslag.
Beroende på vilket rickettsia-species som orsakar sjukdomen kan den kliniska
bilden även inkludera lymfadenopati, myalgi, artralgi och vissa former presenterar sig med neurologiska, renala och kardiella problem. Symptomen av sjukdomen kan variera från milda till svåra och durationen är vanligen mellan 2-3
veckor. De få beskrivna sjukdomsfallen och mångfalden av symptom komplicerar diagnosen. Liknande kliniska bilder kan uppträda vid vissa icke rickettsiaorsakade bakteriella och virala infektioner som meningococcemi, mässling,
tyfoid feber, bakteriell meningit, sekundär syfilis, leptospiros, återfallsfeber,
infektiös mononukleos och röda hund. Ifall utslag inte uppträder behöver alla
febrila tillstånd tas i beaktande.
Rickettsioser har också en benägenhet att bli latenta infektioner, en hypotes
bevisad för R. prowazekii, en upptäckt för vilken Henri Nicolle erhöll 1928 års
Nobelpris i Fysiologi och Medicin. Även för andra rickettsia species har en
liknande latent infektion föreslagits (Woddword, 1953, 1997). En sådan pyrande
infektion kan efter några år leda till svåra sekvele. Isolat av Rickettsiae av okänd
patogenicitet för människa har en tendens att betraktas som "icke-patogen" för
människa. Under de sista åren har ett antal "icke-patogena" Rickettsiae visats
orsaka skilda sjukdomar och har därför omvärderats som patogena. Vår
hypotes är att ifall den primära infektionen är mild, och därför sällan eller inte
alls blir diagnostiserad, men fortfarande utvecklas vidare till en latent infektion
orsakande allvarliga sekvele, så kommer dessa infektioner och organismer att
bli några av de mest angelägna att studera.
515 216
6
Serologiska assays är de enklaste diagnostiska testen att utföra, eftersom serum
enkelt kan sändas till ett referenslaboratorium. Ju mer specifika immunogena
reaktioner man kan utföra desto mer specifikt blir testet och färre korsreaktioner uppträder. De immunogena egenskaperna hos bakterien är
huvudsakligen associerade med de strukturer som exponeras på organismens
yta. Av sådana strukturer finns två grupper.1: En är yttermembranproteinerna,
OMPs och 2: Den andra är LPS (lipo-poly-sackariderna) eftersom Rickettsiae är
Gram-negativa bakterier. LPS som metod har använts under närmast ett
århundrade i Weil-Felix reaktion men är väldigt ospecifik. I enlighet med
uppfinningen användes 17 kDa OMP proteinet. Genen som kodar för detta
protein amplifierades med hjälp av två specifika primers i en standardiserad
PCR assay. Den amplifierade produkten sekvenserades med hjälp av Sanger
dideoxy-kedje-terminationsmetoden och resultatet ges i Sekvenslista nr. 2.
Denna sekvens översattes till aminosyror och en specifik peptid valdes
motsvarande 28 aminosyror från baspar 276-360. Denna 28 aminosyrors
antigena peptid kan produceras antingen genom rening från odlade species
besläktade med Rickettsia helvetica uttryckande denna peptid i 17 kDa OMP,
från rekombinanta organismer med en vektor med en infogad sekvens innehållande bp 277- 360 i enlighet med Sekvenslista nr. 2 eller varianter därav,
eller genom ren kemisk syntes.
Uppfinningen kommer nu att beskrivas närmare nedan tillsammans med några
icke-begränsande exempel tillsammans med bifogade Sekvenslistor och Figurer.
Exempel 1: Amplifiering och sekvensering av rickettsiagen
Följande specifika primerpar konstruerades
17up
5 - AAAATTCTAAAAACCAT
17LOW
5 - TCAATTCACAACTTGCC
Från en samling av frilevande I. ricinus fästingar, isolerades total DNA efter
sönderdelning och tillsättande av 300 biL lätt salthaltig TE buffert (10mM Tris
pH 7.4, 1 mM EDTA, 10 mM NaC1), 20 piL, 20% natrium dodecyl sulfat (SDS och
5 ;IL 10 mg/ml Proteinas K (Boehringer, Mannheim). Blandningen inkuberades
vid 55 ° C under 1 h och upphettades under 10 minuter vid 95°C. Extraktion
515 216
7
utfördes två ggr med mättad fenol, en gång med en blandning av
fenol/kloroform och slutligen en gång med kloroform. DNA:t fälldes övernatt
med tillsats av 1/10 vol. 4 M natrium acetat och 3 vol. 99% etanol och samlades
ihop med centrifugering vid 20.000 rpm i en mikrocentrifug. Den pellet som
bildades tvättades med 70% alkohol och torkades under vacuum och löstes i 50
jiL destillerat vatten och användes som templat för PCR.
PCR-amplifiering. De primers som ovan beskrivits användes under
förhållanden med värmecykler 93°C 5 min. (93°C 30 sek.-52°C 60 sek.-72°C
30 sek.) upprepat 35 ggr, vilket gav ett ungefärligt 600 baspar (bp) långt
fragment täckande hela genen och angränsande regioner samt kodande för 17
kDa yttermembranproteinet.
De generella kemiska förhållanden under vilka PCR amplifieringen utfördes
bestod av en blandning av 1 U Taq DNA polymeras (Boehringer, Mannheim) 2,5
jiL 10 ggr buffert innehållande enzym, 1 pli 25 mM MgC12, 2,5 iaL 2 mM dNTP:s,
5 pmol av varje primer, 1 ;IL DNA templat och dubbelt destillerat vatten till 25
pL. Reaktionen utfördes i en Perkin Elmer 9600 thermocycler, och de amplifierade produkterna analyserades på en 1,5% agaros (Kodak) gel i 0,5 Tris borat
EDTA (TBE) buffert. Renat DNA från Rickettsia prowazekii valdes som positiv
kontroll. PCR buffert hanterad på samma sätt som fästingproverna utgjorde
negativ kontroll.
Huvuddelen av den kodande sekvensen av denna gen visas i Sekvenslista nr. 2
och utfördes med hjälp av direkt fast fas DNA-sekvensering. Immobilisering av
de biotinylerade PCR-produkterna följdes av sträng separation och templatpreparation utfördes med hjälp av super paramagnetiska pärlor, Dynabeads M280 Streptavidin (Dynal, Oslo, Norge). Nukleotidsekvensen av 17 kDa OMP
genen bestämdes i båda riktningarna genom automatiserad fast fas DNA
sekvensering med ALF ( Automatiserad Laser Fluorescence) system (Pharmacia
Biotech, Uppsala, Sverige).Sekvensering utfördes även manuellt med 35 S dATP
(Amersham) och Sequenase II (USAB, Ohio) i enlighet med leverantörens
instruktioner.
515 216
8
Exempel 2: Konstruktion av antigen rickettsia-peptid
En teoretisk beräkning av de antigena domänerna utfördes användande
Jameson-Wolf algorithm i programmet DNA StarData. Jameson-Wolf skapar ett
antigenicitetsindex genom att kombinera värden för hydrofilicitet (Hoop-Wood H
(<2> 0,5 <1> 0 <-1>-0,5 <-2>)), ytfasthet (Emini S ( <1> 1.0 <0>)), flexibilitet
(Karplans-Shultz F ( <1> 1.0 <0>)) och de sekundära struktur egenskaperna av
Chou-Fasman (CF (T=2, t=1, 0) samt Garnier-Robson (GR(T=2,
t=1, 0,3) genom följande formel
A = 0,3H + 0,15S + 0,15F + 0,2CF + 0,2GR
Metoden resulterar i en graf, se Fig. 1, som indikerar antigena lägen på platsen
för toppvärdena. Den topp breddande funktionen ger en spridning av toppar
inom områdena 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 80%, 60%, 40%, 20% från
maximum, där toppvärdet för de nio restvärdena omger varje lokalt maximum.
I grafen för antigenpåvisning, där peptidsekvensen i enlighet med uppfinningen
motsvarar regionen av aminosyror mellan 93- 120, visas tre höga toppvärden
uttryckande hög antigenicitet. Denna 28 aminosyrors peptid är visad i Sekvenslista nr. 1.
En konfirmerande metod för att visualisera antigeniciteten är Western blot
assay. 5 pL av renad organism löses i Laemmli lösning (4%SDS, 10% 2merkaptoetanol, 0,5% bromfenol blått, 0,125 M Trishydroklorid (pH 6,8), 25%
glycerol) vid rumstemperatur och SDS-PAGE utföres med en 7,5% separationsgel och 3,9% stacking gel. Gelen körs i en Mini-Protein II cell (Bio-Rad) vid
10mA i isbad), och proteinband visualiserades med färgning med Coomassie
blå. En molekyl viktstandard för vida områden (Bio-Rad) användes för att
uppskatta molekylvikten hos de elektroforetiskt separerade banden. En identisk
gel överfördes till nitrocellulosa papper i en Trans-blot apparat (Bio-Rad) vid 50
V under 1 h i isbad. Ospecifika bindningsställen blockerades övernatt med 5%
fettfri torrmjölk (TBS (1mM Tris hydroklorid (pH 7,5), 250 mM NaC1, 0,01%
Merthiolat). Efter tvätt 10 minuter tre ggr i TBS, tillsattes antisera från index
patienten, spätt 1/100 i 3% fettfri torr mjölk-TBS. Nitrocellulosa papperet
inkuberades på skak i 2 h. Reaktiva antikroppar detekterades med peroxidaskonjugerade anti-human Ig (Bio Meriux, Marcy l'Etoile, France) spädda 1/200 i
515 216
9
3% fettfri torr mjölk-TBS. Efter tre ytterligare tvättar i TBS, detekterades det
bundna peroxidaset med en lösning innehållande 0,015% 4-kloro- l -naftolol,
0,015% väteperoxid, och 16% metanol i TBS. Så fort som banden blev synliga,
stoppades reaktionen med upprepade tvättar i destillerat vatten och ett distinkt
band uppträdde vid 17 kD.
Exempel 3: Diagnostisk användning av den uppfunna peptiden
Ett diagnostiskt reagens innehållande den antigena delen av nämnda OMP kan
användas för detektion/ diagnostik/ kvantifiering av antigena responset hos
människa och andra däggdjur efter kontakt med bakterier nära besläktade med
R. helvetica som uttrycker ett protein innehållande peptiden i uppfinningen.
Diagnostiken kan utföras genom en rad olika metoder till exempel; Indirekt
immunofluorescens; Western blot assays (se exempel 2). Alternativt testas det
cellulära svaret med, till exempel, användning av en Immuno spot assay.
Exempel 4: Terapeutisk användning av den uppfunna peptiden
Den antigena delen av nämnda OMP kan också blandas eller kopplas till ett
adjuvans (till exempel Freunds eller Iscomes) för att användas som vaccin.
Vaccinet kan antingen användas terapeutisk eller profylaktiskt.
515 216
10
SEKVENSLISTOR
Information för Sekvenslista nr. 1:
Längd: 28 as
Typ: aminosyra
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Asn Val Glu Trp Arg Asn Pro Asp Asn
10
15
5
Gly Asn Tyr Gly Tyr Val Thr Pro Asn Lys Thr Tyr Arg
25
20
Information för Sekvenslista nr.2:
Längd: 454 bp
Typ: DNA
ATG ATA CTA TTA TCT AAA ATT ATG ATT ATA GCT CTT GCA GCT TCT
30
ATG TTA CAA GCC TGT AAC GGT CCG GGT GGT ATG AAT AAA CAA GGT
60
90
ACA GGA ACA CTT CTT GGC GGT GCC GGC GGT GCA TTA CTT GGT TCT
120
CAA TTT GGT AAA GGT AAA GGG CAA CTT GTC GGA GTA GGT GTA GGT
150
180
GCA TTA CTT GGA GCA GTT CTT GGC GGG CAA ATC GTT GCA GGT ATG
210
GAT GAG CAG GAT AGA AGA CTT GCA GAG CTT ACC TCA CAG AGA GCT
240
270
TTA GAA GCA GCT CCT AGC GGT AGT AAC GTA GAG TGG CGT AAT CCG
300
GAT AAC GGC AAT TAC GGT TAC GTA ACA CCT AAT AAA ACT TAT AGA
330
360
AAT AGC ACT GGT CAA TAT TGC CGT GAG TAC ACT CAA ACA GTT GTA
390
ATA GGC GGA AAA CAA CAA AAA GCA TAC GGT AAT GCA TGC CGC CAA
420
450
CCT G
515 216
11
Svenska patentansökan nr. 9800504-4
PATENTKRAV
1.
Peptid innefattande aminosyrasekvensen som visas i Sekvens-lista nr. 1.
2.
Peptid i enlighet med krav 1, vilken erhålles från naturliga källor, eller
produceras på syntetisk eller på rekombinant väg.
3.
Gen kodande för peptiden i enlighet med krav 1 eller 2 innehållande alla
varianter beroende på den degenererade genetiska koden.
4.
Diagnostiskt reagens innehållande peptiden i enlighet med krav 1 eller 2
eller immunresponsgenererande delar eller varianter av sekvensen enligt
Sekvens-lista nr. 1 för detektion av rickettsioser.
5.
Diagnostiskt reagens i enlighet med krav 4, för detektion av infektioner
med bakterier nära besläktade med R. helvetica uttryckande peptid i enlighet
med krav 1.
6.
Diagnostiskt reagens i enlighet med krav 4 och 5, som är fritt eller
bundet till lipider eller kolhydrater.
7.
Diagnostiskt kit innefattande ett diagnostiskt reagens i enlighet med krav
4-6.
Diagnostiskt kit i enlighet med krav 7, i vilket reagenset är i form av en
8.
lösning eller bundet i fast fas.
Diagnostiskt kit i enlighet med krav 6-8, innefattamde en märkt anti-Ig
9.
antikropp för detektion av däggdjurs IgA, IgG eller IgM antikroppar mot ett
antigen från bakterier nära besläktade med R. helvetica.
Diagnostiskt kit i enlighet med krav 6-9, i vilket däggdjurs antikropparna
10.
innehålls i kroppsvätskor såsom serum, blod, cerebrospinalvätska, tårvätska,
semen eller svett.
515 216
12
Diagnostiskt kit i enlighet med krav 6-8, innehållande ett märkt T-cells11.
igenkännande agens för detektion av rickettsioser.
Diagnostiskt kit i enlighet med krav 11, för detektion av cellulära
12.
immunsvaret mot ett antigen från bakterier nära besläktade med R. helvetica.
Vaccin innefattande peptider i enlighet med krav 1 eller 2 eller immun13.
responsgenererande delar eller varianter av sekvensen enligt Sekvens-lista 1 för
behandling av rickettsioser.
1111e1i
A
A
B
B
el;
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
■ Alfaregioner - Garnier-Robson
Alfaregioner - Chou-Fasman
■ Betaregioner - Garnier-Robson
Eg Betaregioner - Chou-Fasman
T
T
C
▪ Vändningsregioner- Garnier-Robson
59
,
Pä
K::
M M
■ Vändningsregioner - Chou-Fasman
o Spiralregioner - Garnier-Robson
2.77
0
■ Hydrofilicitetsplot - Kyte-Doolittle
CN
■ Alfa, amfipatiska regioner - Eise
■ Beta, amfipatiska regioner - Eisenb
■ Flexibla regioner - Karplus-Schulz
3.4—
0
■ Antigent index - Jameson-Wolf
u Yt-sannolikhetsplot - Emini