exogen

Ingress
Vi har i detta projekt haft en bred ansats för att studera en yttre utlöst (exogen) skada på innerörat i
syfte att kunna utveckla metoder för att begränsa skadan och därmed reducera hörselnedsättning.
Arbetet har utnyttjat två experimentella modeller för exogen skada: 1) Impulsbullerskada 2)
Ototoxisk skada utlöst av läkemedlen cisplatin och gentamicin. Vi har studerat molekylära
mekanismer för skada och främst oxidativa mekanismer, protektion och behandling av skada genom
tillförsel av skadehämmande substanser via inhalation och intravenös injektion, transport av olika
aktiva substanser i innerörat samt nya bärarsubstanser för lokal administration till innerörat. Vårt
övergripande mål är genom experimentella studier bana vägen för kliniska studier och vi har i
projektet bedrivit ett långtgående planeringsarbete för en klinisk studie. Den första kliniska studien
beräknas kunna börja under senare delen av 2016.
Man beräknar att omkring 360 människor i världen lider av besvärande hörselnedsättning. Av dessa
är 32 miljoner barn. Hörselnedsättning kan grovt indelas i två typer; konduktiv och sensorineural
hörselnedsättning. En hörselnedsättning kan innehålla både konduktiva och sensorineurala
komponenter. Konduktiv hörselnedsättning avser att beskriva en hörselnedsättning som uppstått på
grund av förändringar eller sjukdom i ytterörat eller mellanörat. Vid en konduktiv hörselnedsättning
hindras ljudvågorna att effektivt nå innerörat för att omvandlas till nervimpulser. Sensorineural
hörselnedsättning som orsakas av skador på sensoriska hårceller och nerver är den vanligaste typen
av hörselnedsättning. Perifer sensorineural hörselnedsättning kan grovt indelas i två typer, en
endogen och en exogen.
De skador som utvecklas efter kraftigt buller eller hörselskadliga läkemedel kan betecknas som
exogena skador. Vi har väsentligen endast i observationsstudier möjlighet att grovt karaktärisera en
exogen hörselnedsättning hos individer som drabbas av dessa skador. Däremot är det inte möjligt att
genomföra ingående studier av detaljerade effekter på humant inneröra vid exogen
hörselnedsättning. Vi saknar helt enkelt teknik för att in vivo kartlägga hörselskadliga mekanismer i
det humana innerörat som ligger inbäddad i ett av kroppens hårdaste ben oåtkomligt för direkt
inspektion. Det lilla innerörat rymmer mycket specialiserade cellulära funktioner för att omvandla
ljud och spatial orientering till nervimpulser som fortleds till hjärnan. Istället kommer mycket av den
kunskap som finns om exogena skador på innerörat från experimentella studier. Vi har ett flertal år
arbetat för att öka kunskapen om farmakologiska effekter på innerörat. Genom projektanslaget från
afa har vi under drygt tre år kunnat arbeta med de frågeställningar som är uppställda i
projektbeskrivningen. Under denna period har vi för projektet installerat ett in vivo laboratorium på
Akademiska sjukhuset, upprättat lokala samarbeten på Uppsala universitet och utvidgat våra
internationella samarbeten genom forskning med kollegor vid Charité, Universitätsmedizin Berlin,
Tyskland. En del av arbetet har skett på KERIC (Karolinska Experimental Research and Imaging
Centre), Karolinska universitetssjukhuset, där vi arbetat med experimentella magnetkamerastudier.
Tack vare projektanslaget från afa finns tekniska möjligheter att fortsätta våra studier på
farmakologisk behandling och prevention av exogen inneröronskada.
Bakgrundsfakta till projektet
Innerörat består av cochlean och vestibularisorganen. Den inre delen av cochlean, den s.k.
membranösa delen, är uppdelad i tre trapprum eller scalae: scala tympani, scala media och scala
vestibuli. Scala tympani och scala vestibuli är fylda av perilymfa, en vätska som har stora likheter med
extracellulärvätska. Det mellersta trapprummet, scala media är fylld med endolymfa som har en hög
koncentration av kalium och ett låg koncentration av natrium. Endolymfan bildas i det
vaskulariserade epitelet i lateralväggen, stria vascularis, medan lokalisationen för produktion av
perilymfa inte är fullt kartlagd. I scala media finns själva receptororganet för hörseln, det Cortiska
organet, med receptorcellerna, de inre och yttre hårcellerna, och deras stödjeceller. Innerörats
mikrocirkulation och de två parallellt funktionella barriärerna upprätthåller den cochleära
homeostasen. Blod-perilymfa barriären är den funktionella barriären mellan blodbanan och de
perilyfatiska rummen. Intrastria-blod barriären, separerar blodbanan från endolymfa, har en högre
permeabilitet. Här är gap junctionproteiner (connexiner) viktiga byggstenar, liksom perivaskulära
melanocytliknande makrofager. Även om en stor del av kunskapen om innerörats biokemi och
mikromorfologi härrör från experimentell forskning så måste man räkna med att det finns betydande
skillnader mellan det humana innerörat och försöksdjurens inneröron.
Morfologiska skador på främst de yttre hårcellerna ses vid exogent trauma såsom efter
impulsbullerexposition eller vid exposition för skadliga (ototoxiska) nivåer av de hörselskadliga
läkemedlen cisplatin och gentamicin. Det är från djurförsök visat att oxidativ skada via reaktiva
syreradikaler är involverad. De inre och yttre hårcellerna är för sin funktion beroende av ATP som
bildas i mitokondrierna. En störning av mitokondriernas elektontransportkedja leder till
överproduktion av reaktiva syreradikaler. Cellernas redoxsystem, främst glutationsystemet
(eventuellt av tioredoxinsystemet), spelar en avgörande roll för detoxifiering av fria syreradikaler
(ROS) i cochlean. Behandling med antioxidanta substanser kan bidra till en minskad cellskada och
celldöd vid exogena skademekanismer i innerörat.
Vi har i flera av våra studier använt oss av försöksdjur, marsvin och mus. För alla försök har vi haft
djurförsöksetiska tillstånd och experimenten har genomförts med målsättningen att tillföra
försöksindividerna så lite lidande som möjligt. Försöksindividernas hörselfunktion har skattats med
frekvensspecifik hjärnstamsaudiometri (ABR). Prov har regelbundet tagits från blod, scala tympani
perilymfa efter ett kirurgiskt ingrepp och vid ett av delförsöken från cerebrospinalvätska. Efter att
försöken har avslutats har innerörat fixerats för beräkning av skadade eller döda hårceller.
Målsättningen med projektet
I ett tidigare projekt (diarienummer T-51:05) har vi utvecklat prevention för att förhindra
cisplatinskador i innerörat med hjälp av tiosulfatladdad hyaluronangel som injicerades till mellanörat.
I vår projektansökan 110824 med titeln ”Farmakologisk behandling och prevention av exogen
inneröronskada” beskrev vi följande målsättning och hypoteser för detta projektet:
Nu vill vi vidareutveckla metoden, inkludera indikationerna impulsbuller och aminoglykosid-orsakad
skada samt studera molekylära effekter i inneröronvävnad vid exogen skada samt vid protektion mot
denna. Vi ska även studera alternativa otoprotektiva metoder för de fall då mellanöronadministrering
kan behöva kompletteras. Denna unika breda ansats är möjlig genom den utvidgade kompetens som
byggts upp: gruppen har farmaceutisk, farmakokinetisk, kemisk, experimentellt otologisk, kirurgisk,
klinisk och molekylärbiologisk kompetens.
Hypotes 1. Att impulsbuller, cisplatin och minoglykosider har liknande ROS-medierade effekter på
hårcellernas mitokondrier och därmed på deras ATP-produktion och cellulära funktion, och att dessa
effekter hämmas av antioxidanter (i projektet främst vätgas, tiosulfat och resveratrol).
Hypotes 2. Att inhalerad vätgas respektive lokal administrering i mellanörat av tiosulfat/resveratrol i
en HA-gel skyddar mot exogeninneröronskada hos människa.
Projektets delmål:
• I. Oxidativ skada och metabola effekter efter in vitro och in vivo behandling med impulsbuller,
cisplatin och aminoglykosider;
• II. Skadehämmande effekter av vätgas, tiosulfat och resveratrol efter inducerad inneröronskada in
vitro och in vivo;
• III. Distribution och elimination av HA-gel i mellanöra hos patienter med utslagen hörsel
• IV. Transportproteiners betydelse för distribution av cisplatin i innerörat (djurstudier);
• V. Distribution och transport av mangafodipir i innerörat efter mellanöronadministrering (studier
på djur och människa);
Alla positiva utfall har haft avsikten att skapa ett experimentellt underlag för humanstudier.
Uppnådda resultat
I. Oxidativ skada och metabola effekter efter in vitro och in vivo behandling med impulsbuller,
cisplatin och aminoglykosider.
A. Oxidativ skada och metabola effekter in vitro
The effects of cisplatin and aminoglycosides on hair cell mitochondria
I detta delprojekt har vi studerat effekter och skador utlösta av två läkemedel, cisplatin och
gentamicin (en aminoglykosid) på mitokrondrier i odlade celler tillhörande Cortiska organet.
Studierna har genomförts i ett samarbete med PhD Agnes Szczepek och professor Birgit Mazurek vid
Campus Charite Mitte, Berlin, Tyskland. Cochleor från nyfödda Wistar råttor (postnatala råttor dag 35) dissekerades fria och användes för studien. Det Cortiska organet (CO) odlades i medium till ett så
kallat cochleärt explantat. Med Real Time PCR/Western blot identifierades gener/proteiner
involverade i mitochondriernas dysfunktionella metabolism utlöst av de två läkemedlen. Vår hypotes
att cisplatin och aminoglykosider har liknande ROS-medierade effekter på hårcellernas mitokondrier
och därmed på deras ATP-produktion och cellulära funktion kan delvis förkastas. Vi fann att mönstret
av effekter på mitokondrierna, åtminstone in vitro, skiljer sig mellan cisplatin och gentamicin. Redan
tre timmar efter exposition för cisplatin respektive gentamicin påträffades förändringar i gener
involverade i mitokondriernas struktur och metabolism. När det gäller mitokondriell
energimetabolism fanns hos de cisplatinbehandIade CO explantat ett överuttryck för genen
ATP6vOd2 och ett underuttryck för genen ATP6v1g3. I gentamicinbehandlade CO explantat fann vi
två underuttryckta gener, ATP5g3 och Nduf6. Två av dessa gener undersöktes vidare med avseende
på nivåer av proteinerna GrpEL-1 och ATP6vOd2. GrpEL-1 proteinet utgör en del av mitokondriernas
matrix och har betydelse för proteintransport till mitokondriernas inre membran. Proteinet
ATP6vOd2 är en underenhet till vakuolärt ATPase6 och deltar i ATP hydrolys. GrpEL-1 och ATP6vOd2
proteinerna detekterades i CO explantat. Efter 24 timmar var proteinuttrycket för ATP6vOd2
nedreglerat i cisplatinbehandlade CO explantat men inte i gentamicinbehandlade CO explantat.
Figur 1. Uttryck av GrpEL-1 och ATP6vOd2 proteiner i cisplatin- och gentamicinbehandlade Cortiska
organ explantat jämfört med obehandlade kontroller, 24 timmar efter exposition.
B. Oxidativ skada och metabola effekter in vivo
Cisplatin-induced metabolomic changes in serum and ototoxicity: a pre-clinical hypothesis-generating
in vivo study. I manuskript
Omfattningen av en oxidativ skada kan bedömas med “metabolomics methods”/metabolomik teknik.
Ett s.k. metabolom omfattar alla små endogena metaboliter I ett biologiskt system. Med
metabolomik kan man identifiera en mängd metaboliter som kan avspegla exempelvis ett läkemedels
aktivitet och toxicitet. I experimentell forskning på exogen hörselnedsättning är det brukligt att man
endast studerar effekter på innerörat. I vår forskning har vi valt att även intressera oss för systemiska
effekter, det vill säga effekter på hela individen i samband med exogen hörselnedsättning. Vårt
intresse för experimentella studier på helkropp när vi utvecklar farmakologisk behandling av
innerörat är unik inom den experimentella inneröronforskningen och har betydelse för möjligheten
att ta resultat från laboratorieförsök till kliniska studier.
I denna studie har vi använt en av våra in vivo modeller för exogen hörselnedsättning för att studera
effekter av cisplatin på blodmetabolomet. Vi delade upp försöksdjuren i två grupper. Båda grupperna
erhöll samma dos cisplatin intravenöst, i den ena gruppen gavs tiosulfat (en känd otoprotektor) 30
minuter före cisplatininjektionen, till den andra gruppen gavs koksalt 30 minuter före
cisplatininjektionen. Mätning av elektrofysiologiska hörtrösklar gjordes och blodprov togs från varje
försöksdjur före behandling och fyra dagar efter injektionerna. Vi fann en stark korrelation mellan
hörtröskelförändring vid 30 kHz och ökning av glutation i blodet oavsett om försöksdjuret erhöll
tiosulfat eller koksalt. Vi har två alternativa förklaringar till förändring av glutation i blodet, antingen
tömmer apoptotiska celler sitt glutation till extracellulärt spatium eller sker en cisplatininducerad
ökad syntes av glutation i levern. Eftersom ingen tidigare studie har kunnat visa på denna förändring
kan våra fynd anses vara intressanta i ett vidare perspektiv för att bättre förstå antioxidativa
mekanismer i samband med ototoxisk skada utlöst av cisplatin.
II. Skadehämmande effekter av vätgas, tiosulfat och resveratrol efter inducerad inneröronskada in
vitro och in vivo
Skadehämmande effekter av exogen hörselskada är ett viktigt forskningsområde för att begränsa
uppkomsten av hörselskador. I denna del av projektet har vi genomfört sex delstudier
A. Skadehämmande effekt in vivo
STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) är en transkriptionsfaktor som tillhör en
grupp av STAT proteiner. Vid stimulering av vissa cytokiner och tillväxtfaktorer fosforyleras STAT3 och
translokaliseras till cellkärnan och fungerar där som transkriptionsfaktor. Man har tidigare visat att
serine fosforylering och mitokondriell translokalisation av STAT3 stabiliserar mitokondrier och denna
process kan därmed innebära en protektiv mekanism vid exogen hörselnedsättning. Co-enzym
Ubiquinone 10 (co-enzym Q10, CoQ10) är involverad i eletrontransport vid aerobisk respiration.
CO explantat exponerades för media med eller utan CoQ10 (i en nano-suspension) under 24 timmar.
Därefter utsattes explantaten för cisplatin löst i mediet. Efter ytterligare 24 timmar skördades
cellerna, de fixerades och färgades med phallodin. Förbehandling med CoQ10 skyddade både
hårceller och ganglieceller mot cisplatinskada. Resultaten talar för att den skyddande mekanismen
sker via en stabilisering av mitokondriernas metabolism.
Figur 2. Tre uppsättningar av inre och yttre hårceller i explantat: kontroll, cisplatinbehandlad och
förbehandlad med CoQ10 (Ubichinon) innan cisplatinbehandling.
B. Skadehämmande effekt in vitro
1) Protektion av impulsbullerskada med vätgas
Hydrogen inhalation for preservation of hearing in the guinea pig. I manuskript
Molekylärt väte är en intressant substans för protektion och behandling av exogen hörselnedsättning
eftersom den kan ha antioxidanta, antiinflammatoriska och antiapoptotiska effekter. Vi har valt att
studera en eventuell skyddande effekt av vätgas mot exogen hörselnedsättning av flera skäl. Främst
därför att vätgas skulle kunna användas för en snabbt insatt behandling efter ett akut bullertrauma i
arbetslivet. Det är i högsta grad troligt att vätgas med sin mycket låga molekylvikt lätt och snabbt
passerar till stria vascularis i lateralväggen av cochlean, till gangliecellerna och även över intrastriablodbarriären till målceller för impulsbullerskada i det Cortiska organet.
I våra studier har vätgas givits till sövda försöksdjur via inhalation. I denna delstudie valde vi att
jämföra effekt av vätgasbehandling på våra två modeller för exogen hörselnedsättning in vivo, i
samband med impulsbullerexponering respektive intravenös injektion av cisplatin. Först mättes
elektrofysiologiska hörtrösklar med ABR därefter genomfördes den hörselskadliga behandlingen.
Försöksdjuren inhalerade vätgas under 60 minuter med start direkt efter impulsbullerexposition och
cisplatinbehandling. Fyra dygn senare sövdes försöksdjuren på nytt för mätning av ABR trösklar. Som
figur 3 visar gav vätgasinhalation en signifikant skyddande effekt vid vissa frekvenser i båda
modellerna för exogen hörselnedsättning. Vi kunde dock inte notera någon komplett protektion.
Observationstiden är kort och man kan 4 dygn efter impulsbullertrauma förvänta sig att
hörtrösklarna inte fullt har stabiliserats, det vill säga att det fortfarande kan föreligga en komponent
temporär hörselnedsättning (så kallad TTS). Vårt djurförsöksetiska tillstånd gav oss dock bara tillstånd
att studera
skademekanismerna inom 4 dygn. Resultaten är dock
*
mycket lovande och ger hopp om att vi kan renodla vätgasinhalationen för en bättre behandling vid
impulsbullerskada.
*
*
*
*
*
*
*
Figur 3. Medianskillnaden i hörtröskelvärde före och 4 dygn efter behandling. –*– indikerar
signifikant skillnad mellan två grupper (p<0,05, Mann Whitney U-test), kontrollgrupp och studiegrupp
2) Effekter av vätgas på metabolomet i scala tympani perilymfa i samband med exogen hörselskada
Vi har aspirerat scala tympaniperilymfa från innerörat hos fösöksdjur 4 dygn efter att en exogen
hörselnedsättning har etablerats (buller respektive cisplatin). Analysarbete pågår. Inga resultat kan
här redovisas.
3) Fenformins effekt mot Pt-orsakad inneröronskada
Hellberg V, Gahm C, Liu W, Ehrsson H, Rask-Andersen H, Laurell G. Immunohistochemical localization
of OCT2 in the cochlea of various species. Laryngoscope. 2015 Sep;125(9):E320-5. doi:
10.1002/lary.25304. Epub 2015 Apr 17
I syfte att skydda mot cisplatininducerad oto- och nefrotoxicitet har vi studerat systemisk behandling
med fenformin istället för resveratrol. Fenformin som tillhör gruppen biuganider är ett
blodsockersänkande läkemedel men har utgått från den klinisk behandlingsarsenalen på grund av
rapporterade fall av laktatacidos. Detta läkemedel påverkar transportproteinet OCT2 i cellen vilket
teoretisk skulle kunna motverka transport av cisplatin till målcellerna i innerörat och därmed skydda
innerörat från en cisplatinskada Vi kunde dock inte påvisa några säkerställda effekter av preparatet
när det gäller otoprotektion hos de försöksdjur som behandlades med resveratrol i samband med
intravenös cisplatininjektion. Elektrofysiologiska hörtrösklar, hårcellsbortfall och nivå av totalplatina i
innerörat skiljde sig inte mellan studiedjur och kontrolldjur.
III. Distribution och elimination av HA-gel i mellanöra hos patienter med utslagen hörsel
Det övergripande målet med projektet (såsom det beskrivs i ansökan) är att skapa ett experimentellt
underlag för humanstudier. Som tidigare beskrivits i våra delrapporter har vi kommit längre i denna
strävan än vad vi kunde formulera i ansökan. Vi har lagt ned mycket arbete under det senaste tre
åren i förberedelser för en klinisk studie för protektion mot exogen hörselskada utlöst av
cisplatinbehandling, genom en behandling med tiosulfatinnehållande hyalurongel (HA-gel). Gelen ska
injiceras till mellanörat före patienten erhåller cisplatinbehandling. För detta har vi fått godkännande
från etikprövningsnämnden för studie på cisplatinbehandlade patienter på Karolinska
universitetssjukhuset och Akademiska sjukhuset (Dnr 2013/344-31/2). Denna delstudie vilar på ett
samarbete mellan onkologiska kliniker, ÖNH-kliniker och hörselkliniker. Vi har därför ansett att det är
onödigt genomföra den planerade delstudien med injektion av HA-gel till mellanörat på döva
patienter. Den nu aktuella delstudien har fått arbetsnamnet Thiosulfate Against Cisplatin Ototoxicity
(TACO). Patienter med cisplatinbehandling >70 mg/m2 kroppsyta kommer erbjudas att ingå i en
dubbelblind randomiserad studie där man i det ena örat injicerar tiosulfatinnehållande HA-gel och i
det andra enbart HA-gel. Styrkeberäkning ger för handen att vi behöver rekrytera 120 patienter till
studien. Kostnaden för detta projekt är stor och ytterligare finansiering har sökts från
vetenskapsrådet, ALF-medel i Stockholms läns landsting, Action on Hearing loss, Nordisk Novo och
BioX. Vi har erhållit ALF-medel för detta projekt i Stockholm (Pernilla Videhult-Pierre) och ett
forskningsanslag från Nordisk Novo (Anders Fridberger). Vi har byggt upp en noggrann logistik för
studien och avser att starta när produktionen av HA-gelen har kommit igång. Extemporetillverkaren
APL har fått i uppdrag att tillverka prövningsläkemedlet. De har utvecklat en metod för tillverkningen
och studerar just nu stabiliteten av prövningsläkemedlet. Färska resultat visar god stabilitet, vilket
innebär att vi kan söka tillstånd hos Läkemedelsverket för att få genomföra studien. Vi beräknar ha
starta studien under senare delen av 2016.
IV. Transportmekanismer i innerörat. Transportproteiners betydelse för distribution av cisplatin i
innerörat.
1. Transportproteiners betydelse för distribution av Pt i innerörat.
Hellberg V, Gahm C, Liu W, Ehrsson H, Rask-Andersen H, Laurell G. Immunohistochemical localization
of OCT2 in the cochlea of various species. Laryngoscope. 2015 Sep;125(9):E320-5. doi:
10.1002/lary.25304. Epub 2015 Apr 17
Intrastria-blod barriären har många strukturella likheter med blod-hjärnbarriären. Ett betydande
antal transportproteiner har identifierats i blod-hjärnbarriären. Vi har med immunhistokemi och
konfokalmikroskopi lokaliserat transportproteinet organisk katjon-transportör (OCT-2) i cochlean hos
marsvin, råtta och gris. Vår hypotes var att OCT-2 medverkar till ökat upptag av cisplatin till Cortiska
organet via förekomst av OCT-2 i stria vascularis, alternativt genom förekomst av OCT-2 i de yttre
hårcellerna. I alla tre undersökta species kunde vi inte lokalisera OCT-2 i de nämnda cellförbanden.
Istället fann vi en tydlig förekomst av OCT-2 i Cortiska organets stödjeceller och ganglieceller såsom
figur 4 visar.
Figur 4. Sammanfogade bilder tagna med konfokalmikroskop. Röd färg visar OCT-2 i stödjeceller i
Cortiska organet respektive i ganglieceller.
I ett närliggande och pågående projekt studerar vi proteininnehållet i human perilymfa.
2. Farmakokinetikens betydelse för exogen hörselskada vid cisplatinbehandling
Hellberg V, Wallin I, Ehrsson H, Laurell G. Cochlear Pharmacokinetics of Cisplatin: An In Vivo Study in
the Guinea Pig. Laryngoscope. 2013 Dec;123(12):3172-7. doi: 10.1002/lary.24235. Epub 2013 Jul 29.
Typiskt för cisplatin är att skadan i cochlean börjar i det högre frekvensregistret för att vid mer
uttalade skador även drabba de lägre frekvensområdena. Skador i det högre frekvensregistret
drabbar cochleans basala delar nära runda fönstret. Vår hypotes i denna studie var att
farmakokinetiken i cochleans perilymfa skiljer sig mellan bas och apex. I en in vivo studie på 47
försöksindivider studerades upptag och elimination av cisplatin och dess monohydrerade komplex i
scala tympani perilymfa (PLT), cerebrospinalvätska (CSF) och blod. Som figur 5 visar var upptaget av
cisplatin i PLT signifikant högre i cochleans bas jämfört med apex under 20 minuter efter en
intravenös injektion. Eliminationen av cisplatin var långsammare från PLT än blod. De två
farmakokinetiska resultaten kan vara en förklaring till förekomsten av ototoxisk skada i cochleans
bas.
Figur 5. Koncentration av fritt cisplatin i blod, CSF, scala tympani perilymfa i bas respektive apex
3. Undersökning av permeabiliteten i innerörat för gadolineuminnehållande kontrastmedel.
Counter SA, Nikkhou S, Brené S, Damberg P, Sierakowik A, Klason T, Berglin CE, Laurell G. MRI
evidence of endolymphatic impermeability to the gadolineum molecule in the in vivo mouse inner
ear at 9.4 tesla. Open Neuroimag J 2013;7:27-31.
Med hjälp av experimentell magnetisk resonanstomografi (MRT) har vi möjlighet att följa förlopp och
kinetiken för paramagnetiska substanser, vanligtvis gadoliniuminnhållande (Gd) kontrastmedel.
Denna teknik gör det därmed möjligt att exempelvis studera innerörats olika barriärer, blodperilymfabarriären och intrastria-blod barriären in vivo. Vi kan också följa den barriär som finns för
substanser som transporteras från mellanörat till innerörat, den så kallade mellanöreinnerörebarriären. Tidigare studier på marsvin med hjälp av MRT 4,7 tesla har visat att Gd
kontrastmedel transporteras till cochleans perilymfatiska vätskerum men sannolikt inte genom den
barriär som omger det endolymfatiska vätskerummet, intrastria-blod barriären. I denna studie
använde vi högupplösande MRT 9,4 tesla och fann vi ytterligare bevis för att det endolymfatiska
rummet har en mycket låg permeabilitet för gadolineum.
Figur 6. MRT-bild av höger och vänster cochlea efter intravenös injektion av gadolinium. Mörkare
band i cochlean visar det endolymfatiska rummet väsentligen utan upptag av kontrastmedlet.
Storleken på musens cochlea är cirka 1,3-1,4 mm.
Det är välkänt att om loop-diuretikum furosemid injiceras samtidigt med ett ototoxiskt läkemedel
(exempelvis cisplatin och gentamicin) erhålls en potientiering av den ototoxiska effekten och en
större hörselnedsättning uppstår. I en annan delstudie har vi studerat hur furosemid påverkar
innerörats barriärer in vivo. Med högupplösande MRT fann vi att en intravenös injektion av
furosemid som föregick en injektion av Gd kontrastmedel kraftigt ökade Gd signalen i scala media i
innerörat. Vi spekulerar att mekanismen är en tillfälligt ökad permeabilitet av intrastria-blod
barriären på grund av blockering av jonkanalen NKCC1 i stria vascularis. Analys av data pågår.
Figur 7. Human stria vascularis som visar lokalisationen av den furosemidkänsliga jonkanalen NKCC1
och Na-K-ATPase (bild från Wei Lui, ÖNH-enheten, inst. för kir vet, Uppsala universitet)
4. Strukturell och dynamisk diagnostik av innerörat med kombinerad bildåtergivningsteknik
Counter SA, Damberg P, Nikkhou Aski S, Nagy K, Engmér Berglin C, Laurell G. Experimental fusion of
contrast enhanced high-field magnetic resonance imaging and high-resolution micro-computed
tomography in imaging the mouse inner ear. Open Neuroimag J 2015;9:7-12
Det är önskvärt att diagnostiken av innerörats sjukdomar, endogena och exogena cochleära såväl
som vestibulära sjukdomar, bättre kan diagnosticeras. Det finns här en potential för utveckling av
bilddiagnostik. Vi har i denna delstudie utnyttjat möjligheten att fusionera högupplösande MRT med
microdatortomografi för att åskådliggöra innerörats benlabyrint och perilymfatiska fördelningsrum.
Ett exempel på detta visas i figuren nedan.
Figur 8. Fusionerad bild av musinneröra, cochlea och vestibularisapparaten. Scala media visas i rött.
V. Distribution och transport av mangafodipir i innerörat efter mellanöronadministrering (studier
på djur och människa)
Counter S.A., Nikkhou Aski S., Damberg P, Engmér Berglin C., Laurell G. Comparative uptake
parameters of contrast agents across the blood perilymph barrier and intrastrial fluid-blood barrier in
the mouse inner ear using ultra high-field MRI. Manuskript inskickat till tidskrift
Vi har på KERIC tillgång till en 9,4 tesla magnetkamera (MRT) för experimentella studier. Med MRT
kan utmärkt information erhållas om kinetik av Gd kontrastmedel i innerörat, även på mus som
försöksindivid. Teoretiskt har mangafodipir tett sig som en idealisk substans att testa för
administration till innerörat. Det är en manganinnehållande substans med paramagnetiska och
antioxidativa effekter. Vi inledde detta delprojekt med att studera intravenös administration av
mangafodipir. Det visade sig att substansen inte gav de önskvärda signalförstärkande effekterna på
innerörat vid MRT i doser som försöksindividerna kunde tolerera. Substansen gav istället upphov till
toxiska effekter. Vi valde därför att genomföra delprojektet med en annan inriktning och har studerat
fyra olika Gd kontrastmedel för att identifiera det bästa signalförstärkande kontrastmedlet. I
delstudien har vi utgått ifrån att Gd-signalen representerar koncentrationen av kontrastmedlet. Våra
presultat visar att Dotarem (Gd-DOTA) har de bästa signalförstärkande egenskaperna vid
undersökning av innerörat i en experimentell uppsättning.
Figur 9. Upptag av fyra Gd kontrastmedel i innerörats olika fördelningsrum
VI. Nya bärarsubstanser för lokal administration till innerörat
Vår modell för lokalbehandling av innerörat med hjälp av en bärarsubstans som injiceras till
mellanörat utvecklades i vårt tidigare projekt finansierat av afa (diarienummer T-51:05). Resultaten
från detta projekt talade starkt för att använda hyaluronan som bärarsubstans vid injektion till
mellanörat (1. Engmér Berrglin Cancer Chemother Pharmacol. 2011;68(6):1547-56; 2. Berglin et al. Otol
Neurootol. 2014;35(3):526-532. 3. Engmér Berglin et al. Acta Otolaryngol 2015;135(10)_985-994).
Experimentella och kliniska erfarenheter motiverar nu oss att utveckla denna lokalbehandlingsmodell
med utnyttjande av andra bärarsubstanser. I detta delprojekt har vi arbetat med två målsättningar:
att finna en mucoadhesiv substans som kan injiceras till mellanörat i en mer begränsad volym samt
att bättre kunna hantera eliminationen av bärarsubstansen. Detta torde ha betydelse för
patientacceptans vid mellanöronadministration för lokalbehandling av exogen hörselnedsättning och
därmed compliance när det finns behov av upprepade injektioner. Vi har inlett ett samarbete med
ett litet svenskt bioteknikföretag för att undersöka deras polymer som bärare för en ototprotektiv
substans. I omfattande delstudier har vi studerat denna bärarsubstans. Vi har funnit en optimal
koncentration av bärarsubstansen för mellanöronadministration. Effekter av bärarsubstansen på
elektrofysiologiska hörtrösklar har studerats under 10 dagar efter injektion till mellanörat. Med
tiosulfat i bärarsubstansen har den ototprotektiva effekten undersökts på exogen hörselnedsättning.
Hårcellsräkning pågår (cochleogram). Eliminationen av Gd innehållande bärarsubstans har också
studerats med MRT. Data är under analys och preliminära resultat ser mycket lovande ut men kan av
eventuella patentskäl inte presenteras för närvarande.
Avvikelser i projektet utifrån projekttbeskrivningen
·Vi har inte kunnat studera ROS-medierande effekter på hårcellernas mitokondrier efter
bullerexposition
·Vi har inte genomfört en studie på distribution och elimination av hyaluronangel i mellanöra på
patienter med utslagen hörsel (v.g. se punkt III)
·Vi har inte studerat distribution och transport av mangafodipir i inneröörat efter
mellanöronadministration (v.g. se punkt V)
Insatser som skett och planeras för att resultatet ska komma till praktisk användning i arbetslivet
Vårt forskningsprojekt har varit framgångsrikt med avseende på våra experimentella frågeställningar.
Vi har genererat ny kunskap om exogen hörselnedsättning och protektion mot exogen
hörselnedsättning. Ett omfattande arbete återstår för att göra alla intressanta resultat tillgängliga för
publicering och för populärvetenskaplig spridning. Detta arbete kommer att fortsätta efter att
projektet avslutats. Omfattningen av detta arbete är dock delvis beroende på eventuell vidare extern
finansiering av vår forskning. Dock krävs ytterligare forskning för att ta våra viktigaste resultat till
arbetslivet. Det kanske intressantaste fyndet som vi har gjort för arbetslivet är den partiella
protektionen som vätgas har på impulsbullerskada. Det kommer nu att krävas ytterligare studier för
att skapa bättre kunskap om dosering och tidpunkter för vätgasbehandling.
Under projekttiden har följande manuskript publicerats med stöd från afa
1. Hellberg V, Wallin I, Ehrsson H, Laurell G. Cochlear pharmacokinetics of cisplatin: An in vivo study
in the guinea pig. Laryngoscope. 2013;123(12):3172-3177. Jun 11. doi: 10.1002/lary.24235. [Epub
ahead of print].
2. Counter SA, Nikkhou S, Brené S, Damberg P, Sierakowik A, Klason T, Berglin CE, Laurell G. MRI
evidence of endolymphatic impermeability to the gadolineum molecule in the in vivo mouse inner
ear at 9.4 tesla. Open Neuroimag J 2013;7:27-31.
3. Berglin CE, Laurell G, Bramer T, Edsman K, Counter SA, Klason T, Ekborn A. Magnetic resonance
imaging of the middle and inner ear after intratympanic injection of a Gadolineum-containing gel.
Otol Neurotol. 2014;35(3):526-32. [Epub ahead of print].
4. Dammeyer P, Hellberg V, Wallin I, Laurell G, Shoshan M, Ehrsson H, Arnér ES, Kirkegaard M.
Cisplatin and oxaliplatin are toxic to cochlear outer hair cells and both target thioredoxin reductase in
organ of Corti cultures. Acta Otolaryngol. 2014;134(5):448-54. doi: 10.3109/00016489.2013.879740.
5. Engmér Berglin C, Videhult Pierre P, Ekborn A, Bramer T, Edsman K, Hultcrantz M, Laurell G. Local
treatment of the inner ear: a study of three different polymers aimed for middle ear administration.
Acta Otolaryngol. 2015;135(10):985-94. doi: 10.3109/00016489.2015.1058534. Epub 2015 Jul 4.
6. Counter SA, Damberg P, Nikkhou Aski S, Nagy K, Engmér Berglin C, Laurell G. Experimental fusion
of contrast enhanced high-field magnetic resonance imaging and high-resolution micro-computed
tomography in imaging the mouse inner ear. Open Neuroimag J 2015;9:7-12.
7. Hellberg V, Gahm C, Liu W, Ehrsson H, Rask-Andersen H, Laurell G. Immunohistochemical
localization of OCT2 in the cochlea of various species. Laryngoscope. 2015;125(9):E320-5. doi:
10.1002/lary.25304. Epub 2015 Apr 17.
8. Hellberg V, Gahm C, Ehrsson H, Liu W, Rask-Andersen H, Laurell G. In response to letter to the
editor regarding "Immunohistochemical localization of OCT2 in the cochlea of various species". 2016
Feb 10. doi: 10.1002/lary.25879. [Epub ahead of print]