Några mikrobiella
provtagningstekniker
På säker grund för hållbar utveckling
Helena Branzén, Lennart Larsson
På säker grund för hållbar utveckling
Erfarenheter från pågående projekt
Presentationen baseras på pågående projekt:
• Pilottest av förstärkt självrening i Alingsås
Samverkansprojekt med Tvätteriet Alingsås och SGU
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
2
Upplägg
• Vad är mikroorganismer
• Vad kan analys av mikroorganismer användas till
• Vilka tekniker finns att provta mikroorganismer
– Vatten
– BioTraps
– Mesocosmer
• Hur analyseras mikroorganismer?
– qPCR - DNA contra RNA
– Vad visar svaret ?
• Exempel på analysresultat
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
3
Hur används mikroorganismer inom EBH ?
Mikroorganismer reducerar eller oxiderar molekyler för
energi och celluppbyggnad - metabolism
Mikroorganismer reducerar eller oxiderar molekyler utan
energinyttjande och celluppbyggnad - co-metabolism
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
4
Hur används mikroorganismer inom EBH ?
Genom att bryta molekylstrukturer (katabolism) kan de “låna”
elektroner och få energi (givarmolekylen oxideras)
Elektronerna tas om hand av mikroorganismernas enzym
som “mjölkar” dem på energi för att producera ATP
Elektronerna förs till en mottagare (elektronacceptor) som reduceras
(vilket är fallet vid reduktiv deklorering)
Enskilda enzym (organismens verktyg) sänker aktiveringsenergin för reaktionerna
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
5
Exempel på ämnen/ämnesgrupper som kan brytas
ned med hjälp av mikroorganismer
Alkaner (kolväten utan dubbelbindningar)
Bekämpningsmedel (DDT mm)
Ftalater
Nonylfenoler
Organiska explosivämnen, DNT
PAH
PCB
Petroleumkolväten (MTBE, BTEX, mm)
Klorerade alifater
Klorfenoler
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
6
Hur används mikroorganismer inom EBH?
• Det flesta finns på plats där föroreningen är
(kan övervakas eller förstärkas/biostimuleras)
• Kan tillföras för ett snabbare saneringsförlopp
(förstärkning/bioaugmentation)
• Tillämpas
– som putsningssteg
– på föroreningsplymer, evt också källområden
– på svåråtkomlig förorening
• Ett område under utveckling
• Ett möte mellan olika discipliner
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
7
Vad är mikroorganismer ?
• Eukaryoter
– Växter, djur, svampar, alger och protozoer
– Äter organogent material. Vissa andas syre, andra koldioxid
• Prokaryoter – saknar cellkärna
– Archaea och bakterier
– Prokaryoter kan även använda andra typer av näring och brett
spektrum av elektronacceptorer
Mikroorganismer i regel encellinga och bestående av de 4
makromolekylerna proteiner, nukleinsyror, lipider och polysackarider
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
8
Bild från föreläsningsmaterial, University of Vermont, annan originalkälla
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
9
Bild från föreläsningsmaterial, University of Vermont
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
10
Var finns mikroorganismerna i marken ?
Merparten av bakterierna sitter fästa till jordpartiklar
Aeroba bakterier ca 50 – 70 % av totala mikrobiella populationen
Anaeroba bakterier ca 10 %
Plus övrigt
Bakterier i jord: 106 – 108 kolonnienheter/gram TS (colony forming units – cfu)
men vanligt är: 104 till 107 cfu/g
Microbial Enumeration and laboratory-scale microcosm studies in assessing enhanced bioremediation potential
of petroleum, Schaffner, et. al. och referenser däri (Grunda, 1985 , Turco et al., 1995; Hazen et al., 1991)
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
11
Mikroorganismer vill gärna fästa till något
Celldelning på ett konstgjort material (sk Bio-Sep bead med aktivt kol)
från Microbial Insights, Inc.
Fotografi från informationsmaterial/ppt, Sublette et al. 2010
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
12
Några metoder för att provta mikroorganismer
• Grundvatten
• Konstgjorda provtagare för att ”locka” bakterier
• Jord
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
13
Grundvatten
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
14
Grundvatten
•
•
•
•
Enkelt
Konserveras och är lätt att transportera
Billig fältprovtagning
Ögonblickbild i punkten, men kanske
representativt för ett större område
• ”Resande” mikroorganismer
• Eftersom man även analyserar inaktiva och
döda mikroorganismer kan man kanske säga att
det ger mer än själva provtagningsögonblicket
• Låg detektionsgräns (lätt medium att analysera)
men innehållet, jfrt med jord, är också lägre
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
15
Konstgjorda provtagningsmedium –
ex Bio-Trap
Standard Bio-Trap från Microbial Insights, Inc
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
16
Konstgjorda provtagningsmedium –
ex Bio-Trap
• Patenterat innehåll av 3-4 mm kulor,
huvudsakligen bestående av aktivt kol (s.k. BioSep beads)
• Erbjuder en mycket stor och lockande yta för
bakterier att fästa vid (se bilden)
• Upphettade till 300°C för att rensa från
kontaminering
• Kan kombineras med olika sätt att stimulera
bakterietillväxt eller för att tillföra bakterier, s.k.
advanced Bio-Trap
•
Vi har hittat dem hos Microbial Insights, Inc. i USA men de säljs också
av Envirogene Ltd, Storbritannien
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
17
Bio-Trap
• Enkelt men är färskvara före uthängning
• Skall sitta ute mellan 30 och 90 dagar för att fullt
ut acklimatisera sig
• Ganska billig fältprovtagning (två resor)
• Kan inte konserveras och transport är tidskritisk
samt måste vara kyld
• Passiv provtagare som samlar information
under längre tid
• Kolonniserande mikroorganismer
• Låg detektionsgräns (förhållandevis lätt medium
att analysera) men innehållet, jfrt med jord, är
också lägre
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
18
Avancerad Bio-Trap
Avancerad Bio-Trap enhet, infomaterial från Microbial Insights, Inc.
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
19
Många möjligheter
Avancerad Bio-Trap enhet, infomaterial från Microbial Insights, Inc.
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
20
Mesocosmer
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
21
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
22
Mesocosmer
• Under utveckling (vi har hittat dem hos Bioclear BV i Holland
och Vito NV i Belgien)
• Ganska besvärlig installation, dyr
• Acklimatiseringstid trots att det är platsspecifik
jord
• Konserveras, transport är enkel
• Passiv provtagare som samlar information under
längre tid, speglar den verkliga miljö och
innehåller all befintlig ”historisk” mikrofauna
• Aktiva, inaktiva och döda mikroorganismer
• Hög detektionsgräns pga inhomogent medium
med störningar
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
23
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
24
Vad analyseras ?
• Huvudsaklig metod: qPCR kvantitativ polymerasteknik –
quantitative polymerase chain reaction
• Analys av dubbelkedjor DNA, eller enkelkedjor RNA
• DNA mer stabil, RNA bryts ned snabbare
• RNA är kopia av DNA och visar på aktiv celltillväxt
• DNA kan vara död
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
25
Vad analyseras ?
• Analys av bakteriegrupper, ex Dehalococcoides sp. eller
spp. med liknande egenskaper
• Eller analys av arten Dehalococcoides ethenes, som kan
bryta ned VC till eten
• Eller stammen med en enskild egenskap;
Dehalococcoides ethenes strain 195
• Analys av bakteriens ”verktyg” som sänker
aktiveringsenergi för enskilda reaktioner – enzym
(=funktionella gener, reductase)
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
26
Ex. reduktiv deklorering
Vi analyserar i princip de grupper som ansvarar för de olika
elektronacceptorernas omsättning, grovt sett
Geobacter (iron reducing bacteria)
Sulphate reduction genes, Desulfuromonas
Methyl coenzyme M reductase
Dehalobacter
Dehalococcoides
Trichloroethene reductive dehalogenase
Vinylchloride reductase
Fe(III) -> Fe(II)
(SO42- -> H2S)
(CO2 -> CH4)
(PCE, TCE)
(DCE, VC)
(TCE)
(VC)
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
27
Ex. på resultat från Bio-Trap
Resultat från Microbial Insights, Inc. , OBS celler/kula
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
28
Potential för reduktiv deklorering
Avser resultat från Microbial Insights, Inc. (CENSUS Dehalococcoides 16S rRNA gene, qDHC), OBS celler/ml
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
29
Tack för mig!
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
30
Namn på mikroorganismer
Namn på mikroorganismer brukar anges först med genusnamn och därefter med dess s.k. artepitet.
Exempelvis, för mikroorganismen Dehalococcoides ethenes, som kan brytas ned VC till eten, är
Dehalococcoides genusnamnet och ethenes artepitetet. Dessa två namn tillsammans motsvarar
organismens artnamn (Vetbact, 2013).
Det kan ibland vara svårt att fastställa/identifiera artepitetet. Om man funnit att en bakterie med
förbestämt genusnamn har en specifik egenskap, t.ex. utför reduktiv deklorering av TCE, men dess
artepitet inte klarlagts brukar man benämna denna Dehalococcoides sp. (sp. är en förkortning för
”species” och Dehalococcoides sp. betecknar ospecificerat Dehalococcoides).
Om flera olika Dehalococcoides, vars artepiteter inte är fastställda, har en gemensam egenskap, anges
dessa med spp. (t.ex. Dehalococcoides spp.).
Ibland anges att olika stammar av bakterier har vissa egenskaper. Stam är undergrupp i en art.
Exempelvis kan stammen Dehalococcoides ethenes strain 195 bryta ned VC till eten (Maymo-Gatell et
al., 1997).
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013
31
