Carl-Johan Andersson
Om jag gör hål på en cell och ingen ser det…går det ändå hål?
Ett verktyg som ofta används när funktioner och mekanismer hos celler ska undersökas är
membranpermeabilisering. Det innebär att konstgjorda hål eller kanaler görs i cellens
plasmamembran eller andra membranstrukturer inuti cellen. Syftet kan vara att en substans
ska kunna läcka in i cellen för att påverka den utan att orsaka dödliga skador på den. Det kan
också vara att forskare att något ska läcka ut från cellen för därigenom kunna undersöka något
i cellens inre. Metoderna för att permeabilisera celler kan vara mer eller mindre spektakulära.
Från användandet av en ”kanon” som skjuter hål på membran med små partiklar till kemiska
substanser som påverkar membranet på ett sådant sätt att hål bildas. En sådan kemisk
substans är alameticin som har sitt ursprung i en parasitisk svamp och som i svampen
fungerar som ett skydd mot bakterieangrepp. Alameticinets förmåga att göra hål i
cellmembran har människan tagit tillvara på och det är nu en substans som används
regelbundet i laboratorier för detta syfte.
Hittills har permeabiliseringen med alameticin påvisats genom att mäta substanser som läckt
ut från behandlade celler eller indirekta effekter av förlusten av dessa substanser. Målet med
den här undersökningen var att för första gången göra direkta observationer på
permeabiliserade celler av backtrav (Arabidopsis thaliana). Tanken var att låta
fluorescensmarkör som normalt inte kan passera cellmembran, passera genom de hål som
alameticin skapar. Ett fluorescerande ämne kan påvisas inuti cellen genom att belysa cellerna
med en viss specifik våglängd. Markören fluorescerar då med en annan specifik våglängd
som kan observeras och särskiljas. På så vis kan markören med stor säkerhet urskiljas och var
den finns i cellen syns tydligt i ett bra mikroskop. När jag gjorde detta och jämförde celler
som inte behandlats med alameticin var det tydligt att endast permeabiliserade celler färgats in
av markören. Jag kunde till och med visa att mitokondrierna var permeabiliserade eftersom
dessa lyste upp som små korn inuti cellen. Att det faktiskt var mitokondrier kunde jag visa
genom att använda en annan fluorescensmarkör. Denna markör kan passera cellmembranet
men färgar endast in mitokondrier. Detta gjorde att de två infärgningarna kunde jämföras med
varandra och på så vis bevisa att det faktiskt var mitokondrier. I undersökningen så visade sig
att alla celler i ett prov blev permeabiliserade. Det intressanta med det resultatet var att jag
kunde visa att denna permeabilisering fortskred olika i olika celler. Det var nämligen så att
det tog längre tid för fluorescensmarkören att läcka in i vissa celler än andra. Detta trots att
det inte fanns någon synbar skillnad mellan dem. Resultatet kan betyda att det tar längre tid
för alameticin att göra hål i vissa cellers plasmamembran än andras. Det kan också finnas en
möjlighet att det blir mycket färre hål i de ”långsamma” cellerna, så att färgämnet inte kan
tränga in lika snabbt. Vilket av dessa alternativ det faktiskt rör sig om fanns det tyvärr inte
möjlighet för mig att undersöka.
Tidigare har forskarna tittat på alla celler i ett prov som en helhet och inte tagit i beaktande att
cellerna reagerar individuellt på alameticinbehandlingen. Observationer pekar också på att
mitokondriernas struktur blir radikalt omgjord, men det finns även tecken på att andra
membranstrukturer genomgår omfattande förändringar i cellens inre. Det är viktigt att vidare
undersöka hur cellerna blir påverkade av permeabiliserinegn för att kunna ta hänsyn till detta
när alameticin skall användas i forskningen
Handledare: Allan Rasmusson, Mari Aidemark, Susanne Widell
Examensarbete 10 p i Molekylärbiologi Vt 2007,
Institutionen för cell- och organismbiologi, Lunds universitet
Carl-Johan Andersson
Fluorescence probes as markers for alamethicin permeabilisation in Arabidopsis
thaliana ecotype Colombia-0 and Arbidopsis thaliana ecotype Landsbergis
The membrane active peptide alamethicin (AlaM) has been shown to permeabilise cells and
isolated mitochondria from both mammals and plants. The aim of this study was to use the
fluorescent nucleic acid-markers propidium iodide and Yo-Pro-1 and the endocytic marker
FM4-64 for investigating AlaM permeabilisation of cell-cultures from two ecotypes of A.
thaliana. It was found that cells were homogenously permeabilised although there were
temporal differences within a cell culture. After AlaM permeabilisation, Yo-Pro-1 also
appeared in mitochondria, as seen using MitoTracker red as marker. AlaM treatment led to a
partial reorganisation of e.g. mitochondria and other membranous organelles into ring shaped
structures, which could not be fully interpreted in this investigation.
