F
-P
-2'
(12)
Patentskrift
(
10) SE 532 251 C2
0 Ltitkål ..-.ZWEI WIE 0
2
In
":./._
gal
ME
s>>
k,
,.,7
.--).5
-Cl\
v d . 5..")
S verige
(21) Patentansökningsnummer:
0602550-6
(45) Patent meddelat:
2009-11-24
2008-05-29
2006-11-28
(41) Ansökan allmänt tillgänglig:
(22) Patentansökan inkom:
(24) Löpdag:
2006-11-28
(83) Deposition av mikroorganism: —
(30) Prioritetsuppgifter: ---
(51) Internationell klass:
A61K 39/385 (2006.01)
A61K 38/19 (2006.01)
CO7K 14/52 (2006.01)
(73) Patenthavare: Theravac Pharmaceuticals AB, Vårdkasvägen 1, 756 55 Uppsala SE
(72) Uppfinnare:
Lars Hellman, Uppsala SE
(74) Ombud:
(54) Benämning: Nya formuleringar av TSLP för behandling av TH2-medierade inflammatoriska
sjukdomar genom vaccinering
(56) Anförda
publikationer: US 20050249712 Al • WO 2005007186 Al • US 20020193305 Al • Zagury D.
et al. Anti-cytokine Ab immune therapy: present status and perspectives. Drug
Discovery Today 2004, 9 (2): 72-81 • Barnes P.J. New therapies for asthma.
TRENDS in molecular medicine 2006, 12 (11): 515-520
(47) Sammandrag:
Uppfinningen relaterar till en formulering för behandlingen av TH2-medierade
inflammatoriska sjukdomar. Formuleringen består av ett vaccin innehållande TSLP
från en icke-human primat eller ett fragment därav för användande som ett vaccin för
behandling av människor med alltför kraftiga TH2-medierade inflammatoriska
tillstånd. För behandling av kraftiga TH2-medierade inflammatoriska tillstånd i andra
icke-humana däggdjur så används TSLP från den art som skall vaccineras som
anti gen.
532 25'l
Sammanfattning
Uppfinningen relaterar till en formulering för behandlingen av TH2-medierade
inflammatoriska sjukdomar. Formuleringen består av ett vaccin innehållande TSLP
från en icke-human primat eller ett fragment därav för användande som ett vaccin för
behandling av människor med alltför kraftiga TH2-medierade inflammatoriska
tillstånd. För behandling av kraftiga TH2-medierade inflammatoriska tillstånd i andra
icke-humana däggdjur så används TSLP från den art som skall vaccineras som
antigen.
532 251
1
Denna uppfinning relaterar till en metod utvecklad för att mildra symptomen eller
förhindra uppkomsten av olika TH2-medierade inflammatoriska sjukdomar genom att
sänka nivåerna av cytokinen TSLP (Thymic stromal lymphopoetin). Även om
uppfinningen generellt relaterar till ett vaccin för användning i människa, hund, katt
eller häst så kommer en mer generell beskrivning att ges men med referens till
antikroppar eller vaccin för användning i människa, katt, häst eller hund.
Bakgrund till uppfinningen
Under de senaste årtiondena har flera sjukdomar orsakade av överreaktioner av vårt
immunsystem kommit att bli de största utmaningarna för vår tids medicin. Ett sådant
områden är allergier. Allergier har i människa har under de senaste 20-30 åren nått
nära epidemiska nivåer och atopiska eller IgE-medierade allergier är här den
dominerande formen. Allergier är också ett stort problem för många av våra husdjur
som hundar, katter och hästar. Här är dock IgEs roll mindre väl dokumenterad.
Vanliga former av IgE-medierade allergier i människa är päls-, dammkvalster- och
insektsgifts-allergier samt hösnuva, astma och många födoämnesallergier. Många av
våra husdjur lider av allergier mot många av dessa eller liknande allergener. Allergier
har beräknats omfatta nästan 30% av befolkningen.
Allergier är orsakade av överreaktion av vårt immunsystem. Flera av de
cytokiner som reglerar en normal immunrespons mot olika patogener tycks också
delta i allergiska sjukdomstillstånd. Cytokiner eller tillväxt och
differentieringsfaktorer som är centrala för vårt immunsystems funktion kan därför
vara viktiga målmolekyler för terapeutisk intervention.
Svår atopisk dermatit i hund är ett av de större veterinärmedicinska problemen
av idag. Uppemot 50% av alla besök hos veterinär är orsakade av hudproblem hos
hunden och atopisk dermatit är här den absolut dominerande orsaken till dessa
problem. Vi har en liknande situation inom humanmedicinen. Här är det dock svår
atopisk astma som är problemet. För många av patienterna med svår astma finns idag
ingen behandling som uppvisar tillfredställande effekt. För vissa av de svårare fallen
av atopisk dermatit finns idag heller ingen tillfredställande behandling och som sista
utväg återstår då endast avlivning. Vi har här alltså ett stort behov inom medicin och
veterinärmedicin som ej kan mötas med existerande behandlingsformer.
Vi har under ett antal år arbetat med en potentiell behandlingsform för
behandling av IgE-medierade allergier i människa och husdjur, vaccination mot IgE
(1-5). Denna behandlingsstrategi har dock några viktiga begränsningar som t.ex i
fallet med atopisk dermatit i hund där IgE nivåerna är mycket höga (6). Denna
begränsning beror främst på en stark toleriserande effekt av de höga IgE-nivåerna i
hund. Dessutom så är det svårt att uppnå goda behandlingseffekter när det är så stora
mängder av målmolekylen som måste avlägsnas. Vi har därför insett att det kommer
att vara mycket svårt att nå vårt mål i hund genom att vaccinera mot IgE (6). Nya
innovativa strategier måste därför utvecklas. Vi presenterar här en möjlig lösning på
detta problem, vaccination mot en viktig tillväxtfaktor som reglerar humoral
immunitet thymic stromal lymphopoietin (TSLP).
TSLP (thymic stromal lymphopoietin) har besrivits som varande en **master
switch" i allergisk inflammation [7]. TSLP är en IL-7 liknande tillväxtfaktor som i
532 251
människa främst produceras av epiteliala celler och mastceller. Denna tillväxtfaktor
stimulerar myeloida dendritiska celler (mDC) att inducera differentiering av naiva
CD4 positiva T celler till effektorceller av TH2 typ [7]. Dessa TH2 celler producerar
sedan de allergi drivande tillväxtfaktorerna IL-4, IL-5, IL-13 och TNF-a, men inte IL10 och IFN-y [8]. Nya fynd indikerar också att TSLP aktiverade DCs spelar en viktig
roll inte enbart i induktionen av TH2 immunitet utan också i upprätthållande och
ytterligare polarisering av centrala minnesceller av TH2 typ under allergiska
sjukdomar [9]. Keratinocyter i den skadade vävnaden i atopisk dermatit har visats
uttrycka höga nivåer av TSLP, som kan vara en av de tillväxtfaktorer som spelar en
nyckelroll i utvecklandet av atopisk dermatit [8]. Möss genförändrade för att
överuttrycka TSLP i hud utvecklar in också atopisk dermatit och man ser en
dramatisk ökning i antalet cirkulerande TH2 celler och en ökning i serum IgE [10].
TSLP är dock inte enbart uttryckt i perifer vävnad utan även i den humana thymusen
i "Hassall' s corpuscles ". I Denna vävnad är TSLP inblandad i att instruera
dendritiska celler till att konvertera hög affinitets själv-reaktiva T-celler till
CD4+CD25+ FoxP3+ regulatoriska T celler. Den heterodimera TSLP receptorn tycks
vara uttryckt uteslutande på myeloda dendritiska celler (mDCs).
TSLP verkar vara en av de viktigaste reglerarea av TH2-medierad
inflammation och är därför en mycket intressant målmolekyl för terapeutisk
intervention [11]. Jag kommer här att beskriva en vaccinationsmetod som är ämnad
att nedreglera alltför kraftig TH2-medierad inflammation genom att rikta vaccinets
effekt mot TSLP. Detta vaccin kan komma att bli ett nytt viktigt steg i behandlingen
av svår astma i människa och atopisk dermatit i hund.
Vad som tidigare var känt inom fältet Trior Art".
Patentansökningar som beskriver användningen av monoklonala antikroppar eller
lösliga receptorer för att reducera aktiviteten av humant TSLP är inlämnade. Dessa
strategier för att målsöka TSLP är baserade på injektionen av högrenade
rekombinanta proteiner var annan till var fjärde vecka under resten av patientens liv.
Ett vaccin som beskrivs i denna patentansökan kan här komma att bli en avsevärd
förbättring över tidigare känd teknik (prior art) p.g.a. att den bygger på injektion av
rekombinanta proteiner i mycket mindre mängd, kanske så lite som en 10 000 del av
vad som behövs vid behandling med monoklonala antikroppar eller lösliga receptorer.
Ett vaccin kommer troligtvis även att behöva administreras 2-4 gånger om året i
jämförelse med de mycket mer frekventa administreringarna av monoklonaler och
lösliga receptorer som beskrivits här ovan. Användandet av sekvensen från en ickehuman primat kan också leda till att immunogeniciteten ökar för vaccinet i människa.
För andra applikationer än vaccin måste det icke modifierad TSLP användas (det
humana proteinet) för att inte ge upphov till en immunreaktion mot proteinet vilket
skulle avsevärt minska effekten av det injicerade rekombinanta proteinet.
Uppfinningens mål
Målet med uppfinningen är att kunna erbjuda en lätt och kostnadseffektiv metod för
behandling av olika inflammatoriska sjukdomar orsakade av överdriven TH2medierad. Vaccination med ett fusionsprotein bestående av TSLP (eller delar av
denna cytokin) och ett främmande bärarprotein för att minska nivåerna av fritt TSLP
532 251
och därmed mildra symptomen som orsakats av förhöjd frisättning av denna
tillväxtfaktor.
Sammanfattning av uppfinningen
Målet som beskrivits ovan uppnås enligt uppfinningen med hjälp av ett vaccin som
karaktäriseras av att det innehåller hela aminosyrasekvensen eller segment större än 5
aminosyror av TSLP från en icke-human primat (om den skall användas för
människa) i dess ursprungliga eller multimeriserade form. Vid behandling av
domesticerade djur används istället TSLP sekvensen från det djur som skall behandlas
Proteinet kan kopplas till ett eller flera bärarprotein och kan även innehålla ett
adjuvans. Den TSLP molekyl som används som vaccinantigen kan alternativt vara
muterad med en eller flera punktmutationer som förhindrar dess bindning till sin
receptor. Proteinet kommer då inte att ha TSLP aktivitet men fortfarande behålla sin
förmåga att inducera antikroppar som också reagerar med nativt aktivt TSLP.
Kortfattad beskrivning av figurerna
Figur 1 visar nukleotid och den motsvarande aminosyra sekvensen för schimpansens
TSLP.
Beskrivning av uppfinningen
Anti-TSLP antikroppar produceras i patienten genom aktiv immunisering, vilket även
kallas vaccination. Genom att injicera en modifierad TSLP molekyl så börjar
patientens immunsystem att producera ett polyklonalt antikroppssvar riktad mot dess
eget TSLP och reducerar därmed effekterna av en för kraftig TSLP produktion. Det
är av största vikt att modifiera antigenet så att patientens immunsystem uppfattar
vaccinantigenet som ett främmande protein. Detta kan åstadkommas genom kovalent
koppling av ett främmande (icke själv) protein eller del av protein till hela eller delar
av TSLP från den art som skall behandlas. Peptidregioner inom det främmande, icke
kroppsegna proteinet drar då till sig och aktiverar icke toleriserade T celler som kan
ge hjälp till potentiellt autoreaktiva B-celler.
Det finns minst fyra olika sätt att göra denna modifiering av självproteinet. En
metod är att producera vaccinantigenet som ett fusionsprotein mellan ett främmande
protein och hela eller en utvald del på mer än 5 aminosyror i längd av själv-TSLP i ett
prokaryot eller eukaryot expressions system. Den öppna läsramen för TSLP, t.ex.
hund eller schimpans TSLP som kan ses i figur 1 klonas först in i bakteriell, svamp
eller eukaryot fusionsproteinvektor. Denna vektorkonstruktion transfekteras sedan in i
en eukaryot eller prokaryot värdcell (beroende på vald vektor) för produktion av det
önskade fusionsproteinet. Denna fusionspartner kan här vara vilket för kroppen
främmande protein som helst av en storlek från 10 aminosyror till flera hundra kD.
Det är dock vanligen bäst att använda en fusionspartner av liknande storlek som
självproteinet.
Alternativt kan en immunodominant peptid sättas in i den valda TSLP
sekvensen vilket resulterar i ett fusionsprotein med själv TSLP sekvenser på båda
sidor om den främmande peptiden.
Som ett tredje alternativ kan det icke modifierade TSLP produceras i en
eukaryots eller prokaryot värd eller värdcell och sedan kovalent kopplas till ett
bärarprotein genom kemisk koppling.
532 251
/1
1
Det fjärde alternativet som i vår mening är mindre fördelaktigt är att producera
en utvald del av TSLPs aminosyrasekvens som en syntetisk peptid och sedan koppla
denna peptid till ett främmande bärarprotein genom kemisk koppling. Detta alternativ
resulterar normalt, efter injektion i patienten, i antikroppssvar som uppvisar låg
bindningsaktivitet mot nativt rätt veckat protein vilket därmed ger sämre klinisk
effekt.
Efter produktion av vaccinantigenet skall det sedan testas för pyrogeninnehåll
och möjligt innehåll av andra kontaminerande ämnen. För att erhålla ett tillräckligt
starkt immunsvar mot självproteinet kan det blandas med en immunstimulerande
substans, ett adjuvans före injektion i patienten. Efter injektion i patienten induceras
vaccinet ett immunsvar mot vaccinantigenet. På grund av närvaron av självepitoper i
vaccinantigenet så inducerar detta protein ett antikroppssvar mot denna målmolekyl, i
detta fall TSLP, vilket leder till en sänkning av nivåerna av detta protein i patienten.
Referenser
[1]
Hellman L. Profound reduction in allergen sensitivity following treatment with
a novel allergy vaccine. Eur J Immunol 1994;24(2):415-20.
[2]
Hellman L. Is vaccination against IgE possible? Adv Exp Med Biol
1996;409:337-42.
[3]
Hellman L, Carlsson M. Allergy vaccines: A review of developments. Clin
Immunotherapeutics 1996;6(2):130-42.
[4]
Hellman L. Vaccines against allergies. In: Perlmann P, Wigzell H, editors.
Handbook of Experimental Pharmacology, Vo1133, Vaccines. Berlin, SpringerVerlag, 1999: 499-526.
[5]
Vernersson M, Ledin A, Johansson J, Hellman L. Generation of therapeutic
antibody responses against IgE through vaccination. Faseb J 2002;16(8):875-7.
[6]
Ledin A, Bergvall K, Salmon-Hillbertz N, Hansson H, Andersson G,
Hedhammar Å, et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in
dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine 2006;24,
66-74.
[7]
Liu YJ. Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic
inflammation. J Exp Med 2006;203(2):269-73.
[8]
Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, Yuan W, Edward G, Homey B, et al.
Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by
producing TSLP. Nat Immunol 2002;3(7):673-80.
[9]
Wang YH, Ito T, Wang YH, Homey B, Watanabe N, Martin R, et al.
Maintenance and polarization of human TH2 central memory T cells by thymic
stromal lymphopoietin-activated dendritic cells. Immunity 2006;24(6):827-38.
[10] Yoo J, Omori M, Gyarmati D, Zhou B, Aye T, Brewer A, et al. Spontaneous
atopic dermatitis in mice expressing an inducible thymic stromal lymphopoietin
transgene specifically in the skin. J Exp Med 2005;202(4):541-9.
[11] Huston DP, Liu YJ. Thymic stromal lymphopoietin:a potential therapeutic
target for allergy and asthma. Curr Allergy Asthma Rep 2006;6(5):372-6.
532 251
Patentkrav
1. Vaccin innehållande TSLP eller ett fragment därav i dess ursprungliga eller
multimeriserade form kopplad till en icke kroppsegen bärarmolekyl som
företrädesvis administreras tillsammans med ett farmakologiskt accepterbart
adjuvant.
2. Vaccin enligt patentkrav 1 där TSLP är från en icke human primat, hund, katt
eller häst.
3. Vaccin mot TSLP enligt patentkrav 1 och 2 för behandling av allergi, astma
och andra inflammatoriska tillstånd.
4. Användning av ett fusionsprotein innehållande hela eller delar av TSLP från
den art som skall behandlas (eller en nära besläktad art) kopplat till ett
främmande bärarprotein för framställning av ett vaccin för behandling av
allergi, astma eller andra inflammatoriska tillstånd.
532 251
Figur 1.
Schimpans TSLP cDNA
ATGTTCCCTTTTGCCTTACTATATGTTCTGTCAGTTTCTTTCAGGAAAATCTT
CATCTTACAACTTGTAGGGCTGGTGTTAACTTACGACTTCACTAACTGTGACT
TTGAGAAGATTAAAGCAGCCTATCTCAGTACTATTTCTAAAGACCTGATTACA
TATATGAGTGGGACCAAAAGTACCGAGTTCAACAACACCGTCTCTTGTAGCAA
TCGGCCACATTGCCTTACTGAAATCCAGAGCCTAACCTTCAATCCCACCGCCG
GCTGCGCGTCGCTCGCCAAAGAAATGTTCGCCATGAAAACTAAGGCTGCCT TA
ACTATCTGGTGCCCAGGCTATTCGGAAACTCAGATAAATGCTACTCAGGCAAT
GAAGAAGAGGAGAAAAAGGAAAGTCACAACCAATAAATGTCTGGAACAAGTGT
CACAATTACAAGGATTGTGGCGTCGCTTCAATCGACCTTTACTGAAACAACAG
TAAACCATCTTTATTATGGTCATATTTCACAGCACCAAAATAAATCATCTTTA
TTAAGTAGATGAAACATTAACTCTAACTGTGACAAAGAAGACCACAGATAGTT
ATCTTTTAATTACAGAAGAGTTTCTTAACTTATTTTTGTAAGTTTTTATTGTG
TAAGTTTATAATGCAGGGGAAGTACTACTCCTCAAATGTTGAGGGAAGCTTCC
ATAACATCGATGACTGACTTCATGGCAGTAATTCTCAGCTGTAGTTGCATAAG
CATTGCTCAAGAGGAAAATCCAAAAGTGCAGCAGG
(kodande regionen av accession no XM_001141816)
Aminosyrasekvensen
MFPFALLYVLSVSERKIFILQLVGLVLTYDETNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYmSG
TKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALTIWCPGYS
ETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ
