En genetisk studie
av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4
hos personer med kärlinflammationer
och höga halter immunkomplex
HEBA
CHARANEK
Examensarbete
Stockholm, Sverige 2006
En genetisk studie
av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4
hos personer med kärlinflammationer
och höga halter immunkomplex
HEBA
CHARANEK
Examensarbete i biomedicinsk teknik om 20 poäng
vid Programmet för datateknik
Kungliga Tekniska Högskolan år 2006
Handledare på CSC var Jeanette Hellgren Kotaleski
Examinator var Anders Lansner
TRITA-CSC-E 2006:101
ISRN-KTH/CSC/E--06/101--SE
ISSN-1653-5715
Kungliga tekniska högskolan
Skolan för datavetenskap och kommunikation
KTH CSC
100 44 Stockholm
URL: www.csc.kth.se
En genetisk studie av TNF-alfa, IL-1-beta och
CTLA-4, hos personer med kärlinflammationer
och höga halter immunkomplex.
Sammanfattning
Åderförkalkning och dess komplikationer är den dominerande orsaken till sjukdom, lidande och
död i västvärlden. Det finns nu många indikationer på att inte bara traditionella riskfaktorer
såsom rökning och fetma bidrar till utvecklingen av kärlinflammationer utan även
immunologiska mekanismer spelar en stor roll för utvecklandet av kärlskadan. Cirkulerande
immunkomplex (CIC) är en stark prediktor för att utveckla åderförkalkning.
Då ett immunkomplex (IC) fäster vid kärlväggen interagerar immunsystemets celler med
cellerna i kärlväggen och avger bl.a. proinflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta.
Vissa genetiska varianter av cytokinerna medför högre sekretion av dessa. Vid åderförkalkning
vet man att TNF-alfa och IL-1-beta har stor betydelse för att mediera inflammation i
kärlväggen. Polymorfismen i cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta samt receptorn CTLA-4 har
visat sig vara kopplat till vissa sjukdomar såsom t.ex. muskelsjukdomen Myastenia Gravis
(MG).
Syftet med denna rapport har varit att vidare undersöka om polymorfismen i cytokinerna samt
receptorn har någon association till kärlinflammationer och förekomsten av IC. Undersökningen
är gjord på genomiskt DNA av 72 patienter med kärlinflammationer och höga halter IC.
Polymorfismen som studerats är IL-1-beta RFLP TaqI, TNF-alfa −308 och CTLA-4 −318. Detta
gjordes genom amplifiering av de aktuella DNA-sekvenserna med PCR (Polymeras Kedje
Reaktion). PCR-fragmenten analyserades sedan med hjälp av gel elektrofores efter klyvning
med restriktionsenzymer.
Analyserna av A/G-polymorfismen hos TNF-alfa gav väntade resultat. Den ovanliga A-allelen
hos friska personer som är förknippad med hög TNF-alfa sekretion förekom i ökad prevalens
hos patientgruppen. Även analyser hos IL-1-beta gav väntade resultat där den ovanliga A2allelen som är förknippad med hög IL-1-beta sekretion förekom i ökad prevalens hos
patientgruppen. Det förekommer alltså polymorfier i TNF-alfa och IL-1-beta generna som
bidrar till denna höga sekretion och därmed utvecklingen av kärlinflammationer. Från CTLA-4
analyserna däremot kunde jag inte se någon signifikant skillnad av allel/genotyp frekvenser hos
sjuka och friska personer och kan således inte förknippa polymorfismen i denna gen med
utvecklingen av kärlinflammationer och förekomsten av höga halter IC.
A genetic study of TNF-alfa, IL-1-beta and CTLA4, in people with vascular inflammations and
high concentrations of immune complexes.
Abstract
Atherosclerosis and its complications is the dominant cause of diseases, suffering and death in
the Westernized countries. There are now many indications that not only traditional risk factors
as smoking and corpulence contribute to the development of vascular inflammations but also
immune mechanisms play a big role for the development of the vascular lesion. Circulating
immune complexes (CIC) is a big predictor of developing atherosclerosis.
When an immune complex (IC) attaches the vessel wall the cells of the immune systems will
interact with the cells in the vessel wall and proinflammatory cytokines will be released. Some
genetic variants of the cytokines are associated with higher secretions of those. Its known that
TNF-alfa and IL-1-beta plays a big role in mediating inflammation in the vessel wall.
Polymorphisms in some cytokines, for instance TNF-alfa and IL-1-beta and also in the receptor
CTLA-4, have been shown to be connected with diseases as for example myasthenia gravis
(MG).
The aim of this project was to further investigate whether the polymorphism of these cytokines
and the receptor is associated with vascular inflammations and occurrences of IC. The
investigation was performed on genomic DNA from 72 patients with vascular inflammation and
high IC concentrations. The polymorphism studied was IL-1-beta RFLP TaqI, TNF-alfa −308
and CTLA-4 −318. This was done by amplification of DNA-sequences with PCR (Polymerase
Chain Reaction). The PCR-fragment were then analyzed using gel electrophoresis after
digestion with restriction enzymes.
The results of the analysis of the A/G polymorphism in TNF-alfa were as expected. The rare Aallele in healthy individuals, which is associated with high TNF-alfa secretion, appeared in
higher prevalence in the patient group. Even analysis of IL-1-beta gave expected results where
the rare A2-allele, which is associated with high IL-1-beta secretion, appeared in higher
prevalence in the patient group. That indicates that there are polymorphisms in the TNF-alfa and
IL-1-beta genes that contribute to those higher secretions and also the development of vascular
inflammations. From the CTLA-4 analysis I couldn’t see any significant difference of the
allele/genotype frequencies between sick and healthy individuals. Therefore there is no
correlation between the polymorphism of this gene and the development of vascular
inflammations and high IC concentrations.
Förord
Jag avslutade mina två sista år på KTH med att läsa kurser i biomedicinsk teknik. De flesta
kurser gavs på Karolinska Institutet. I samband med medicin kurserna blev jag alltmer
intresserad av hur människokroppen fungerar. Att göra examensarbetet på Karolinska sjukhuset
gav mig möjligheten att fördjupa mina medicinkunskaper och därmed kombinera för mig två
intressanta områden, datateknik och medicin.
Efter att ha tagit kontakt med professor Ann Kari Lefvert som forskar om autoimmuna
sjukdomar i centrum för Molekylär Medicin vid Karolinska sjukhuset, erbjöds jag att studera
och skriva om huruvida polymorfismen hos TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 generna har
någon inverkan på utvecklingen av kärlinflammationer och höga halter IC. Detta arbete har
utgjort en del av flera tidigare undersökningar av samma gener men hos andra grupper av
patienter.
Jag vill rikta ett stort tack till professor Ann kari Lefvert som varit min uppdragsgivare för detta
projekt och som under arbetets gång varit ett stort stöd samt bidragit med intressanta och
lärogivande diskussioner. Jag vill även tacka forskarstuderande Xiaoyan Zhao för smarta råd
under laborationsarbetet. Vidare vill jag tacka forskarstuderande Maria Kakoulidou för goda
kommentarer under rapportskrivningen.
Innehållsförteckning
1 Introduktion............................................................................................................................... 1
2 Bakgrund................................................................................................................................... 3
2.1 Åderförkalkning och cirkulerande immunkomplex (CIC).................................................. 3
2.2 Sjukdomar orsakade av immunkomplex ............................................................................. 3
3 Teori .......................................................................................................................................... 4
3.1 Immunsystemet ................................................................................................................... 4
3.1.1 Komplementsystemet................................................................................................. 4
3.1.2 Fagocytos ................................................................................................................... 4
3.1.3 Komplementsystemet och CIC .................................................................................. 5
3.1.4 Cytokiner ................................................................................................................... 5
3.1.5 IC och inflammation .................................................................................................. 5
3.2 Genetik ................................................................................................................................ 6
3.2.1 DNA-molekylen......................................................................................................... 6
3.2.2 RFLP och SNP........................................................................................................... 6
3.2.3 Genetiska begrepp...................................................................................................... 6
3.2.4 Polymorfism .............................................................................................................. 7
3.2.5 Kromosomstrukturen ................................................................................................. 7
3.2.6 MHC-gener och HLA-komplex................................................................................. 8
4 Material och metoder ................................................................................................................ 9
4.1 PCR − Polymeras Chain Reaction ...................................................................................... 9
4.2 Gel Elektrofores ................................................................................................................ 11
4.3 Klyvning med restriktionsenzymer ................................................................................... 12
4.4 Utförande .......................................................................................................................... 12
4.4.1 TNF-α−308 (G→A) ................................................................................................ 13
4.4.2 IL-1β RFLP TaqI .................................................................................................... 13
4.4.3 CTLA-4 −318 (C→T).............................................................................................. 13
4.5 Statistiska analyser ............................................................................................................ 13
5 Resultat.................................................................................................................................... 15
5.1 RFLP och SNP analyser.................................................................................................... 15
5.1.1 TNF-α−308 (G→A) ................................................................................................ 15
5.1.2 IL-1β RFLP TaqI .................................................................................................... 16
5.1.3 CTLA-4−318 (C→T)............................................................................................... 18
6 Diskussion............................................................................................................................... 20
Referenser ................................................................................................................................... 21
1 Introduktion
Åderförkalkning, ateroskleros och dess komplikationer är den dominerande orsaken till
sjukdom, lidande och död i västvärlden. Det finns nu många indikationer på att immunologiska
mekanismer spelar en stor roll för utvecklandet av kärlskadan. En studie som gjorts visar att
förekomsten av cirkulerande immunkomplex, CIC, är en stark prediktor för att utveckla
åderförkalkning och dess komplikation hjärtinfarkt [9].
Vid åderförkalkning inflammeras artärernas väggar, kärlets celler prolifererar och så
småningom inlagras kalk i kärlväggen. Artärväggarna minskar i diameter, vilket leder till ett
reducerat blodflöde och därmed mindre syretillförsel. Vid minskad syretillförsel till
hjärtmuskeln och hjärnan kan en hjärtattack respektive slaganfall inträffa.
En aktiv immunreaktion med ökad förekomst av immunologiskt aktiva celler och antikroppar
kan påvisas i den skadade kärlväggen vid ateroskleros. Orsaken till denna immunreaktion är inte
fullständigt känd. Flera olika ämnen har föreslagits kunna ligga bakom. Ämnen som
inflammatoriska cytokiner, TNF-alfa och IL-1-beta har stor betydelse[9].
Då ett IC fäster vid kärlväggen interagerar immunsystemets celler med cellerna i kärlväggen
och avger bl.a. pro-inflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta. TNF-alfa och IL-1beta är ämnen som är viktiga vid inflammationer och som aktiverar T-celler, som i sin tur
aktiverar B-celler, vilka producerar antikroppar. Normalt råder balans mellan proinflammatoriska och anti-inflammatoriska cytokiner. Vissa genetiska varianter av proinflammatoriska cytokiner medför högre sekretion av dessa. Vid åderförkalkning vet man att
TNF-alfa och IL-1-beta har stor betydelse för att mediera inflammation i kärlväggen [10].
Andra faktorer än cytokiner är viktiga för immunsystemet och ett sådant är den cytotoxiska Tlymfocyt associerade receptorn 4 (CTLA-4). Denna receptor uttrycks på aktiverade T-celler
och är en hämmare av T-cellsaktivering. CTLA-4 fungerar nedreglerande på immunförsvaret,
genom att T-cellernas aktivering hindras och även genom att färre antikroppar produceras. Ökad
funktion av CTLA-4 fungerar antiinflammatoriskt [11].
Man har inga teorier om huruvida CTLA-4 bidrar till utvecklingen av kärlinflammationer och
förekomsten av immunkomplex, IC. Det enda jag utgår ifrån vid undersökningen av denna
receptor är att det i en studie gjord på Myastenia Gravis (en sjukdom som yttrar sig i svår
muskelsvaghet där överföringen av nervimpulser till muskulaturen påverkas) patienter förekom
genetiska varianter av CTLA-4 som minskar dess funktion, vilket innebär en bristande hämning
av T-cellsaktiveringen och därmed ett mera aktivt immunsvar. Dessa varianter av CTLA-4
fungerar proinflammatoriskt [11].
Syftet med denna rapport är att undersöka om polymorfier i generna för TNF-alfa, IL-1-beta och
CTLA-4 är associerade till kärlinflammationer och förekomsten av IC. Dessa polymorfier ger
upphov till s.k. RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) hos IL-1-beta och SNPs
(Single Nucleotide Polymorphism) hos TNF-alfa och CTLA-4. Genom att använda PCR
(Polymeras Chain Reaction) har jag analyserat dessa RFLPs och SNPs för att se om det
förekommer specifika genetiska varianter av TNF-alfa och IL-1-beta hos personer med
kärlinflammationer som kan vara den bakomliggande orsaken till den höga sekretionen. En
förhoppning är att man på sikt ska kunna utveckla läkemedel som riktar sig till att normalisera
mängden cytokiner och därmed minska inflammationen. Genom analys av den SNP som finns i
CTLA-4 genen undersöker jag om det förekommer en övervikt av varianter för CTLA-4 som
minskar dess funktion.
Tidigare har studier av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 gjorts för patienter med andra
sjukdomar där immunmekanismer och cytokinerna spelar roll [2]. Exempel är sjukdomar som
Myastenia Gravis och Reumatoid Artrit (en sjukdom som kännetecknas av kronisk
ledinflammation). Här har man funnit genetiska varianter av cytokinerna som medför hög
sekretion av dessa. Hos CTLA-4 har man funnit varianter som minskar dess funktion.
1
TNF-alfa genen innehåller en SNP på plats −308 i promotor regionen, som är associerad med
hög eller låg sekretion av detta cytokin. Genen finns inom klass III-regionen hos MHC på
kromosom 6. Denna SNP består av en A/G polymorfism där förekomsten av den ovanliga Aallelen istället för G-allelen, är associerad med högre sekretion av TNF-alfa. Detta har visats
bl.a. hos patienter med Myastenia Gravis [2]. Jag kommer nu att undersöka om denna allel även
förekommer i hög grad hos personer med kärlinflammationer och IC. Detta kommer sedan att
jämföras med friska personer. Jag kommer även att studera genotypfrekvenserna och jämföra
dessa med friska personer.
IL-1-beta genen finns på kromosom 2. Hos IL-1-beta genen har man funnit många polymorfier
som har associerats med högre sekretion av detta cytokin. En polymorfi i exon 5, en TaqI RFLP
är av stort intresse. A2-allelen är associerad med högre produktion av IL-1-beta, vilket har
visats i en studie som gjorts på Myastenia Gravis patienter [5].
På plats −318 i promotor regionen av CTLA-4 genen på kromosom 2 finns en SNP. Hos denna
C/T polymorfism är förekomsten av T-allelen associerad med ökad transkription och därmed
ökat uttryck av CTLA-4. C-allelen däremot har varit förknippad med minskad funktion av
CTLA-4 [11].
2
2 Bakgrund
2.1 Åderförkalkning och cirkulerande
immunkomplex (CIC)
Åderförkalkning är den vanliga orsaken till hjärtkärlsjukdomar som hjärtinfarkt och slaganfall
(stroke). Dessa sjukdomar utgör den största gruppen dödliga sjukdomar i vårt land och svarar
för bortåt hälften av alla dödsfall. Traditionella riskfaktorer är rökning och fetma.
Immunsystemet spelar också stor roll vid utveckling av åderförkalkning.
Skadan på kärlen kännetecknas av inflammation och av närvaro av immunsystemets celler. CIC
har en kraftig kärlskadande effekt [12]. Normalt elimineras immunkomplex (IC) snabbt med
hjälp av komplementsystemet. Konstant och hög förekomst av CIC är alltid patologiskt. IC som
inte elimineras på normalt sätt kan bindas till kärlväggens endotelceller och aktivera
komplement. Pro-inflammatoriska cytokiner TNF-alfa och IL-1-beta frisätts. Konsekvensen blir
en inflammatorisk kärlskada [12].
2.2 Sjukdomar orsakade av immunkomplex
IC bildas normalt om kroppen utsätts för ett kroppsfrämmande antigen. Komplexet består av ett
antal antigenmolekyler som bundits till en antikropp. Vissa antikroppar kan binda många
antigenmolekyler, vilket kan leda till att komplexen kan bli mycket stora. Bildningen av IC
underlättar fagocytos och är därmed ett sätt att oskadliggöra antigen. Konstant förekomst av
CIC är dock patologiskt. Detta beror antingen på överproduktion av komplex eller på nedsatt
nedbrytning. Nedsatt nedbrytning beror vanligen på ett defekt komplementsystem eller på ett för
lågt antal komplementreceptorer. Dessa receptorer binder normalt komplementfaktorer plus
komplex och transporterar detta till ställen i kroppen där komplexen förstörs genom fagocytos.
IC som inte fagocyteras på normalt sätt binds till kärlväggarnas endotelceller där de aktiverar
komplement. Pro-inflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta genereras [3].
3
3 Teori
Här behandlas bakomliggande teori om immunsystemet för att ge en förståelse av kopplingen
mellan IC och proinflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta samt den del av
genetiken som är intressant i detta projekt.
3.1 Immunsystemet
Främmande ämnen, som bakterier och virus, försöker ständigt att tränga in i människans
kropp. Kroppens immunförsvar hindrar sådana organismer från att etablera sig.
Immunförsvarets celler finns i alla vävnader i kroppen och det tar därför aldrig lång tid innan
ett främmande ämne möter immunsystemets celler. Antikroppar produceras av B-celler som
aktiveras av T-celler. Då ett främmande ämne, s.k. antigen, interagerar med en antikropp bildas
ett antigen-antikropp komplex, ett s.k. immunkomplex, IC. Bildandet av ett IC utgör en effektiv
mekanism i immunförsvaret för att eliminera antigenet.
3.1.1 Komplementsystemet
Främmande ämnen förintas av en grupp serumproteiner, kallade komplementfaktorer, som
startar en kaskadreaktion då en komplementfaktor aktiverats. Det finns två olika reaktionskedjor
som kan aktivera komplementsystemet. De kallas den klassiska respektive alternativa vägen.
Bägge leder till att en komponent i komplementsystemet som heter C3b binder till ytan på det
som aktiverat komplementsystemet. IC och bakterier som bundit C3b äts mycket lättare upp av
olika fagocyter eftersom dessa har receptorer som kan binda till C3b.
Den klassiska vägen för komplementaktivering startas framför allt av IC. Komplementfaktorn
C1 binder normalt till en inhibitor C1i. Då IC dyker upp i närheten släpper C1 sin inhibitor och
binder istället till Fc-delen av antikroppar i immunkomplexet. Proteaser aktiveras som börjar
klyva varandra och så småningom aktiveras nästa komplementfaktor i kaskaden, nämligen C4.
Då bildas C4a och C4b. C4b binder till nästa komplementfaktor, kallad C2. Proteasen C4b-C2
bildas, som klyver C3 i dels C3a och C3b.
Om C3b binder till ett cellmembran kommer ytterligare en väg, den lytiska vägen, att aktiveras.
Den börjar med att ytterligare en komponent, C5, binder till C3b på cellytan. C5 klyvs i C5a,
som lämnar cellytan, och C5b som sitter kvar.
Komplementsystemet fortsätter i att flera komplementproteiner (C6-C9) aktiveras och klyvs i
olika fragment. Under dessa reaktioner har ett antal komplementproteiner, C4a, C3a och C5a
frisatts. Dessa utgör signalämnen som sänder olika meddelanden till omgivningarna.
Exempelvis signalerar C5a och C3a till neutrofiler och makrofager att växa samman med
kärlendotelceller och vandra till ställen i vävnader där komplementaktivering förekommer (s.k.
kemotaxis). Detta spelar en stor roll vid inflammationer[3].
3.1.2 Fagocytos
En grupp vita blodkroppar, fagocyter, bryter ned ett främmande ämne som bundit till
antikroppar genom att först innesluta hela komplexet i sig själv. Processen kallas fagocytos. Till
fagocyter räknas makrofager, monocyter, neotrofiler och eosinofiler. Fagocyter har dels Fcreceptorer på sin yta som känner igen konstanta delen av antikroppen IgG och dels
komplementreceptorer som känner igen C3b-fragmenten på antigen. Komplementreceptorer
märker in bakterier och andra antigen som aldrig bundits till antikroppar med C3b-fragment.
Bakterier kommer på så sätt att brytas ned lättare av fagocyter eftersom dessa har receptorer
som känner igen C3b[3].
4
3.1.3 Komplementsystemet och CIC
Att ett IC triggar komplementsystemet är nödvändigt för att hålla kroppsvätskorna fria från CIC.
Fagocytosen underlättas genom att C3b-fragment binder till ytan av IC. Detta förhindrar IC att
deponeras i vävnader och således förhindra att immunkomplexen binds till kärlväggarnas
endotelceller för att så småningom orsaka inflammation. Immunkomplexmedierad aktivering av
komplementsystemet kan dock vara skadligt. Under komplementsystemets kaskad av reaktioner
bildas klyvningsprodukterna C3a, C4a och C5a, s.k. anaphylatoxiner, som kan agera som
inflammatoriska mediatorer [3].
Den effektiva elimineringen av CIC är beroende av att den klassiska vägen i
komplementsystemet fungerar intakt. Personer med totala eller partiella komplementdefekter är
särskilt disponerade för immunkomplexbildning och immunkomplexmedierade sjukdomar
p.g.a. att deras förmåga att eliminera IC är nedsatt [6].
3.1.4 Cytokiner
Cytokiner fungerar som budbärare mellan immunsystemets olika celler och signalerar till att
sätta igång eller stoppa processer. Immunförsvaret bekämpar allt som uppfattas som främmande
bland annat genom att utsöndra cytokiner. Vissa cytokiner är proinflammatoriska och kan ge
upphov till kraftiga inflammationer som kan eliminera såväl bakterier som virus[3].
3.1.5 IC och inflammation
IC som inte fagocyteras på normalt sätt binds till kärlväggarnas endotelceller där de aktiverar
komplementsystemet. Anaphylatoxinerna C3a, C4a och C5a genereras. C5a fungerar som
kemotaxin genom att den får monocyter att vandra till det inflammerade området. Monocyterna
stimuleras till att frisätta cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta. Dessa inducerar i sin tur
frisättningen av adhesionsmolekyler, s.k. VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), som får
monocyterna att fastna i endotelcellslagret. De ökar även invandringen av monocyter till det
inflammerade området. Monocyterna penetrerar artärväggem och hamnar i intimat. Här
omvandlas monocyterna till makrofager. Kolesterol inlagras i makrofagerna och man får
skumceller. Skumcellerna kommer i sin tur frisätta ytterligare pro-inflammatoriska cytokiner
som förstärker inflammationen genom ytterligare ackumulering av makrofager på
inflammationssidan [10], se figur 1.
Figur 1: Monocyternas väg till intimat. Här omvandlas monocyterna till makrofager och blir till
skumceller som frisätter proinflammatoriska cytokiner[10].
5
3.2 Genetik
Alla levande organismer är uppbyggda av celler. Varje cell har en uppsättning arvsanlag. För
att alla de komplicerade processer som sker i en levande varelse skall kunna utföras krävs ett
stort antal olika proteiner med olika funktioner. För vart och ett av alla de proteiner som finns i
en levande varelse finns en beskrivning som talar om hur proteinet ska se ut. Denna beskrivning
anger sekvensen av aminosyror och kallas för våra arvsanlag. Dessa ligger lagrade i stora
DNA-molekyler.
3.2.1 DNA-molekylen
DNA-molekylen är uppbyggd av mindre byggstenar, deoxyribonukleotider, s.k. baser. Det finns
fyra olika baser, adenin A, tymin T, guanin G och cytosin C. Det är sekvensen, ordningsföljden,
av dessa baser som bestämmer den genetiska koden, som i sin tur styr bildandet av ett protein. A
binder alltid till T medan G alltid binder till C. Denna bindning kallas basparning. DNAmolekylen är uppbyggd av två strängar i motsatt riktning (5’ till 3’) som är komplementära till
varandra förutsatt att sekvensen av nukleotider är inverterad och reverserad i förhållande till
varandra. Två komplementära DNA-strängar kan baspara:
Exempelvis: 5’CATTCCGTC3’
3’GTAAGGCAG5’
Information i en sträng förutsäger information i den andra strängen. DNA-molekylen består av
två kedjor hopvirade till en helixliknande struktur, där basparen ligger inne i helixens
centrum[1], se figur 2.
Figur 2: DNA-sträng [1].
3.2.2 RFLP och SNP
En SNP (Single Nucleotide Polymorphism) är en sekvensvariation i DNA-sekvensen som
inträffar då endast en nukleotid (A, T, C eller G) i genomet alterneras. Vissa ärftliga sjukdomar
förorsakas direkt av SNPs. De flesta SNPs utgör emellertid en normal variation mellan individer
och är inte kopplade till någon speciell sjukdom. RFLP är en teknik som används till att
analysera SNPs. Tekniken går ut på att man med Gel elektrofores analyserar
restriktionsfragmenten som man fått vid klyvning av PCR-produkten med specifika
restriktionsenzymer (För beskrivning av PCR och Gel elektrofores se kap 4.1 resp. 4.2).
3.2.3 Genetiska begrepp
Varje egenskap hos en människa bestäms av ärftliga faktorer, s.k. gener. Gener är uppbyggda
av DNA, deoxyribonukleinsyra. En bit av DNA-molekylen, som påverkar cellen genom att styra
bildandet av ett protein, kallas en gen eller ett arvsanlag. I cellkärnan ligger generna på rad i
6
”stavar”, kromosomer. Varje kromosom består av en DNA-molekyl, formad som en
dubbelspiral. Platsen på en kromosom där genen för ett visst protein finns kallas genens locus.
När en gen i ett locus, som reglerar en egenskap, förekommer i olika varianter kallas dessa
alleler. Hos varje individ kan det finnas två alleler av en gen, en från varje förälder. I ett allelpar
med anlag för t.ex. svarta ögon, kan den ena allelen koda för svarta ögon och den andra för ickesvarta öga och man säger att individen är heterozygot för svarta ögon. En individ med två
identiska alleler sägs vara homozygot. Att olika människor har olika ögonfärg beror på att de
har olika beskrivningar av det protein som tillverkar ögonpigment. Att beskrivningen för ett och
samma protein hos olika individer skiljer sig åt kallas polymorfism. Genotypen anger vilken
kombination av alleler individen bär på. Ofta talar man om en individs genotyp med avseende
på en viss gen [18].
3.2.4 Polymorfism
En polymorfi är nedärvd – den kommer via mamman eller pappan, och förekommer ganska ofta
i en population (i mer än 1 % av befolkningen). Någon gång för länge sen uppstod en mutation,
och den har ”hängt kvar” genom evolutionen. Antingen gör den ingen skillnad, förbättrar eller
försämrar den för organismen.
En polymorfi kan bidra till att organismen får en viss sjukdom om den förbättrar (man kan t ex
tänka sig att ett ”överaktivt” protein kan ge cancer) eller försämrar proteinets funktion väldigt
mycket. Det är därför man tittar på polymorfier och ser om de är associerade till vissa
sjukdomar. Många små ändringar i immunförsvaret kan leda till att personen får ett sämre
immunförsvar och utvecklar då kanske åderförkalkning eller någon annan inflammatorisk
sjukdom.
3.2.5 Kromosomstrukturen
En kromosom är en lång tråd av DNA, i vilken hela eller delar av genomet finns. Människans
genom innehåller ca 30 000 gener som är fördelade på 46 kromosomer. Kromosomerna hör ihop
parvis, i 23 par, där man förenklat kan säga att ena hälften ärvts från modern och den andra från
fadern. Varje kromosom består av specifika genuppsättningar med olika egenskaper. En specifik
gen återfinns alltid på ett specifikt locus (plural loci) av en given kromosom. Så finns t.ex. TNFalfa genen på plats −308 i promotor regionen på kromosom 6.
Man har två uppsättningar av en och samma gen, en ärvs från pappa och en från mamma. Detta
beror på att vi har en ”diploid” uppsättning av våra kromosomer. Detta gäller för alla celler
utom spermier och ägg, där det bara finns en av varje kromosom.
Alla individer bär i princip på samma uppsättning gener, men varje gen kan förekomma i flera
varianter (alleler). Dessa varianter kan vara mer eller mindre funktionella och i vissa fall kan de
ge upphov till sjukdom. En homozygot är en individ som har två identiska alleler och när
allelerna skiljer sig åt är individen heterozygot [1], se figur 3.
7
Moder
Olika gener
Fader
R
r
A
a
B
B
C
c
d
d
Loci
Alleler av samma gen
Heterozygota alleler
Homozygota alleler
Figur 3: Ett kromosompar med olika genuppsättningar. Varje genkopia utgör en allel.
3.2.6 MHC-gener och HLA-komplex
En grupp av gener som är inblandade i immunförsvaret kallas MHC gener, Major
Histocompatibility Complex genes. MHC proteinernas uppgift är att känna igen och binda
främmande ämnen och aktivera vita blodkroppar som bekämpar dessa ämnen.
MHC bestämmer delvis det immuna svaret till ett antigen och defekter i dessa gener spelar
därmed en roll för utvecklingen av vissa sjukdomar. MHC är en samling gener ordnade i en lång
rad i DNA:t på kromosom 6. MHC kallas även för Human Leucocyte Antigen (HLA). MHC
molekylerna är organiserade i olika regioner som kodar för tre klasser av proteiner. Klass III
MHC gener kodar för proteiner som har immuna funktioner, inkluderande komponenter från
komplementsystemet (ex C4, C2) och molekyler som är involverade i inflammationer (TNFalfa) [7].
8
4 Material och metoder
Möjligheten att studera arvsmassan ökade drastiskt under slutet av 70-talet. Från att ha varit
den svåraste cellulära molekylen att studera blev DNA nu den lättaste. Detta berodde på att nya
molekylärbiologiska tekniker utvecklades i kombination med att datatekniken blev mer
lättillgänglig för att hantera erhållna data. Man har med dessa tekniker uppskattat att den
mänskliga arvsmassan består av ca 3 miljarder baspar och det humana genomet innehåller ca
30 000 gener. Den centrala dogman, DNA→RNA→PROTEIN, innebär att diagnostik på DNAnivå kan ge information om defekter på proteinnivå. De flesta nedärvda sjukdomar beror på en
genetisk variant som ger upphov till en icke-funktionell genprodukt. För att studera polymorfier
i generna används PCR och RFLP tekniker [15].
4.1 PCR − Polymeras Chain Reaction
För att en speciell del av en DNA-molekyl ska bli analyserbar måste denna del mångfaldigas.
Denna amplifiering av DNA-molekylen görs med en teknik kallad PCR, där DNA:t ökar
exponentiellt.
Polymeras kedjereaktion (PCR) är en metod som används till att isolera stora mängder av ett
enda DNA-fragment. PCR uppfanns av Kary Mullins, 1998 [1]. Förutsatt att en sekvens av
DNA-molekylen är känd kan man med PCR amplifiera denna molekyl. Antalet DNA-molekyler
ökar exponentiellt – dubbleras vid varje cykel – detta leder till det faktum att en liten del av
DNA ger en omfattande mängd DNA som ett resultat av PCR.
Startmaterialet kan antingen utgöras av klonade DNA-fragment eller en blandning av DNAmolekyler – till exempel i detta projekt har jag använt genomiskt DNA från mänskliga celler.
Förutsatt att nukleotidsekvensen som omger det område man vill amplifiera är känd kan DNA:t
amplifieras genom att DNA-primers designas så att DNA-syntesen startas vid önskad punkt.
Primrarna som används utgörs ofta av kemiskt syntetiserade oligonukleotider som innehåller
korta DNA strängar på 20-25 baspar, bp. Två primrar används, en från varje riktning. Dessa
utgör startbitar i den DNA-sträng som amplifieras.
PCR-reaktionen kan delas upp i tre steg:
1. Denaturering
Här frigörs strängarna i DNA-molekylen från varandra i en temperatur på 94-95°C
2. Annealing
Genom att sänka temperaturen till 54−58°C, kan primrarna fästa till var och en av de två
DNA-strängarna.
3. Elongering − DNA-syntes
Två nya DNA-strängar syntetiseras vid en temperatur på 72°C genom att primrarna förlängs
när nya nukleotider hakas på med hjälp av enzymet Taq polymeras. Nukleotiderna är
komplementära mot mallsträngen, se figur 4.
9
Figur 4: Amplifiering av DNA med PCR[1].
Dessa tre steg motsvarar en cykel. Vid varje cykel syntetiseras två nya molekyler från en
molekyl. De nya syntetiserade molekylerna utgör mallar för ytterligare DNA-syntes i nästa
cykel. Därmed blir PCR en kedjereaktion.
Det DNA-polymeras som används är ett enzym som är stabilt även vid höga temperaturer.
Enzymet kommer från Thermus aquaticus (taq) bakterien.
Om man vet hur sekvensen av en gen ser ut så att primrar kan bestämmas utgör PCR en kraftfull
metod för att erhålla stora mängder DNA. Det amplifierade DNA:t synliggörs med hjälp av Gel
elektrofores, se figur 5, för att sedan analyseras vidare med hjälp av RFLP teknik.
10
Figur 5: Amplifierade DNA-fragment av olika storlekar efter analysering med gel elektrofores[1].
4.2 Gel Elektrofores
Gel elektrofores är en metod som används för att separera DNA-molekylerna genom ett
elektriskt fält. DNA-proverna laddas, i detta fall i en 3 % agaros gel som placerats i ett
elektroforeskärl innehållande en elektrofores buffert. Efter att DNA pipetterats i små hål i gelen
tillsammans med ett färgämne får en ström passera genom gelen. DNA som är negativt laddad
rör sig mot den positiva polen, se figur 6. De små DNA-fragmenten rör sig snabbare genom
gelen, till skillnad mot de större fragmenten.
Figur 6: Gel elektroforeskärl [13].
För att kalibrera mätningen laddar man på en lämplig storleksmarkör (”stege”), i detta fall med
band på mellan 100 och 200 baspar. Om DNA:t, efter visualisering med UV-ljus, framträder
11
som tydliga band, tyder detta på att PCR-reaktionen lyckats och DNA:t amplifierats, se figur 7.
Då kan man gå vidare med klyvning av banden med specifika restriktionsenzymer.
Figur 7: Exempel på DNA band efter lyckad PCR.
4.3 Klyvning med restriktionsenzymer
Restriktionsenzymer (RE) är enzymer som känner igen och klyver specifika DNA-sekvenser.
De kan renas fram från bakterier och olika enzymer känner igen olika sekvenser som är 4-8 bp
långa. DNA:t delas upp i restriktionsfragment av olika storlekar, där antalet fragment beror på
hur många gånger enzymet stöter på en sekvens den känner igen, för att sedan klyva. I detta
projekt har jag använt RE för att studera varianter av en gen (alleler) vilka uttrycks som
separerade DNA-fragment av olika storlekar hos olika individer (se resultatdelen).
Att man får olika antal band av olika storlekar (genotyper) hos olika individer tyder på att
generna hos TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 skiljer sig åt från individ till individ, dvs. det
förekommer polymorfier i dessa gener. Huruvida dessa genvarianter är kopplade till den
sjukdom vi studerar analyseras sedan med hjälp av ett statistiskt program, Fisher´s exact test (se
4.5). Antalet band, i vårat fall ett, två eller tre band, beror på om RE klipper eller inte och om
individen är homozygot eller heterozygot. Ett band får man då RE aldrig hittar sin
”igenkänningssekvens” och aldrig klipper. Individen i detta fall är homozygot. Två band får
man då RE hittar sin ”igenkänningssekvens” och klipper. Här är det också fråga om en individ
som är homozygot. Tre band får man då individen är heterozygot och RE hittar sin
”igenkänningssekvens” i endast ena uppsättningen (man har två uppsättningar av en och samma
gen, se 3.2.5), vilket skapar två band. I den andra uppsättningen hittar RE aldrig sin sekvens och
ursprungsbandet förblir intakt. Detta ger ytterligare ett band och totalt tre band.
4.4 Utförande
Polymorfismerna som studerats var TNF-α −308, IL-1β RFLP TaqI och CTLA-4 −318. Detta
gjordes med hjälp av gel elektrofores efter klyvning av PCR-produkterna med specifika
restriktionsenzymer.
I undersökningen har jag använt genomiskt DNA, som jag extraherat från EDTA-blod (EDTA,
Ethylene Diamine Tetra Acetic acid, är en kemikalie som är tillsatt till röret innan man tar blod i
det, för att förhindra blodet att koagulera.) som tillhör 72 patienter med kärlinflammationer och
höga halter IC. Extraktionen gjordes med Salting Out-metoden som är en metod där man
isolerar DNA:t från blodceller. Man börjar med att lysera cellerna genom att tillsätta en buffert
som får cellerna att spricka så att kärnorna klumpas ihop (DNA finns i cellkärnan). Med hjälp
12
av proteinas K bryter man ned och eliminerar proteiner. Efter borttagandet av proteinerna fäller
man ut DNA:t med etanol och löser upp det igen i en buffert [16].
För alla tre generna valde jag ut lämpliga primrar som skulle ge mig lagom stora fragment att
jobba med. Från TNF-α genen amplifierade jag en bit av promotorregionen på 107 bp. Från IL1β och CTLA-4 genen amplifierade jag bitar på 249 respektive 247 bp. Dessa delar innehåller
de polymorfier som ska undersökas.
Amplifieringen gjordes med PCR för att sedan klyvas med specifika restriktionsenzymer. Som
slutresultat fås DNA-fragment av olika storlekar (genotyper) som framträder i form av ett eller
flera band beroende på vilken variant de innehåller (se 4.3).
4.4.1 TNF-α−308 (G→A)
Oligonukleotiderna 5´AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT3´ och
5´TCCTCCCTGCTCCGATTCCG3´ (från Eurogentech) användes som primrar för amplifiering
av promotorregionen som innehåller en SNP, en A/G polymorfism på plats −308.
Amplifieringen startades med en denatureringstemperatur på 94°C under 10 minuter följt av 40
cykler, där varje cykel bestod av en denaturering på 94°C under 45 sek, annealing på 58°C
under 45 sek, elongering på 72°C under 45 sek följt av en slutlig elongering på 72 °C under 10
minuter. Klyvning av de amplifierade produkterna utfördes med restriktionsenzymet NcoI vid
en inkubationstemperatur på 37°C under 2 timmar. De klyvda PCR-produkterna på 107 bp gav
två fragment på 87 och 20 bp (G) eller förblev intakta (A) efter att ha laddats i en 3 % agaros gel
(se resultatdelen).
4.4.2 IL-1β RFLP TaqI
Oligonukleotiderna 5´GTTGTCATCAGACTTTGACC3´ och
5´TTCAGTTCATATGGACCAGA3´ användes som primrar för amplifiering av den del av IL1β som innehåller en TaqI polymorfism i exon 5. Amplifieringen startades med en denaturering
på 94°C under 90 sek, annealing på 54 °C under 90 sek samt en elongering på 72°C under 60
sek i tre cykler. Programmet gick sedan över i en 35 cykel period bestående av en denaturering
på 97°C under 30 sek, annealing på 54 °C under 30 sek samt en elongering på 72°C under 30
sek. Programmet avslutades med en elongering på 72 °C under 10 minuter. Klyvning av de
amplifierade produkterna utfördes med restriktionsenzymet TaqI vid en inkubationstemperatur
på 65°C under 2 timmar. De klyvda PCR-produkterna på 249 bp gav två fragment på 135 och
114 bp (A1) eller förblev intakta (A2) efter att ha laddats i en 3 % agaros gel (se resultatdelen).
4.4.3 CTLA-4 −318 (C→T)
Oligonukleotiderna 5´AAATGAATTGGACTGGATGGT3´ och
5´AATGCTCTTTCCTTCGGCAC3´ användes som primrar för amplifiering av
promotorregionen som innehåller en SNP, en C/T polymorfism på plats -318. Amplifieringen
startades med en denatureringstemperatur på 94°C under 10 minuter följt av 44 cykler, där varje
cykel bestod av en denaturering på 94°C under 36 sek, annealing på 55°C under 36 sek,
elongering på 72°C under 36 sek följt av en slutlig elongering på 72 °C under 10 minuter.
Klyvning av de amplifierade produkterna utfördes med restriktionsenzymet MseI vid en
inkubationstemperatur på 37°C under 2 timmar. De klyvda PCR-produkterna på 247 bp gav två
fragment på 21 och 226 bp (C) eller 21, 107 och 119 bp (T) efter att ha laddats i en 3 % agaros
gel (se resultatdelen).
4.5 Statistiska analyser
Jag har jämfört allel och genotyp frekvenser av de tre generna mellan patienter och friska
personer. Detta gjordes med Fisher’s exact test, som är ett statistiskt program där man använder
13
data ur en 2x2 tabell, dvs. en tabell med två rader, som motsvarar två olika grupper − i mitt fall
den sjuka (IC) och den friska gruppen (HC) − och två kolumner som motsvarar de två olika
allelerna/genotyperna. Allel/genotyp 1 är den allel/genotyp man antar är förknippad med
sjukdomen och allel/genotyp 2 är den allel/genotyp man inte förknippar med sjukdomen, se
figur 8.
Allel/gen Allel/geno
otyp 1
typ 2
Grupp 1
(IC)
A
B
Grupp 2
(HC)
C
D
Figur 8. Exempel på en 2x2 tabell.
Fisher’s exact test ger bl.a. ut parametrar som Odds Ratio, OR och P-värden. P-värdet anger
signifikantgraden, dvs. hur signifikant resultatet är. Om man antar att det inte finns någon
skillnad alls mellan patientgruppen (IC) och den friska gruppen (HC) av allel/genotyp frekvens
skulle man få ett P-värde på 1.0. Ju större skillnad det är mellan grupperna desto lägre P-värde.
Om P<0.05 är resultatet signifikant. Ju lägre P-värdet är desto mer signifikant. OR är en faktor
som beskriver hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen jämfört
med genomsnittspersonen förutsatt att resultatet är signifikant. Den räknas ut med följande
formel: OR=(A/B)/(C/D).
Då OR=1 finns det ingen skillnad mellan grupperna vad gäller risken att utveckla sjukdomen
med viss allel/genotyp. Om OR däremot har ett värde nära 0 eller oändligheten finns det
minskad respektive ökad risk att utveckla sjukdomen. Då OR>1, har grupp 1 en större andel av
allel/genotyp 1 än grupp 2, där grupp 1 motsvarar den sjuka gruppen som är bärare av
allel/genotyp 1 och grupp 2 den friska gruppen som är bärare av samma allel/genotyp. Ju större
OR är desto större är risken att man utvecklar sjukdomen. Om däremot grupp 2 har den största
andelen av allel/genotyp 1 är OR<1. I figur 9 visas ett exempel på en uträkning av OR.
A
G
IC
54
90
HC
26
174
Figur 9. Exempel på en uträkning.
Detta ger en OR på 4,015. Eftersom OR>1 kan vi dra slutsatsen att grupp 1, dvs. den sjuka
gruppen (IC) med A allel har större andel av denna allel (54) och utgör därmed den
riskdrabbade gruppen. Eftersom man har ett 95 % konfidensintervall på OR så vet man att det är
sannolikare att få sjukdomen, men man vet inte om det är just 4,015 ggr så stor risk egentligen.
Personer som är bärare av A allelen har alltså ca 4 ggr så stor risk (med 95 % säkerhet) att
utveckla sjukdomen jämfört med den sjuka gruppen som inte är bärare av denna allel.
14
5 Resultat
5.1 RFLP och SNP analyser
PCR-amplifiering användes på DNA från totalt 72 patienter med kärlinflammationer och IC
förekomst. RFLP analyser av IL-1-beta genen samt SNP analyser av TNF-alfa och CTLA-4
generna genomfördes genom att köra klyvningsprodukterna på gel elektrofores.
5.1.1 TNF-α−308 (G→A)
Gel elektrofores kördes efter klyvning med NcoI av PCR fragment som innehöll en SNP −308.
Klyvningen med NcoI (som endast känner igen GC-sekvensen) gav antingen två fragment på 87
och 20 bp (GG), tre fragment på 107, 87 och 20 bp (AG) eller förblev intakta (AA), 107 bp, se
figur 10.
M
1
2
3
4
5
Figur 10. Exempel på genotyper efter SNP analyser av TNF-alfa hos 5 patienter. M visar en stege på
100 bp. Kolumn 1, 3 och 4 visar prover homozygota för G (GG) som syns som två band på 87 och 20 bp
(bandet på 20 bp syns inte). Kolumn 2 visar ett prov homozygot för A (AA) som syns som 1 band på 107
bp. Kolumn 5 visar ett heterozygot prov AG, där alla tre band är synliga. Det nedersta bandet är på 107
bp och det övre på 87 bp. Det minsta bandet på 20 bp är för litet att se.
Nedan visas resultaten av SNP analyserna av TNF-alfa för alla 72 patienter sammanställda i en
tabell efter statistiska analyser, se tabell 1.
15
Tabell 1.Genotyp fördelningar och allel frekvenser för TNFα−308 hos patienter
(IC) och friska personer(HC).
IC n=72
HC n=100
OR
P-värde
GG
27 (38 %)
76 (76 %)
0,1895
<0,0001
AG
36 (50 %)
22 (22 %)
3,5455
0,0002
AA
Allel
9 (12 %)
2 (2 %)
7,0000
0,0088
G
90 (63 %)
174 (87 %)
0,2241
<0,0001
A
54 (37 %)
26 (13 %)
4,015
<0,0001
Genotyp
OR= hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen.
P-värdet anger signifikantgraden.
De låga P-värdena indikerar att resultatet är signifikant. Av tabellen framgår att den vanliga
GG-genotypen hos den friska gruppen (HC) förekommer i minskad grad hos den sjuka gruppen
(IC). I en studie gjord på MG patienter fanns även här en mindre förekomst av GG-genotyp hos
den sjuka gruppen. Av OR kan vi se att risken att man med denna genotyp utvecklar sjukdomen
är liten (OR=0,1895).
Vidare visas att AA- samt AG-genotyper är vanligare bland patientgruppen än bland friska. De
höga OR värdena för dessa två genotyper visar att risken att man med dessa genotyper utvecklar
sjukdomen är stor.
Den vanliga G-allelen hos friska personer är mera ovanligt förekommande hos patientgruppen.
Detta har även visats i en tidigare studie som gjorts på RA patienter[8].
Tabellen visar även att den ovanliga A-allelen är mindre förekommande hos friska personer,
medan den förekommer i högre prevalens hos IC gruppen. Även i MG studien uppvisades en
ökad frekvens av A-allelen bland sjuka [2]. Av OR kan vi se att personer med A-allelen utgör
den riskdrabbade gruppen.
5.1.2 IL-1β RFLP TaqI
Gel elektrofores kördes efter klyvning med TaqI av PCR-fragmenten. Klyvningen av det 249 bp
långa fragmentet gav antingen tre fragment på 114, 135 och 249 bp (A1A2), två fragment på
114 och 135 bp (A1A1) eller förblev intakta (A2A2), 249 bp, se figur 11.
16
M
1
2
3
4
5
6
7
Figur 11. Exempel på genotyper efter RFLP analyser av IL-1-beta hos 7 patienter. M visar en stege på
100 bp. Kolumn 1 visar ett prov homozygot för A2 (A2A2) som syns som ett band på 249 bp. Kolumn 2-6
visar heterozygota prover (A1A2) där alla tre band är synliga. Kolumn 7 visar ett prov homozygot för A1
(A1A1) som framträder som två band på 114 och 135 bp. Det nedersta bandet är på 249 bp, mellersta på
135 bp och det övre på 114 bp.
Nedan visas resultaten av RFLP analyserna av IL-1-beta för alla 72 patienter sammanställda i en
tabell efter statistiska analyser, se tabell 2.
Tabell 2. Genotyp fördelningar och allel frekvenser för IL-1β RFLP TaqI hos patienter (IC)
och friska personer(HC).
IC n=72
HC n=100
OR
P-värde
A1A1
8 (11 %)
65 (65 %)
0,0673
<0,0001
A2A1
49 (68 %)
32 (32 %)
4,5272
<0,0001
A2A2
Allel
15 (21 %)
3 (3 %)
8,5088
0,0002
A1
65 (45 %)
162 (81 %)
0,1930
<0,0001
A2
79 (55 %)
38 (19 %)
5,181
<0,0001
Genotyp
OR= hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen.
P-värdet anger signifikantgraden.
Även här har jag fått mycket signifikanta resultat (låga P-värden). Den vanliga A1A1-genotypen
hos friska personer förekommer i mycket låg grad hos patienterna (65 respektive 11 %), medan
A2A1- samt A2A2-genotyper förekommer i större grad bland sjuka.
Vidare kan vi se av OR att patienter med A2A1- och A2A2-genotyper har betydligt större risk
att drabbas av sjukdomen än patienter med A1A1-genotyp (OR=4,5272 och 8,5088 respektive
0,0673).
Även allel frekvensen visar att A2-allelen är vanligare hos sjuka än hos friska. Av OR kan vi se
att personer med A2-allel utgör den riskdrabbade gruppen.
17
5.1.3 CTLA-4−318 (C→T)
Gel elektrofores kördes efter klyvning med MseI av PCR-fragmenten. Klyvningen med MseI
(som endast känner igen AT-sekvensen) gav tre fragment på 107, 119 och 226 bp (CT), två
fragment på 119 och 226 bp (TT) eller förblev intakt (CC), 226 bp, se figur 12.
M
1
2
3
M
4
5
6
Figur 12. Exempel på genotyper efter SNP analyser av CTLA-4 hos 6 patienter. Båda M:en
visar stegar på 100 bp. Kolumn 1,3,4 och 5 visar prover homozygota för C (CC) som syns som
ett band på 226 bp. Kolumn 2 visar ett heterozygot prov (CT) där alla tre band är synliga.
Kolumn 6 visar ett prov homozygot för T (TT) där två band på 107 och 119 bp är synliga. Det
nedersta bandet är på 226 bp, det mellersta på 119 bp och det övre på 107 bp.
Nedan visas resultaten av SNP analyserna av CTLA-4 för alla 72 patienter sammanställda i en
tabell efter statistiska analyser, se tabell 3.
Tabell 3. Genotyp fördelningar och allel frekvenser för CTLA-4−318 (C→T) hos patienter (IC)
och friska personer(HC).
IC n=72
HC n=100
OR
P-värde
CC
58 (80 %)
86 (86 %)
0,6744
0,4040
CT
12 (17 %)
14 (14 %)
1,2286
0,6698
TT
Allel
2 (3 %)
0 (0 %)
7,1277
0,1738
C
128 (89%)
186 (93 %)
0,6022
0.2447
T
16 (11 %)
14 (7 %)
1,6610
0.2447
Genotyp
OR= hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen.
P-värdet anger signifikantgraden.
Här har jag inte fått några signifikanta resultat alls, vilket vi kan se av våra höga P-värden.
Exempelvis kan vi se att OR för TT-genotyp är så hög som 7,1277 trots att denna genotyp inte
är förknippad med sjukdomen. Detta kan förklaras med att för TT genotyp har vi haft alldeles
18
för få personer att föra statistik på, 2 respektive 0 personer. För T-allel är det nästan lika många
i den sjuka gruppen som i den friska (16 respektive 14). Det är alltså inte så stor skillnad mellan
grupperna, därmed mina höga P-värden och osignifikanta resultat.
Det förekommer alltså inte någon signifikant association mellan någon genotyp/allel i CTLA-4
genen och sjukdomen. Polymorfismen i CTLA-4 påverkar således inte utvecklingen av
kärlinflammationer med IC förekomst.
19
6 Diskussion
Balansen mellan pro-inflammatoriska och anti-inflammatoriska cytokiner är viktiga för
utvecklingen av kärlinflammationer. Högre koncentration av pro-inflammatoriska cytokiner,
såsom IL-1-beta och TNF-alfa skadar blodkärlen och omgivande vävnad [5]. Cytokiner från
lymfocyter som sätter sig fast på inflammationssidan orsakar ytterligare skada. Individer som
har genetiska varianter som orsakar hög sekretion av pro-inflammatoriska cytokiner har alltså
en ökad risk att utveckla inflammationer.
Syftet med detta projekt har varit att analysera detta vidare hos en ny grupp av patienter. Jag har
gjort RFLP och SNP analyser på DNA från totalt 72 patienter med kärlinflammationer och höga
halter IC. Jag har undersökt intressanta polymorfier i generna för TNF-alfa, IL-1-beta och
CTLA-4.
Det har visat sig att produktionen av TNF-alfa bl.a. är beroende av A/G polymorfismen på
promotor region −308, samt att den ovanliga A-allelen är förknippad med en ökad sekretion [5].
Från TNF-alfa analyserna kan vi se att den ovanliga A-allelen förekommer i ökad grad hos IC
patienter, se tabell 1. Dessa har alltså en ökad TNF- α sekretion och därmed större risk att
utveckla kärlinflammation. Av detta kan vi dra slutsatsen att polymorfismen hos TNF-alfa
generna bidrar till en annorlunda allel och genotyp förekomst hos våra patienter till skillnad från
friska personer. Det förekommer alltså en variant i TNF-alfa genen som bidrar till denna höga
sekretion.
Från IL-1-beta analyserna kan vi se att den ovanliga A2-allelen förekommer i ökad grad hos IC
patienter, se tabell 2. Då A2-allelen är associerad med högre IL-1-beta sekretion [5] kan vi dra
slutsatsen att patienter med A2 alleler har en hög IL-1-beta sekretion och därmed större risk att
utveckla inflammation.
TNF-alfa och IL-1-beta är båda pro-inflammatoriska och således negativa då de förekommer i
ökad mängd. På samma sätt kan vi säga att det är positivt med ökat uttryck av CTLA-4 eftersom
det fungerar antiinflammatoriskt. I andra studier har den ovanliga T-allelen varit förknippad
med ökad transkription och därmed ökat uttryck av CTLA-4 [11]. C-allelen däremot har varit
förknippad med minskad funktion av CTLA-4 vilket innebär en bristande hämning av T-cells
aktivering. Denna genetiska variant av CTLA-4 fungerar proinflammatoriskt. I min
undersökning hade vi således väntat oss en ökad prevalens av C-allelen. Jag fick det jag
förväntade mig men då denna allel även förekommer i ökad prevalens hos den friska gruppen
kan jag inte förknippa C-allelen med kärlinflammationer och IC förekomst.Från CTLA-4
analyserna kunde jag alltså inte se någon större skillnad av allel/genotyp frekvenser hos sjuka
och friska personer. I denna undersökning visar sig C-allelen vara nästan lika vanlig hos våra
patienter som hos friska, se tabell 3. Således kan vi inte förknippa förekomsten av C-allelen till
personer med kärlinflammationer. Ingen signifikant association mellan C/T polymorfismen och
kärlinflammationer med IC förekomst upptäcktes i denna undersökning.
Det är inte en enda SNP som ger upphov till en sjukdom, utan det är oftast kombinationer av
polymorfier samt fler gener som samverkar. I CTLA-4 genen skulle man således vilja titta på
fler polymorfier för att se om det finns någon koppling mellan andra polymorfier som
tillsammans kan ge upphov till utvecklingen av kärlinflammationer med höga halter
immunkomplex.
20
Referenser
[1] Geoffrey M. Cooper: The Cell. ASM Press, 2000
[2] Huang D., Pirskanen R., Matell G., Lefvert AK. 1999. Tumour necrosis factor-α
polymorphism and secretion in myasthenia gravis. Journal of neuroimmunology 94:165-171
[3] Henrik Brändén och Jan Andersson: Grundläggande Immunologi. Studentlitteratur 1998
andra upplagan
[4] Gel Electrophoresis, http://www.bergen.org/AAST/Projects/Gel/ElecNucleics.htm. Senast
besökt, februari 2005
[5] Jasmina Cvetkovic 2002. Immune mechanisms in atherosclerotic disease
[6] Awder Mustafa 2001. Circulating immune complexes in atherosclerotic vascular disease
[7] Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne, Janis Kuby: Immunology. 2002
fifth edition
[8] Cvetkovic JT, Wallberg-Jonsson S, Stegmayr B, Rantapaa-Dahlqvist S, Lefvert AK. 2002.
Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with
polymorphisms of the TNF-alpha, IL-1-beta and IL-1Ra genes. Journal of rheumatology. Feb
2002; 29(2):212-9
[9] Nityanand S., Truedsson L., Mustafa A., Bergmark C., Lefvert AK.1999. Circulating
immune complexes and complement C4 null alleles in patients operated on for premature
atherosclerotic peripheral vascular disease. Journal of clinical immunology.1999;19(6): 406-13.
[10] Libby P.2002. Inflammation in atherosclerosis. Nature, Vol 420, Dec 2002;19(26): 868874.
[11] Wang XB., Kakoulidou M., Qiu Q., Giscombe R., Huang D., Pirskanen R., Lefvert
AK.2002. Cds1 and promoter single nucleotide polymorphisms of the CTLA-4 gene in human
myasthenia gravis. Genes and immunity 3: 46-49.
[12] Lefvert AK.1997. Intensiv diagnostik av svårtolkade symptom. Läkartidningen, Vol 94, nr
9. 719.
[13] http://home.swipnet.se/biokomp/DNA/pcrlambda.htm. Senast besökt, mars 2005
[14] http://www.reumatiker.se/bilagor/eular02/02bil248.pdf. Senast besökt, okt 2005
[15] http://t1.physician.ki.se/csof/csof2/laboration/dnalabht04_csof2.pdf. Senast besökt, nov
2005
[16] DNA isolation methods,
http://www1.qiagen.com/literature/brochures/Gen_DNA_Pur/1019469_BROS_DNYti_p10_13.
pdf. Senast besökt, jan 2006
[17] Harvey Motulsky: Prism 4 Statistics Guide. 2003. Version 4.0
[18] http://www.math.chalmers.se/~staffan/lektion1.pdf. Senast besökt, mars 2005
21
TRITA-CSC-E 2006: 101
ISRN-KTH/CSC/E--06/101--SE
ISSN-1653-5715
www.kth.se
