Akut myeloisk leukemidiagnostik och klassifikation EQUALIS 2017 Rose-Marie Amini Klinisk Patologi, Hematopatologi Akademiska sjukhuset, Uppsala 2001 WHO klassifikationen 2001 och 2008, reviderad 2016 inkluderar myeloida maligniteter 2008 Reviderad 2016 Diagnostik av AML • 20 % myeloiska blastceller i blod och/eller benmärg eller förekomst av vissa specifika kromosomavvikelser • För klassifikation krävs • Morfologi-ange grad av utmognad • Immunfenotypning med flödescytometri-viss morfologi och immunfenotyp associerad med vissa specifika genetiska avvikelser • Cytogenetik och molekylär genetik • (Enzymcytokemi) (endast AML) Auer stavar representerar fusion av primära lysosomala granula • AML med ”specifika genetiska avvikelser” (”recurrent genetic aberrations”) • AML med myelodysplasi-relaterade förändringar • Terapi-relaterade myeloiska maligniteter • AML NOS “ospecificerad” • Myelosarkom • Myeloiska maligniteter hos Downs syndrom • -TAM, myeloid leukemi associerad med Downs syndrom AML med specifika genetiska avvikelser • AML med t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T1 • AML med inv (16)(p13.1q22) eller t(16;16)(p13.1:q22); CBFBMYH11 • APL med PML-RARA • AML med t(9;11)(p21.3;q23.3); MLLT3-KMT2A • AML med t(6;9)(p23;q34.1); DEK-NUP214 • AML med inv(3)(q21.3q26.2) eller t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM • AML (megakaryoblastisk) med t(1;22)(p13.3;q13.3); RBM15MKL1 • AML med NPM1 mutation • AML med biallelisk mutation av CEBPA “Provisional entity”: AML med BCR-ABL1 AML med muterad RUNX1 AML med t(8;21) • Blastandel kan vara <20% • 5% av alla AML • Ofta ”M2” morfologi, Auerstavar även i granulocyter • Stora blaster med basofil cytoplasma • Pseudopelger anomali • Granulocytisk differentiering med asynkront marköruttryck (CD34 & CD15) • Ofta uttryck av B-cellsmarkörer, Tdt • CD34, DR, CD13, MPO, CD33dim AML med t(8;21) Tdt AML med inv(16) eller t(16;16) • Blastandel kan vara ≤20% • Myelomonocytär differentiering ”M4” • Eosinofili, celler med patologisk granulering • 5-8% av alla AML, yngre patienter • Flera populationer med granulocyt och monocytär differentiering • CD34, CD117, CD13, CD33, MPO, CD15, CD14,CD4, C11b, CD64, CD36 osv Akut promyelocytleukemi AML med PML-RARA t(15;17) (q22;q12) Specifik translokation involverande Retinoic acid receptor alpha (RARa) 17q21 PML 15q22 Namn Efternamn 14 mars 2017 13 • AML med ”specifika genetiska avvikelser” • AML med myelodysplasi-relaterade förändringar • Terapi-relaterade myeloiska maligniteter • AML ospecificerad • Myelosarkom • Myeloiska maligniteter hos Downs syndrom • -TAM, myeloid leukemi associerad med Downs syndrom AML med myelodysplasi-relaterade förändringar • >= 20 % blaster i benmärg eller blod samt dysplasi (>50% dysplastiska celler) i 2 eller fler myeloida linjer, vanligen inkluderande megakaryocyter • Eller • MDS-specifika kromosomförändringar • Eller • Tidigare MDS diagnos • Dysplasin måste finnas innan behandling • Kan uppkomma de novo eller efter MDS eller MDS/MPN • CAVE! Förekomst av NPM1 mutation eller biallelisk CEBPA klassificerar leukemin i annan kategori AML med specifik genetisk avvikelse • AML med ”specifika genetiska avvikelser” • AML med myelodysplasi-relaterade förändringar • Terapi-relaterade myeloiska maligniteter • AML ospecificerad • Myelosarkom • Myeloiska maligniteter hos Downs syndrom • -TAM, myeloid leukemi associerad med Downs syndrom Terapi-relaterad AML • Efter behandling med cytostatika Alkylerare, topoisomeras II hämmare Antimetaboliter, anti-tubilinagerande substanser • Efter strålning • AML med ”specifika genetiska avvikelser” • AML med myelodysplasi-relaterade förändringar • Terapi-relaterade myeloiska maligniteter • AML ospecificerad • Myelosarkom • Myeloiska maligniteter hos Downs syndrom • -TAM, myeloid leukemi associerad med Downs syndrom AML, ospecificerad (vanligast!) • • • • • • • • • AML med minimal differentiering AML utan utmognad AML med utmognad Akut myelomonocytleukemi Akut monoblastleukemi och akut monocytleukemi Erytroid leukemi (obs nu 20% blaster skilj mot tidigare klassifikation) Akut megakaryoblastleukemi Akut basofil leukemi Akut panmyelos med myelofibros AML med minimal differentiering <5% av AML CD34, CD38, HLA-DR Myeloiska markörer CD13, CD117, CD33 (60%), ej MPO TdT (50%), CD7 (40%) AML utan utmognad CD34, HLA-DR, MPO pos, CD13, CD33, CD117, CD7 (30%) CD2, CD4, CD19, CD56 (10-20%) 5-10% av AML AML med utmognad 10% av AML <20% monocytära CD34, HLA-DR, CD117 CD13, CD33, CD15, CD11b CD7 (20-30%) Myeloperoxidas AML med utmognad Auerstav Myeloperoxidas Akut myelomonocytär leukemi 5-10% av AML ≥20% blaster & promonocyter i BM/PB ≥20% neutrofiler&prekursorer i BM ≥20% monocyter&prekursorer i BM Ibland hög monocytos i PB Flera olika populationer CD13, CD33, CD65, CD15 CD14, CD4, CD36, CD64 CD34, CD117, HLA-DR Ospecifikt esteras Akut monoblastisk och akut monocytisk leukemi <5% av AML 80% monocytär differentiering monoblaster, promonocyter och Monocyter CD13, CD33++, CD15, CD65 CD14, CD4, CD11b, CD11c, CD64, CD36, HLA-DR CD7 och CD56 (25-40%) Ofta CD34 negativa Akut monoblastisk leukemi M5a bm Akut monocytleukemi M5b Ospecifikt esteras Akut erytroid leukemi “Pure erythroid leukemia” Saknar vanligtvis Myeloiska markörer och MPO, CD34 och HLA-DR Glycophorin A, CD71, CD36 CD117 positiva Skilj från MDS-EB! Akut megakaryoblast leukemi CD34, CD45, HLA-DR, MPO negativa CD36, CD61, CD41, CD42 CD7 aberrant Myelosarkom (klorom, granulocytisk sarkom) • Tumör bestående av myeloiska blaster utan/med utmognad som växer utanför BM. • Förekomst av blastansamlingar i t ex lever hos AML-patienter räknas ej • (det måste finnas en tumör, med utplånad grundstruktur). • Kan förekomma: - de novo (ingen AML i BM) - som första symtom/tecken till relaps av AML - som transformation av MDS, MPN, MDS/MPN. Immunfenotypning är viktigast för att kunna skilja AML och ALL, mellan ”prekursor” och ”mogna” maligniteter av lymfoidt ursprung samt om B- eller Tcellsfenotyp Immunfenotypning • Blastcellernas ytegenskaper kan studeras med monoklonala antikroppar mot cellytantigen kopplade till fluorescerande ämne Flödescytometer FACS=fluorescens activated cell sorting Inmärkning ska ske inom 24 tim Cellsuspension och antikroppar blandas och inkuberas (10 min) •Erytrocyter lyseras (10 min) •Centrifugering, leukocyter i botten (5 min) •Dekantering •PBS tillsätts •Centrifugering (5 min) Fluorescensmärkta antikroppar •Dekantering •Tillsätt 250-500 µl PBS Antikroppar • Binder till yt- eller intracellulära antigen •De flesta CD numrerade •Konjugerade med olika fluorokromer • Membran antigen • Nukleära antigen • Cytoplasmatiska antigen • Permeabilisering av membran för intracellulära antigen Dotplot FSC/SSC Granulo cyt Relativa storlek – Forward Scatter (FSC) Monoc yt Granulering eller inre kompexitet – Side Scatter (SSC) Relativa fluorescens intensitet Lymfoc yt Fluorescens intensitet Screeningrör på alla prov, ger en översikt på celltyper i provet granulocyter CD 34 omogna celler CD7 T-celler CD14 monocyter CD19 B-celler CD36 + 45erytropoes Fenotyper • Linjespecifika markörer: • cytCD3 eller mCD3 • CD19+ minst en markör starkt: CD79a, cytCD22, CD10 eller CD19 svagt +två starkt uttryckta CD79a, cCD22 eller CD10 • MPO (myeloperoxidas) eller minst 2 av: NSE, CD11c, CD14, CD64, lysozyme AUL (akut odifferentierad leukemi; stamcellsleukemi) • Saknar helt linjespecifika markörer: MPO, NSE, CD19, cCD22, cCD79a, cCD3 Få markörer: CD34, CD38, HLA-DR, TdT ”Aberrant fenotyp” • CD13, CD33 vanligt hos B-ALL (Ph+ eller t(12;21). • CD15 B-ALL med MLL rearrangemang • CD13, CD33, CD117 kan finnas hos TALL • cytCD3dim, CD7, CD19dim, TdT vid AML MPAL (mixed phenotype acute leukemia) • MPAL med t(9;22)(q34;q11.2): BCR-ABL1 • MPAL med t(v;11q23.3);MLL rearrangemang • MPAL B/myeloid NOS • MPAL T/myeloid NOS 7 månader flicka med anemi Hb 67g/L och LPK 15 där man sett blaster i blodet Blastceller ca 67% CD45dim, CD33+, CD13het, CD64+, DR+ CD34-, CD117-, CD14-, CD36sub Blastceller negativa för MPO och cCD3, population ca 11% CD19/NG2 pos ?? Nytt prov efter 5 dag: blaster 25% med monocytoid fenotyp Blaster 65% CD19/CD34het pos CD19, CD34het, CD38++, CD123+, CD10-, TdT-, CD20-, CD22dim Differentialdiagnoser”blaster i blod” • • • • ALL LGL PLL Leukemiserade lymfom KLL, mantelcellslymfom, Burkitt, FL, DLBCL, PTCL, ALCL