MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD71/FITC
Anti-Human CD235a/RPE
Anti-Human CD45/APC
kodnummer TC675
Avsedd användning
För in vitro-diagnostik.
TC675 är avsedd för användning vid flödescytometri. Reagensen är avsedd för användning vid identifiering av
celler som uttrycker CD71, CD235a och CD45.
CD71 är en receptor för transferrin. I normala vävnader ses hög expression av CD71 i erytroidföregångare och
hemoglobinsyntetiserande retikulocyter (1), men expressionen saknas i mogna erytrocyter (2). Aktiverade, men
inte vilande, lymfocyter, uttrycker CD71 (2). Proliferationsstatusen i både normala och neoplastiska celler
motsvarar CD71-expression (3). Anti-CD71 anses, tillsammans med en panel av andra antikroppar, vara
relevant för den initiala bedömningen av akut leukemi av erytroidursprung (4).
CD235a (glykoforin A) uttrycks på erytroida celler, med början i morfologiskt igenkännbara erytroidföregångare,
precis efter CFU-E-stadiet, till den mogna erytrocyten. När CD235a väl uttrycks maximalt, förblir mängden i
varje erytroida cell konstant och verkar inte förändras under vidare mognad (5). Vid huvuddelen av
erytroleukemifallen uttrycks CD235a på neoplastiska erytroblaster, medan CD235a endast mycket sällan
uttrycks vid akut myeloid leukemi och akut lymfoblastisk leukemi (6).
CD45 är en av de vanligaste leukocytcellytsglykoproteinerna och uttrycks enbart på celler i det hematopoetiska
systemet samt deras föregångare (7). Anti-CD45 anses vara väsentlig för den initiala bedömningen av kroniska
lymfoproliferativa sjukdomar och akuta leukemier tillsammans med en panel av andra antikroppar (8).
Tolkning av resultaten måste göras av kvalificerad specialist inom ramen för patientens anamnes och andra
diagnostiska tester.
Medföljande reagens
TC675 innefattar följande tre matchande fluorescerande antikroppar:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD71, Clone Ber-T9, konjugerad med fluoresceinisotiocyanatisomer 1 (FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD235a, Glykoforin A, klon JC159, konjugerad med R-fykoerytrin (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, klon 2D1, konjugerad med allofykocyanin (APC).
De tre konjugaterna i TC675 har framställts från renade, monoklonala musantikroppar av isotyp IgG1, kappa.
TC675 levereras i flytande form i buffert innehållande 1 % bovint serumalbumin (BSA) och 15 mmol/L NaN 3,
pH 7,2. Varje flaska innehåller 50 tester (20 µL konjugat för upp till 106 leukocyter från normalt, humant perifert
blod).
Specificitet
Anti-CD71, Ber-T9, ingick i the Fifth International Workshop and Conference on Human Leucocyte
Differentiation Antigens (den femte internationella workshopen och konferensen om humana
leukocytdifferentieringsantigener) och undersökningar på olika laboratorier har bekräftat dess reaktivitet med
CD71 (9).
Anti-CD235a, JC159 märker starkt normala erytroida celler vid alla differentieringsstadier, från erytroblasten till
den mogna röda cellen (6).
Anti-CD45, 2D1, ingick i the Third International Workshops and Conferences on Human Leucocyte
Differentiation Antigens (den tredje internationella workshopen och konferensen om humana
leukocytdifferentieringsantigener) och undersökningar på olika laboratorier har bekräftat dess reaktivitet med
CD45 (10). Antikroppsklonen kallades anti-Hle-1 (10).
Försiktighetsåtgärder
1. För yrkesmässigt bruk.
2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form.
I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och
kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte
metallazider ackumuleras i avloppet.
3. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering.
Förvaring
Förvaras i mörker i 2–8 °C. Får ej användas efter det utgångsdatum som finns tryckt på flaskan. Användaren
måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från vad som specificerats. Det finns inga tydliga tecken
som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller analyseras samtidigt
med patientproverna. Kontakta Dako Technical Services om oväntad färgning observeras, som inte kan
förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna, eller om det misstänks vara något problem med reagensen.
Färgningsprocedur
Eftersom anti-CD235a reagerar med erytrocyter måste erytrocyter avlägsnas före färgning med TC675.
(113859-002)
1.
Överför 100 µL antikoagulerat (EDTA) blod till ett 12 mm x 75 mm provrör av polystyren.
2.
Lysera erytrocyterna efter steg 3–5, eller isolera
densitetsgradientcentrifugering och fortsätt från steg 6.
3.
Tillsätt 100 µL Uti-Lyse™ Reagent A (Dako, kodnummer S3325) till röret och blanda försiktigt med en
vortexblandare. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur i mörker.
alternativt
mononukleära
celler
med
TC675/SE/SSA/06.09.05 s.1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
4.
Tillsätt 1 mL Uti-Lyse™ Reagent B (Dako, kodnummer S3325) till röret och blanda försiktigt med en
vortexblandare. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur i mörker.
5.
Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar
cirka 50 µL vätska.
6.
Tillsätt 20 µL TC675 och blanda försiktigt med en vortexblandare.
7.
Inkubera röret i mörker i 2–8 °C i 30 minuter eller i rumstemperatur (20–25 °C) i 15–30 minuter.
8.
Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar
cirka 50 µL vätska.
9.
Tillsätt 2 mL PBS (Dako, kodnummer S3024) till röret och återsuspendera cellerna med en
vortexblandare.
10.
Upprepa steg 8.
11.
Återsuspendera cellerna i en lämplig vätska för flödescytometri, t.ex. 0,3 mL PBS.
12.
Analysera provet med flödescytometer eller förvara det i 2–8 °C i mörker tills analysen ska utföras.
Prover ska analyseras inom 24 timmar efter färgning.
Observera att fluorokromkonjugater är ljuskänsliga. Proverna bör skyddas från ljus under färgningsproceduren och
tills analysen ska utföras.
Proceduranmärkningar
Steg 1: Det är valfritt att inkludera ett lämpligt positivt och negativt kontrollprov i varje körning för reagens- och
beredningskontroll.
Steg 6: Den rekommenderade konjugatvolymen är endast en riktlinje. Optimala förhållanden kan variera beroende
på prov- och beredningsmetod och bör bestämmas av varje enskilt laboratorium.
Det är valfritt att inkludera ett provrör med kontrollreagens. Kontrollreagensen bör överensstämma med den
konjugerade antikroppsreagensen. Rekommenderat Triple-Colour Control Reagent för TC675 är Dako kodnummer
X0978.
Steg 12: Onormalt antal celler som uttrycker målantigen eller celler som visar avvikande uttrycksnivåer av
antigen kan förväntas vid vissa sjukdomstillstånd. Detta kan leda till ett förändrat färgningsmönster. Det är viktigt
att förstå det normala uttrycksmönstret för en antigen och dess förhållande till uttryck av andra relevanta antigener
för att utföra lämplig analys.
Flerfärgade reagenser föredras framför enkelfärgade reagenser för den omfattande analysen av
flödescytometriprover. Korrekt användning av färgersättning är speciellt viktig vid flerfärgsanalys. Kombinationen av
FITC, RPE och APC är speciellt lätta att arbeta med eftersom den spektrala överlappningen i emissionsspektra för
dessa fluorokromer är minimal.
Referenser
(113859-002)
1.
Goding J. CD71. CD Guide. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin C, Clark E, et al.,
editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th International
Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford University
Press Inc.; 2002. p. 823-4.
2.
Sutherland R, Delia D, Schneider C, Newman R, Kemshead J, Greaves M. Ubiquitous cell-surface
glycoprotein on tumor cells is proliferation-associated receptor for transferrin. Proc Natl Acad Sci (USA)
1981;78:4515-9.
3.
Newman R, Schneider C, Sutherland R, Vodinelich L, Greaves M. The transferrin receptor. [Review].
Trends Biochem Sci 1982;1:397-400.
4.
Basso G, Buldini B, De Zen L, Orfao A. New methodologic approaches for immunophenotyping acute
leukemias. Haematologica 2001;86:675-92.
5.
Loken MR, Shah VO, Dattilio KL, Civin CI. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal
erythroid development. Blood 1987;69:255-63.
6.
Erber WN, McLachlan J, Cordell JL, Turley H, Reid M, Mason DY. A new monoclonal antibody (JC159)
that detects glycophorin A for the diagnosis of erythroleukaemia. Hematol Rev 1991;5:113-20.
7.
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London:
Greenwich Medical Media Ltd.; 2003. p. 121-4.
8.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
9.
Boeker M, Werfel T. AA12.1. Binding of activation antigen panel mAb to mononuclear cells after antigenspecific stimulation in vitro. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto
C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th
International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press; 1995. p. 1181-2.
10.
Cobbold S, Hale G, Waldmann H. Non-lineage, LFA-1 family, and leucocyte common antigens: new and
previously defined clusters. In: McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch
FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd
International Workshop and Conference; 1986 Sep 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1987. p. 788-803.
TC675/SE/SSA/06.09.05 s.2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Förklaring av symboler
(113859-002)
Katalognummer
Temperaturbegränsning
Använd före
In vitro diagnostisk medicinsk
apparat
Får ej förvaras i solljus (se
avsnittet om förvaring)
Tillverkare
Läs instruktionerna för
användning
Batchkod
TC675/SE/SSA/06.09.05 s.3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
