MultiMix™
Dual-Colour Reagent
Anti-Human Kappa Light Chains/FITC
Anti-Human CD19/RPE
Kod nr. FR048
Avsedd användning
För diagnostisk användning in vitro.
FR048 är avsedd för användning i flödescytometri för samtidig upptäckt och räkning av kappa light chains på
humana B-celler. Vid flödescytometri är antikroppar mot kappa light chains användbara för påvisandet av
kappa light chains på cellytan och således för identifiering av monoklonalitet (klonalt överskott) vid Bcellslymfoproliferativa sjukdomar tillsammans med en panel av andra antikroppar (1-4). CD19 är den bredaste
utvecklingsspecifika ytmarkören för B-celler och den finns närvarande på ytan hos praktiskt taget alla Blymfocyter, inklusive tidiga B-progenitorceller (5). CD19-uttrycket bibehålls i B-utvecklingsceller som har
genomgått neoplastisk transformation (6). Antikroppar till CD19 anses väsentliga för den initiala utvärderingen
av akuta och kroniska lymfoproliferativa sjukdomar (7). Tolkning måste göras av kvalificerad specialist inom
ramen för patientens anamnes och andra diagnostiska tester.
Ingående reagenser
FR048 omfattar följande två, noggrant matchade fluorescerande antikroppar:
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains konjugerade med FITC (fluorescein isotiocyanatisomer 1).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD19, Clone HD37, konjugerad med RPE (R-phycoerythrin).
De två konjugaten i FR048, Anti-Kappa Light Chains och Anti-CD19, har producerats av F(ab')2-fragment av
affinitetsisolerad polyklonal kaninantikropp respektive renad monoklonal musantikropp av isotyp IgG1, kappa.
FR048 levereras i vätskeform i en buffert innehållande 1% bovinserumalbumin (BSA) och 15 mmol/L NaN 3,
pH 7,2. Varje flaska innehåller 50 tester (10 L konjugat för upp till 106 leukocyter från normalt humant perifert
blod).
Immunogener
Antikroppskod nr.
Fluorokrom
Kontroll reagens
kod nr.
FR048
FITC och RPE
X0952
Anti-Kappa Light Chains: Polyklonala immunoglobulin light chains av kappa-typ isolerade från en pool av
human sera.
Anti-CD19, HD37: Hårcellsleukemiceller.
Specificitet
Anti-Kappa Light Chains reagerar med fria kappa chains liksom också kappa chains i intakta
immunoglobulinmolekyler. Specificiteten har fastställts enligt beskrivning nedan. För att erhålla maximal
sensitivitet utfördes specificitetstestet crossed immunoelektrofores, före affinitetsreningen och
pepsinnedbrytningen.
Crossed immunoelectrophoresis: Endast kappa-relaterade precipitat framträder när antikroppen körs mot
humanplasma. Färgning: Coomassie Brilliant Blue.
Flödescytometri: När anti-Kappa light chains används, som beskrivits i färgningsproceduren i kombination med
Anti-CD19/RPE, HD37, på lyserat humant helblod, syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva Blymfocyterna motsvarande det förväntade intervallet av kappa light chain-uttryck.
Flödescytometrisk analys av enkla cellsuspensioner från formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsprover visade
att anti-Kappa light chains märker reaktiva hyperplastiska lymfnoder (10/10 fall). Vid icke-Hodgkins lymfom märkte
antikroppen 4/10 fall. De återstående fallen var positiva för lambda light chains (5/10 fall) eller visade inte något
uttryck av light chains (1/10 fall) (4).
Flödescytometrianalys av perifera blodlymfocyter visade att anti-kappa light chains märkte en del kroniska Bcellslymfatiska leukemier. Därför var, i en studie av 121 fall (2), 37 positiva för kappa. I en annan studie av 165 fall
(3) var 97 positiva för kappa.
Anti-CD19, HD37, ingick i de Second, Third, Fourth and Fifth International Workshops and Conferences on Human
Leucocyte Differentiation Antigens studier av ett antal laboratorier bekräftade dess reaktivitet med CD19 (8). AntiCD19, HD37 färgar humana B-celler i perifert blod, benmärg och annan vävnad. Dessutom gav Bcellslymfoproliferativa sjukdomar positiva reaktioner med antikroppen, dvs. akut lymfoblastisk leukemi, kronisk
lymfocytisk leukemi, hårcellsleukemi, lymfoblastiskt lymfom (typ Burkitt), centroblastisk/centrocytisk lymfom och
diffust non-Hodgkins lymfom. Antikroppen har visats vara oreaktiv med andra celler i det humana hematopoetiska
systemet och reagerade inte med icke-hematopoetiska celler, t.ex. i njure, lever, bröst- eller lungvävnader (8).
Anvisningar
och försiktighetsåtgärder
1. För professionella användare.
2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN3), en kemikalie som är synnerligen toxisk i ren form. I
produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och
kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det slås bort för att
förhindra att metallazider byggs upp i avloppet.
3. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs korrekt hantering.
Förvaring
(103599-003)
Förvaras mörkt och vid 2 – 8C. Använd inte efter det utgångsdatum som är angivet på flaskan. Om
reagenserna förvaras i annorlunda miljö än de specificerade, måste konditionen verifieras av användaren. Det
FR048/SE/MTH/31.01.05 s 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa
kontroller köras samtidigt med patientprover. Kontakta vår tekniska support om oväntad färgning observeras
som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och det misstänks vara något problem med
antikroppen.
Färgningsprocedur
Före färgning av prover av perifert blod måste de mononukleära cellerna isoleras med centrifugering på ett
separationsmedium eller tvättas för att avlägsna de lösliga serumproteinerna. Eftersom humana monocyter
binder till serumimmunoglobuliner via deras Fc-ytreceptorer bör dessa celler avlägsnas genom tömning eller
identifieras.
1.
Överför 100 µL antikoagulerat (EDTA) blod till ett 12 mm x 75 mm provrör av polystyren.
2.
Tillsätt 2 mL PBS (Dako, kodnr. S3024). Blanda försiktigt med en vortexblandare.
3.
Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar
cirka 50 µL vätska.
4.
Upprepa steg 2 och 3 två gånger till.
5.
Tillsätt 10 µL Rabbit Immunoglobulin Fraction (Dako, kodnr. X0903) för blockering. Blanda försiktigt med
en vortexblandare och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
6.
Tillsätt 10 µL FR048 och blanda försiktigt med en vortexblandare.
7.
Inkubera i mörker vid 2–8 °C i 30 minuter eller vid rumstemperatur (20–25 °C) i 15–30 minuter.
8.
Tillsätt 100 mL Uti-Lyse™ Reagent A (Dako, kodnr. S3325) till varje prov och blanda försiktigt med en
vortexblandare. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
9.
Tillsätt 1 mL Uti-Lyse™ Reagent B (Dako, kodnr. S3325) till varje prov och blanda försiktigt med en
vortexblandare. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
10.
Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar
cirka 50 µL vätska.
11.
Tillsätt 2 mL PBS till varje prov och resuspendera cellerna med en vortexblandare.
12.
Upprepa steg 10.
13.
Resuspendera cellerna i lämplig vätska för flödescytometri, t.ex. 0,3 mL PBS.
14.
Analysera med flödescytometer eller förvara vid 2-8 °C i mörker tills analysen ska utföras. Prover kan
analyseras inom 24 timmar efter färgning.
Observera att fluorokromkonjugater är ljuskänsliga. Proverna bör skyddas från ljus under färgningsproceduren och
tills analysen ska utföras.
Proceduranmärkningar
Steg 1: Det är valfritt att inkludera ett lämpligt positivt och negativt kontrollprov i varje körning för reagens- och
beredningskontroll.
Steg 6: Den rekommenderade konjugatvolymen är endast en riktlinje. Optimala förhållanden kan variera beroende
på prov- och beredningsmetod och bör bestämmas av varje enskilt laboratorium.
Det är valfritt att inkludera ett provrör med kontrollreagens. Kontrollreagenset bör överensstämma med det
konjugerade antikroppsreagenset. Det rekommenderade Dual-Colour Control Reagent för FR048 är Dako kodnr.
X0952.
Steg 8 och 9: Om ett annat cellyseringsreagens används, skall rekommendationerna för detta reagens följas.
Observera att om det alternativa lyseringsreagenset inte innehåller fixativ, t.ex. Dako EasyLyse™, kodnr.
S2364, ska PBS i steg 13 innehålla 1 % paraformaldehyd såvida inte provet analyseras inom samma tidsram
som rekommenderas för lyseringsreagenset.
Steg 14: Onormalt antal celler som uttrycker målantigen eller celler som visar avvikande uttrycksnivåer av antigen
kan förväntas vid vissa sjukdomstillstånd. Detta kan resultera i ett förändrat färgningsmönster. Det är viktigt att
förstå det normala uttrycksmönstret för antigen och dess förhållande till uttryck av andra relevanta antigener för att
utföra lämplig analys.
Flerfärgade reagenser föredras framför enkelfärgade reagenser för den omfattande analysen
flödescytometriprover. Den korrekta användningen av färgersättning är speciellt viktig vid flerfärgsanalys.
Referenser
(103599-003)
av
1.
Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and
pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95.
2.
Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell
chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916.
3.
Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic
characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
4.
Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of
lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional
diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7.
5.
Pezzutto A, Dörken B, Rabinovitch PS, Ledbetter JA, Moldenhauer G, Clark EA. CD19 monoclonal
antibody HD37 inhibits anti-immunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J Immunol
1987;138:2793-9.
6.
Sato S, Tedder TF. BC3. CD19 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG,
Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 133-5.
FR048/SE/MTH/31.01.05 s 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
7.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
8.
Mason DY, Ladyman H, Gatter KC. Immunohistochemical analysis of monoclonal anti-B cell antibodies.
In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the
2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston,
USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 245-55.
Förklaring av symboler
(103599-003)
Katalognummer
Temperaturbegränsning
Använd före
In vitro diagnostisk medicinsk
apparat
Skydda från solljus
(se förvaringsavsnittet)
Tillverkare
Läs instruktionerna för
användning
Batchkod
FR048/SE/MTH/31.01.05 s 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17