MultiMix™ Triple-Colour Reagent Anti-Human Kappa Light Chains/FITC Anti-Human Lambda Light Chains/RPE Anti-Human CD19/RPE-Cy5 Kod nr. TC051 Avsedd användning För diagnostisk användning in vitro. TC051 är avsedd för användning inom flödescytometri för simultan detektering och beräkning av kappa light chains och lambda light chains på humana B-celler. I flödescytometri är antikroppar till kappa light chains användbara för att påvisa kappa light chains på cellytan och antikroppar till lambda light chains för att påvisa lambda light chains på cellytan och således för identifiering av monoklonalitet (klonalt överskott) i B-cells lymfoproliferativa sjukdomar tillsammans med en panel av andra antikroppar (1-4). CD19 är den bredaste utvecklingsspecifika ytmarkören för B-celler och den finns närvarande på ytan hos praktiskt taget alla Blymfocyter, inklusive tidiga B-progenitorceller (5). CD19-uttrycket bibehålls i B-utvecklingsceller som har genomgått neoplastisk transformation (6). Antikroppar till CD19 anses väsentliga för den initiala utvärderingen av akuta och kroniska lymfoproliferativa sjukdomar (7). Tolkning måste göras av kvalificerad specialist inom ramen för patientens anamnes och andra diagnostiska tester. Ingående reagenser TC051 består av de följande tre, noggrant matchade fluorescenta antikroppar: Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains konjugerade med FITC (fluorescein isotiocyanatisomer 1). Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains, konjugerad med RPE (R-phycoerythrin). Monoclonal Mouse Anti-Human CD19, klon HD37, konjugerad med RPE-Cy5 (R-phycoerythrin-Cyanine 5). Anti-Kappa Light Chains-konjugaten har producerats av F(ab')2-fragment av affinitetsisolerad polyklonal kaninantikropp. Anti-Lambda Light Chains-konjugaten har producerats av F(ab')2-fragment av affinitetsisolerad polyklonal kaninantikropp. Anti-CD19-konjugatet har producerats från renad monoklonal musantikropp. TC051 levereras i vätskeform i en buffert innehållande 1% bovinserumalbumin (BSA) och 15 mmol/L NaN 3, pH 7,2. Varje flaska innehåller 50 tester (10 µL konjugat för upp till 10 6 leukocyter från normalt humant perifert blod). Immunogener Antikroppskod nr. Fluorokrom Kontroll reagens kod nr. TC051 FITC, RPE och RPE-Cy5 X0957 Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains: Polyklonala immunoglobulin light chains av kappa-typ isolerade från en pool av human sera. Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains: Polyklonala immunoglobulin light chains av lambdatyp isolerade från en pool av humana sera. Anti-CD19, klon HD37: Hårcellsleukemiceller. Specificitet Anti-Kappa Light Chains: Reagerar med fria kappa chains såväl som kappa chains i intakta immunoglobulinmolekyler. Specificiteten har fastställts enligt beskrivning nedan. För att erhålla maximal sensitivitet utfördes specificitetstestet crossed immunoelektrofores, före affinitetsreningen och pepsinnedbrytningen. Crossed immunoelectrophoresis: Endast kappa-relaterade precipitat framträder när antikroppen körs mot humanplasma. Färgning: Coomassie Brilliant Blue. Flödescytometri: När anti-Kappa light chains/FITC används, som beskrivits i färgningsproceduren i kombination med Anti-CD19/RPE, HD37, på lyserat humant helblod, syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva Blymfocyterna motsvarande det förväntade intervallet av kappa light chain-uttryck. Anti-Lambda Light Chains: Reagerar med såväl fria lambda-kedjor som lambda-kedjor i intakta immunoglobulinmolekyler. Specificiteten har fastställts enligt beskrivning nedan. För att erhålla maximal sensitivitet utfördes specificitetstestet crossed immunoelektrofores, före affinitetsreningen och pepsinnedbrytningen. Crossed immunoelectrophoresis: Endast lambda-relaterade precipitat framträder när antikroppen körs mot humanplasma. Färgning: Coomassie Brilliant Blue. Flödescytometri: När anti-lambda light chains används, som beskrivits i färgningsproceduren i kombination med Anti-CD19/FITC, HD37, på lyserat humant helblod, syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva Blymfocyterna motsvarande det förväntade intervallet av lambda light chain-uttryck. Flödescytometrisk analys av enskilda suspensioner från formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsprover visade att anti-lambda light chains märker reaktiva hyperplastiska lymfnoder, vilket också är fallet för anti-kappa light chains (10/10 fall). Vid icke-Hodgkins lymfom märkte antikroppen 5/10 fall. De återstående fallen var positiva för kappa light chains (4/10 fall) eller visade inte något uttryck av light chains (1/10 fall) (4). Flödescytometrisk analys av perifera blodlymfocyter visade att anti-kappa light chains respektive anti-lambda light chains märker en andel av B-cells kroniska lymfocytiska leukemier. Sålunda, i en studie av 121 fall (2) var 37 positiva för kappa och 17 positiva för lambda. I en annan studie av 165 fall (3) var 97 positiva för kappa och 68 positiva för lambda. Anti-CD19, HD37: Ingick i den Second, Third, Fourth and Fifth International Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens och studier utförda av ett antal laboratorier bekräftade dess reaktivitet (105360-003) TC051/SE/MTH/09.03.05 s. 1/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17 med CD19 (8). Anti-CD19, HD37 färgar humana B-celler i perifert blod, benmärg och annan vävnad. Dessutom gav B-cellslymfoproliferativa sjukdomar positiva reaktioner med antikroppen, dvs. akut lymfoblastisk leukemi, kronisk lymfocytisk leukemi, hårcellsleukemi, lymfoblastiskt lymfom (typ Burkitt), centroblastisk/centrocytisk lymfom och diffust non-Hodgkins lymfom. Antikroppen har visats vara oreaktiv med andra celler i det humana hematopoetiska systemet och reagerade inte med icke-hematopoetiska celler, t.ex. i njure, lever, bröst- eller lungvävnader (8). TC051, Flödescytometri: När TC051 appliceras så som beskrivs i färgningsproceduren på lyserat humant helblod syns en specifik färgning av en del av de CD19-positiva B-cellslymfocyterna inom det förväntade intervallet för kappa och lambda light chain uttrycket. Anvisningar och försiktighetsåtgärder 1. För professionella användare. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN3), en kemikalie som är synnerligen toxisk i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det slås bort för att förhindra att metallazider byggs upp i avloppet. 3. Som med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta procedurer användas vid hanteringen. Förvaring Förvaras mörkt vid 2-8 oC. Använd inte efter utgångsdatum som är angivet på flaskan. Om reagenserna förvaras i annan miljö än de specificerade, måste förhållandena verifieras av användaren. Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos denna produkt. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt med patientprover. Kontakta vår tekniska support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara något problem med antikroppen. Produktspecifika begränsningar Det har observerats att RPE-Cy5-konjugat kan binda till monocyter och resultera i bakgrundsfärgning (9). Färgningsprocedur Före färgning av prover av perifert blod måste de mononukleära cellerna isoleras med centrifugering på ett separationsmedium eller tvättas för att avlägsna de lösliga serumproteinerna. Eftersom humana monocyter binder till serumimmunoglobuliner via deras Fc-ytreceptorer bör dessa celler avlägsnas genom tömning eller identifieras. 1. Överför 100 µL antikoagulerat (EDTA) blod till ett 12 mm x 75 mm provrör av polystyren. 2. Tillsätt 2 mL PBS (Dako, kodnr. S3024). Blanda försiktigt med en vortexblandare. 3. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar cirka 50 µL vätska. 4. Upprepa steg 2 och 3 två gånger till. 5. Tillsätt 10 µL Rabbit Immunoglobulin Fraction (Dako, kodnr. X0903) för blockering. Blanda försiktigt med en vortexblandare och inkubera vid 37 °C i 30 minuter. 6. Tillsätt 10 µL TC051 och blanda försiktigt med en vortexblandare. 7. Inkubera i mörker vid 2–8 °C i 30 minuter eller vid rumstemperatur (20–25 °C) i 15–30 minuter. 8. Tillsätt 100 mL Uti-Lyse™ Reagent A (Dako, kodnr. S3325) till varje prov och blanda försiktigt med en vortexblandare. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker. 9. Tillsätt 1 mL Uti-Lyse™ Reagent B (Dako, kodnr. S3325) till varje prov och blanda försiktigt med en vortexblandare. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker. 10. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten försiktigt och kassera den, men lämna kvar cirka 50 µL vätska. 11. Tillsätt 2 mL PBS till varje prov och resuspendera cellerna med en vortexblandare. 12. Upprepa steg 10. 13. Resuspendera cellerna i lämplig vätska för flödescytometri, t.ex. 0,3 mL PBS. 14. Analysera med flödescytometer eller förvara vid 2-8 °C i mörker tills analysen ska utföras. Prover kan analyseras inom 24 timmar efter färgning. Observera att fluorokromkonjugater är ljuskänsliga. Proverna bör skyddas från ljus under färgningsproceduren och tills analysen ska utföras. Proceduranmärkningar Steg 1: Det är valfritt att inkludera ett lämpligt positivt och negativt kontrollprov i varje körning för reagens- och beredningskontroll. Steg 6: Den rekommenderade konjugatvolymen är endast en riktlinje. Optimala förhållanden kan variera beroende på prov- och beredningsmetod och bör bestämmas av varje enskilt laboratorium. Det är valfritt att inkludera ett provrör med kontrollreagens. Kontrollreagenset bör överensstämma med det konjugerade antikroppsreagenset. Det rekommenderade Triple-Colour Control Reagent för TC051 är Dako kodnr. X0957. Steg 8 och 9: Om ett annat cellyseringsreagens används, skall rekommendationerna för detta reagens följas. Observera att om det alternativa lyseringsreagenset inte innehåller fixativ, t.ex. Dako EasyLyse™, kodnr. S2364, ska PBS i steg 13 innehålla 1 % paraformaldehyd såvida inte provet analyseras inom samma tidsram som rekommenderas för lyseringsreagenset. Steg 14: Onormalt antal celler som uttrycker målantigen eller celler som visar avvikande uttrycksnivåer av antigen kan förväntas vid vissa sjukdomstillstånd. Detta kan resultera i ett förändrat färgningsmönster. Det är viktigt att förstå det normala uttrycksmönstret för antigen och dess förhållande till uttryck av andra relevanta antigener för att utföra lämplig analys. Flerfärgade reagenser föredras framför enkelfärgade reagenser för den omfattande analysen flödescytometriprover. Den korrekta användningen av färgersättning är speciellt viktig vid flerfärgsanalys. (105360-003) av TC051/SE/MTH/09.03.05 s. 2/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17 Referenser 1. Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95. 2. Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916. 3. Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica 1993;78:18-24. 4. Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7. 5. Pezzutto A, Dörken B, Rabinovitch PS, Ledbetter JA, Moldenhauer G, Clark EA. CD19 monoclonal antibody HD37 inhibits anti-immunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J Immunol 1987;138:2793-9. 6. Sato S, Tedder TF. BC3. CD19 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 133-5. 7. Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7. 8. Mason DY, Ladyman H, Gatter KC. Immunohistochemical analysis of monoclonal anti-B cell antibodies. In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 245-55. 9. van Vugt MJ, van den Herik-Oudijk IE, van de Winkle JGJ. Binding of PE-CY5 conjugates to the human high-affinity receptor for IgG (CD64). Blood 1996;88:2358-61. Förklaring av symboler (105360-003) Katalognummer Temperaturbegränsning Använd före In vitro diagnostisk medicinsk apparat Skydda från solljus (se förvaringsavsnittet) Tillverkare Läs instruktionerna för användning Batchkod TC051/SE/MTH/09.03.05 s. 3/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17