Artificiella antikroppar mot biopolymerer (t.ex. proteiner) och biopartiklar
(t.ex. virus och celler, inkluderande bakterier)
Stellan Hjertén Institutionen för
naturvetenskaplig biokemi och organisk
kemi, Biomedicinskt Centrum, Box 576
751 23 Uppsala
Projekt: 18/04
Inledning
Vad utmärker en antikropp? En antikropp är ett protein, som har den unika egenskapen att
spontant fästa sig vid en viss substans, men i idealfallet inte till andra substanser.
Antikropparna får man genom att injicera denna substans, kallad antigen, i ett försöksdjur.
Eftersom antigenet ej tillhör djurets egen uppsättning av proteiner uppfattas det som
främmande (obehagligt), varför djuret vill oskadliggöra det, vilket det gör genom att tillverka
en antikropp (ett protein) med egenskapen att binda sig till det främmande ämnet och om
möjligt på så sätt neutralisera det främmande ämnets negativa konsekvenser för djuret. Efter
några veckor då halten av antikropparna är hög tappas djuret på blod, från vilket
antikropparna isoleras för en rad olika applikationer, t. ex. (1) som vaccin mot olika
sjukdomar, (2) för att spåra ett antigen (biomarkör) som ändrar sin koncentration vid en
sjukdom, t. ex. en viss typ av cancer och sedan bestämma koncentrationen av detta
markörprotein, (3) för att fastlägga koncentrationen av en viss cellkomponent, ett ofta
återkommande problem inom många biovetenskaper, etc. Dessa och flera liknande tester är
mycket vanliga och antalet försöksdjur, som användes är följaktligen mycket stort. Det
faktum att testerna är mycket enkla bidrar naturligtvis till populariteten. Vid sjukhusanalyser
tar man ett blodprov från patienten och centrifugerar bort blodkroppama. Till återstoden sätter
man antikroppen till det protein, som produceras i relativt stor mängd vid den sjukdom man
misstänker att patienten har. Ju högre koncentrationen av komplexet antigen/antikropp är,
desto större är halten också av antigenet, dvs av markörproteinet för sjukdomen. Denna
koncentrationsbestämning användes sedan för att fastställa diagnosen.
Den ovan skisserade användningen av proteinantikroppar för selektiv bestämning av halten
av en viss substans har uppenbara fördelar och är därför mycket populär. Nackdelarna är att
(1) försöksdjur måste utnyttjas med de etiska problem detta medför, (2) metoden ur
ekonomisk synpunkt är kostsam, (3) framställningen av en proteinantikropp tar flera veckor,
vilket inte bara kan vara plågsamt för försöksdjuret, utan även försinkar många planerade
försök, (4) dessa antikroppar är av proteinnatur och därför lätt förlorar sin aktivitet, (5)
proteinantikroppar ej kan skapas mot nativa virus och celler t. ex. bakterier, sporer, etc.
eftersom dessa bryts ned metaboliskt i försöksdjuret.
Tillverkningen av artificiella antikroppar. En vattenlösning av s. k. monomerer blandas med
en vattenlösning av antigenet. Monomererna får sedan reagera med varandra och bildar då ett
nätverk i form av en gel (ge1é) i vilken antigenmolekylema, t. ex. proteiner, är inneslutna. Då
antigenmolekylerna tvättats bort lämnar de hålrum, vilkas form överensstämmer med formen
på denna antigenmolekyl, d.v.s. en formselektivitet har skapats. Inga andra molekyler passar
exakt in i denna hålighet. Den täta kontakten mellan antigenet och hålighetens vägg gör att
bindningar skapas mellan dem, d.v.s. vi får även en bindningsselektivitet. Ju fler typer av
oberoende selektiviteter vi introducerar, desto högre blir den totala selektiviteten och desto
mindre strukturella skillnader mellan två antigener kan vi detektera, vilket ju är ett av syftena
med vårt forskningsprojekt (Syfte c, nedan).
1
Det bör observeras att syntesmetoden är universell i den bemärkelsen, att den kan envändas
för både proteiner, virus och celler och säkerligen också för många andra typer av polymerer
och partiklar. Man behöver alltså inte lägga ner arbete på modifiering av vår metod för varje
nytt antigen.
Det övergripande syftet med vårt projekt är, att (a) utveckla en method där alla de ovan
beskrivna nackdelarna har eliminerats, (b) finna enkla metoder för att detektera antigenet, (c)
ytterligare öka den redan nu höga selektiviteten, (d) visa den praktiska användningen av
gelantikropparna, (e) tillverka gelantikropparna i form av nanopartiklar för att testa om dessa
kan användas som vaccin.
Uppnådda resultat.
Syftet (a) har uppnåtts. Vi har framställt gelantikroppar mot humant och bovint hemoglobin,
myoglobin från häst, transferrin med och utan järn, cellulas, vildtyp och mutant av Semliki
Forest Virus, olika stammar av E. coli bakterier, olika typer av bakterier.
Syfte (b). Vi har utarbetat metoder baserade på analys av eluatet från en kolonn uppbyggd
av gelantikroppar, färgning av antigenet, mätning av fluorescensen av komplexet
antigen/gelantikropp, masspektrometri, QCM (en sorts mikrovåg). Ytterligare metoder
kommer dock att prövas.
Syfte (c). Som nämnts ovan under Tillverkningen av artificialla antikroppar har vi en total
selektivitet, basaerad på form- och bindningsselektivitet. Den totala selektiviteten har vi ökat
genom att införa ytterligare en selektivitetsfaktor, nämligen laddningen av komplexet
gelantikropp/antigen. Ett mått på denna laddning får man om man bestämmer hur snabbt
komplexet vandrar i ett elektriskt fält. För detta ändamål använder vi den ursprungliga s.k. fria
zonelektroforesapparaten (som jag konstruerade 1958). Denna teknik, baserad på tre
selektivitetsprinciper, är troligen den enklaste och mest känsliga som finns för att upptäcka
små skillnader i strukturen av proteiner, virus, bakterier, etc. Som exempel vill vi nämna att
med denna teknik kan vi särskilja vildtyp och mutant av Semliki Forest Virus, trots att den
strukturella skillnaden endast är tre aminosyror i ett av de tre proteinerna på ytan av
viruspartikeln. En granskare av vår uppsats kallade idén revolutionerande.
Syfte (d). Som exempel på den praktiska användningen av gelantikropparna kommer vi snart
att studera:
Kliniska applikationer för gelantikroppar. Det är svårt att hitta ett enklare och lika pålitligt
analysredskap som antikropparna inte bara inom den ovan nämnda kliniska diagnostiken,
utan även inom ett mycket stort antal andra områden, t. ex. för detektering av patogena
virus, sporer (Anthrax) och bakterier i luft/vatten/födoämnen; för analys av blod på HIV,
West Nile Fever och Hepatitis före en blodtransfusion, vilket är en vanlig
försiktighetsåtgärd på flera sjukhus; kanske för eliminering av toxiner, virus (HIV) och
cirkulerande cancerceller i kroppsvätskor, en teknik som möjligen kan ha samma effekt som
ett vaccin (tekniken finns utarbetad för andra ändamål). Applikationsområdet är alltså
enormt stort.
Syfte (e) att tillverka vaccin har ännu ej påbörjats.
Nedan presenteras i korthet en jämförelse av fördelarna med syntetiska gelantikroppar och
med proteinantikroppar, producerade i försöksdjur:
Fördelar med syntetiska antikroppar, jämfört med proteinantikroppar:
2
a) Inga försöksdjur krävs.
b) Billigare att framställa.
c) Selektiviteten är högre, eftersom endast en del av proteinantikroppens yta är i kontakt med
antigenet, medan hela antigenets yta är i kontakt med den syntetiska gelantikroppens hålighet,
vilket betyder, att såväl form- som bindningsselektiviteten är högre för de syntetiska
antikropparna. Den tredje selektivitetsparametern, baserad på laddningen av komplexet
antigen/antikropp, kan ej utnyttjas för proteinantikropparna, eftersom det i praktiken är
mycket svårt att renframställa detta komplex. Motsvarande svårighet existerar ej för de
syntetiska gelantikropparna, eftersom komplexet utgöres av gelpartikeln med bundna
antigenmolekyler vilket genom en enkel sedimentation eller centrifugering lätt kan isoleras
och sedan underkastas en elektroforetisk analys, såsom ovan beskrivits.
Fördelar med proteinantikroppar framställda i försöksdjur:
Metoder finns redan utarbetade för framställning av vaccin, baserade på proteinantikroppar.
Det är emellertid troligt att artificiella gelantikroppar i form av nanopartiklar också kan
användas som vaccin. Denna möjlighet bör snarast undersökas.
Kan vår teknik ersätta de konventionella proteinantikropparna och på så sätt begränsa
djurförsöken? I diskussionerna ovan har denna fråga intagit en central plats och de visar
otvetydigt att så är fallet men endast om ytterligare ekonomiska resurserna kan
tillgodoses.
Publikationer 2005-2006 för forskningsområdet artificiella gelantikroppar.
Rezeli, M., Kilár, F., Hjertén, S. Monolithic Beds of Artificial Gel Antibodies. J.
Chromatogr. A 2006, 1109, 100-102.
Takátsy, A., Kilár, F., Hjertén, S. Universal Method for Synthesis of Artificial Gel Antibodies
by the Imprinting Approach, Combined with a Unique Electrophoresis Technique for
Detection of Minute Structural Differences of Proteins, Viruses and Cells (Bacteria) Ia. Gel
Antibodies against Proteins (Transferrins), accepted for publication in J. Sep. Sci., 2006.
Takátsy, A., Végvári, Á., Kilár, F., Hjertén, S. Universal Method for Synthesis of Artificial
Gel Antibodies by the Imprinting Approach Combined with a Unique Electrophoresis
Technique for Detection of Minute Structural Differences of Proteins, Viruses and Cells
(Bacteria) Ib. Gel Antibodies against Proteins (Hemoglobins), accepted for publication in
Electrophoresis, 2006.
Takátsy, A., Sedzik, J., Kilár, F., Hjertén, S. Universal Method for Synthesis of Artificial Gel
Antibodies by the Imprinting Approach Combined with a Unique Electrophoresis Technique
for Detection of Minute Structural Differences of Proteins, Viruses and Cells (Bacteria) II.
Gel Antibodies against Viruses (Semliki Forest Virus), accepted for publication in J. Sep.
Sci., 2006.
Bacskay, I., Takátsy, A. Végvári, Á., Elfwing, A., Ballagi-Pordány, A., Kilár, F., Hjertén, S.
Universal Method for Synthesis of Artificial Gel Antibodies by the Imprinting Approach
Combined with a Unique Electrophoresis Technique for Detection of Minute Differences in
the 3-D Structure of Proteins, Viruses and Cells (Bacteria) III. Gel Antibodies against Cells
(Bacteria), accepted for publication in Electrophoresis, 2006.
3
Artificial Gel Antibodies against Proteins, Viruses and Bacteria
Conventional antibodies are proteins which are raised in experimental animals by injection of
a foreign substance which the animal does not recognize and, therefore, tries to neutralize it
by synthesizing a protein, an antibody, which has the property to interact with the antigen and
form a strong complex. However, it takes several weeks to produce the antibodies in
sufficiently large quantities and during this time (and also later) the animal may suffer
seriously, particularly when the antigen is toxic. In addition, the surroundings in which the
animals are forced to live could in many cases be better. For these and other reasons, there is a
general trend to find methods to produce antibodies, not based on experimental animals.
In this connection it should be stressed that one of the most famous philosophers, Professor
Peter Singer, has coined the frequently quoted thesis that all sentient creatures should be
treated similarly. Of moral importance is the feeling of pain and fortune. This feeling may
human beings, as well as animals, have. Accordingly, there is no difference between human
beings and animals in this respect. Singer´s conclusion is that there are no convincing reasons
to consider human beings, i.e., Homo sapiens, to be particularly valuable and unique.
One of our projects is focussed on the synthesis of artificial gel (not protein) antibodies, i.e.
experimental animals are not used. The method is so simple that it can be performed in any
laboratory. The artificial antibodies consist of gel granules with diameters of 0.1-0.2 mm. In
these granules there are cavities which have the same shape and size as the antigen: Only the
antigen will fit into the cavities and stick to their walls. Accordingly, we can easily “fish out”
this particular antigen from a mixture of this antigen and many other different substances. The
selectivity is, thus, extremely high. For instance, we can within 5-20 minutes decide whether a
sample contains human or bovine hemoglobin, a particular mutant of a virus or a particular
strain of a bacterium. The gel antibodies can certainly also be used in biosensors to detect
Anthrax (to prevent bio-terrorism) and Avian Flue (and in the form of a mouth mask for
protection against this and other pathological viruses and bacteria), etc., etc.
Whether the gel antibodies can be employed in the form of vaccine is an open question, as is
their use to remove HIV from the circulation as a method to cure people from the disease.
An advantage of the artificial gel antibodies, compared to the conventional protein antibodies,
is that they are much more stable, which is of great practical importance when used in not
very well equipped laboratories in the poor (African) countries by people with low scientific
education.
4
