REDOVISNING Slutredovisning Skickas till: Stiftelsen Forskning utan djurförsök, Gamla Huddingevägen 437, 125 42 Älvsjö 1. Anslagstagare Stellan Hjertén Arbetsplats (fullständig postadress) Institutionen för biokemi och organisk kemi, E-postadress [email protected] BMC, Box 576, 751 23 Uppsala 2. Projektnummer Sista redovisningsdatum (se kontraktet) 56/06 2008-04-30 3. Projekttitel (svenska) Studier av artificiella antikroppar mot proteiner, virus och celler (bakterier) samt applikationer 4. Projektet är avslutat X pågår utan fortsatt stöd från Stiftelsen Forskning utan djurförsök 5a. Kortfattad beskrivning av projektet (syfte och utförande) ca 1 A4-sida Syntesen av de artificiella antikroppar är mycket enkel. Till en monomerlösning sättes den antigen (proteiner, virus, celler) man vill ha en artificiell antikropp mot. Vid polymerisation bildas en gel som granuleras. Antigenet tvättas bort. De hålrum, som då skapas har en form, som är komplementär till formen på antigenet, dvs endast antigenet passar in i hålrummet, vilket skapar selektivitet. Denna förstärks av de kemiska bindningarna, t ex vätebindningar, mellan antigenet och ' väggarna' i hålrummet. Ett absolut krav på en modern analysmetod är, att den snabbt registrerar analysvärdet. Därför har vi utarbetat sådana metoder för detektering och kvantifiering av antigenerna. Vi kommer att utnyttja förutom de redan publicerade optiska metoderna, också masskänsliga och laddningskänsliga tekniker. Metoder som vi har använt för detektering av ”antigener” (albumin, γ-globulin och transferrin) bundna till artificiella antikroppar är fluorescence imaging och spectrofotometri. M.h.a spectrometri har vi kunnat kvantitativt bestämma ”antigen” koncentrationen i en provlösning (så låg som 20 µg/ml). Denna metod kan användas för att "fiska upp" en biomarkör för en viss sjukdom från en kroppsvätska och bestämning av dess koncentration i denna vätska för diagnos, prognos och behandling. Vi kommer dessutom att utvecka en metod för kvantifiering av tillväxthormonet. En kalibreringskurva kommer att användas för att bestämma koncentrationen av tillväxthormonet hos patienter med olika metaboliska och neurologiska defekter. Artificiella antikroppar kommer även att utnyttjas för att skapa enzym reactorer och biosensorer för detektion av t.ex. Anthrax. 5b. Ange nyckelord (max 6 st) Antikroppar, artificiella antikroppar, polyakrylamidgel, biomarkör, biosensor, tillväxthormon. 6. Kortfattad populärvetenskaplig beskrivning av de resultat som uppnåtts (bifoga gärna illustrationer, helst grafiska tekningar), ca ½ max 1 A4-sida Antikroppar är proteiner, som produceras hos människa och djur för att oskadliggöra en rad skadliga substanser, t.ex. gifter, sjukdomsalstrande virus och bakterier. De framställs i försöksdjur t.ex. för medicinsk användning, men aldrig eller ytterst sällan i människa, eftersom sådana försök inte sällan är plågsamma och hälsovådliga. Av dessa och andra skäl är det förståligt att många forskare sedan lång tid tillbaka försökt syntetisera artificiella antikroppar, men framgången har varit mycket begränsad. Därför skapades den pessimistiska attityden, att det var omöjligt att göra sådana synteser. En litteraturstudie visade mig mycket snart orsakerna till misslyckandena. 1996 publicerade vi den första artikeln, där vi påpekade skälen och samtidigt visade hur man generellt och mycket enkelt kan framställa antikroppar mot proteiner i form av stabila geler. Denna framgång genererade ett internationellt pris. Sedan dess har jag fått flera priser för min separationsforskning, vilken inkluderar gelantikropparna. StiFUD0703 Nu har vi visat, att metoden är applicerbar också på virus och bakterier (konventionella proteinantikroppar mot dessa biopartiklar kan ej framställas i försöksdjur, eftersom de där degraderas metaboliskt). Här öppnas ett helt nytt forskningsområde: t.ex. ligger det ju nära till hands att använda dem för att avlägsna virus ( HIV) och bakterier i blod, med samma teknik som utnyttjas vid njurdialys. 7. Sammanfattning av resultatens betydelse för att ersätta/begränsa djurförsök (ge gärna konkreta exempel) Det torde vara helt klart att metoden har en enormt stor potential, eftersom de artificiella gelantikropparna infördes just för att ersätta eller komplettera proteinantikropparna. Ett exempel är att vi utnyttjat dem för att ”fiska upp” biomarkörer (t. ex.albumin i humanplasma och ryggmärgsvätska). 8. Vilket är den största framgången hittills i projektet? a) Att vi lyckades med det som andra misslyckades med: att syntetisera artificiella antikroppar 2) och att vi nu kan konstruera en standardkurva, eftersom denna möjliggör att man snabbt kan bestämma koncentrationen i t.ex en kroppsvätska av en biomarkör. 9a. Beskrivning av vad som gjorts för att validera och sprida metoden/metoderna Två uppsatser är nu klara för publicering (redaktören för tidskriften tackade oss för artikeln) 9b. Vad mer skulle behöva göras för att metoden/metoderna ska bli spridda och praktiskt användbara? En rad tester med flera olika biomarkörer måste genomföras och visa metodens potential och därmed göra den mer känd. 10. Förteckning över publikationer som projektet resulterat i 1 Liao JL, Wang Y, Hjertén S. (1996) A novel support with artificially created recognition for the selective removal of proteins and for affinity chromatography. Chromatographia 42: 259-262. 2 Hjertén S, Liao J-L, Nakazato K, Wang Y, Zamaratskaia G, Wang H-S (1997) Gels mimicking antibodies in their selective recognition of proteins. Chromatographia 44: 227-234. 3 Hjertén S, Liao JL. (1998) Chromatography columns with continuous beds formed in situ from aqueous solutions. US Patent 5814: 223. 4 Tong D, Hetényi Cs, Bikádi Zs, Gao JP, Hjertén S. (2001) Some studies of the chromatographic properties of gels ("artificial antibodies/receptors") for selective adsorption of proteins. Chromatographia, 54: 7-14. 5 Bacskay I, Takátsy A, Végvári A, Elfwing A, Ballagi-Pordány A, Kilár F, Hjertén S. (2006) Universal method for synthesis of artificial gel antibodies by the imprinting approach combined with a unique electrophoresis technique for detection of minute structural differences of proteins, viruses, and cells (bacteria). III: Gel antibodies against cells (bacteria). Electrophoresis 27: 4682-4687 6 Takátsy A, Sedzik J, Kilár F, Hjertén S. (2006) Universal method for synthesis of artificial gel antibodies by the imprinting approach combined with a unique electrophoresis technique for detection of minute structural differences of proteins, viruses, and cells (bacteria): II. Gel antibodies against virus (Semliki Forest Virus). J Sep Sci 29: 2810-2815. 7 Takátsy A, Kilár A, Kilár F, Hjertén S. (2006) Universal method for synthesis of artificial gel antibodies by the imprinting approach combined with a unique electrophoresis technique for detection of minute structural differences of proteins, viruses, and cells (bacteria): la. Gel antibodies against proteins (transferrins). J Sep Sci 29: 2802-2809. 8 Takátsy A, Végvári Á, Kilár F, Hjertén S. (2007) Universal method for synthesis of artificial gel antibodies by the imprinting approach combined with a unique electrophoresis technique for detection of minute structural differences of proteins, viruses and cells (bacteria). Ib. Gel antibodies against proteins (hemoglobins). Electrophoresis 28: 2345-2350. 9 Hjertén M, Rezeli M, Kilár F, Hjertén S. (2008) Renewable enzyme reactors based on beds of artificial gel antibodies. J Biochem Biophys Methods 70: 188-191. 10 Ghasemzadeh N, Nyberg F, Hjertén S. (2008a) Highly Selective Artificial Gel Antibodies for Detection and Quantification of Biomarkers in Clinical Samples. I. Spectrophotometric Approach to Design the Calibration Curve for the Quantification. J Sep Sci, in press. StiFUD0703 11 Ghasemzadeh N, Nyberg F, Hjertén S. (2008b) Highly Selective Artificial Gel Antibodies for Detection and Quantification of Biomarkers in Clinical Samples. II. Albumin in Body Fluids of Patients with Neurological Disorders. J Sep Sci, in press. 11a. Kortfattad vetenskaplig rapport (abstract) på engelska (projekttitel, syfte, utförande, och resultat), ca ½ A4-sida Synthesis of Highly Selective Artificial Gel Antibodies and Their Use for Detection and Quantification of Biomarkers in Clinical Samples The synthesis, based on molecular imprinting, is very simple: Acrylamide and bis-acrylamide are dissolved in a buffer. The “antigen” is added. The gel formed upon polymerization is granulated. When the antigen is removed a cavity forms, which has a shape corresponding to that of the antigen. Accordingly, only this antigen, but no other molecule, fits perfectly into this cavity. Also the bonds between the cavity and the antigen are characteristic of this antigen. Therefore, if a solution of this antigen and other proteins is added to the gel only this antigen will be strongly adsorbed in this cavity, since other molecules in the sample have another shape and other bonds to the “wall” of the cavity. The selectivity of the artificial gel antibodies is, accordingly, extremely high, very likely higher than that of conventional protein antibodies. This high selectivity can be taken advantage of in many applications, for instance to fish out a biomarker from a body fluid, and to rapidly determine its concentration with the aid of a standard curve. With this technique we could detect albumin with high precision in both human plasma and cerebrospinal fluid (CSF) and found that the concentration of albumin in these body fluids was significantly enhanced in CSF from patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). No enhancement in plasma levels of albumin was seen in patients with ALS, but rather a decrease. The results further indicate that this approach might also apply well to other biomarkers for the actual neurological disease and other disorders. Before a blood transfusion one has to test for HIV, West Nile Fever and Hepatitis C, etc. The artificial gel antibodies can certainly be used for this analysis and probably also for removal of HIV from patients with this disease by the use of the conventional equipment for kidney dialysis. 11b. Bifoga eventuellt en vetenskaplig rapport på engelska, max 4 sidor (syfte, utförande, och resultat) StiFUD0703