Specialfärgningar Cecilia Ottosson Laboratoriemetodik, grundläggande vt14 Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin Litteratur • Cellular pathology - kap 7, 8, 9 och 14 - repetition kap 6 Specialfärgningar • Komplement till H&E - påvisa närvaro/frånvaro av en viss typ av molekyler - var på vävnaden är de lokaliserade? - färgningar/histokemiska färgningar • Histokemi (vävnadskemi) - lokalisering av olika ämnen i cellerna - synligt i mikroskopet - olöslig produkt - känsliga metoder - detektion på plats Kontroller • Positiv kontroll - test av metoden - bakgrund - så likt det som ska studeras - simultant med provet • Negativ kontroll Färgning av bindväv • Kollagen och muskel -Trikromfärgning regel: en mindre molekyl kommer att penetrera och färga in vävnaden, men när en större molekyl kan penetrera samma vävnad kommer den att ersätta den mindre molekylen • Retikelfibrer - Silverimpregnering - Argyrofil reaktion Masson trikrom 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Järnhematoxylin 3. PonceauSyrefuchsinlösning 4. Phosphomolybdic/ phosphotungstic syra 5. Anilinblå/Light green 6. Dehydrering och montering Kärnor Muskel, röda blodkroppar Kollagen svarta röda blå/grön Van Gieson 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Weigerts hematoxylin 3. Van Gieson (pikrinsyra och syrefuchsin) 4. Dehydrering och montering Kärnor Muskel, röda blodkroppar Kollagen svarta gula röd Gordon and Sweets 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Syrahaltig kaliumpermanganat 3. Oxalsyra 4. Järnalun 5. Silverlösning 6. Formaldehyd 7. Guldklorid 8. Natriumtiosulfat 9. Dehydrering och montering Retikelfibrer svart Färgning av kolhydrater • Påvisandet av polysackarider - ex glykogen Färgning av kolhydrater • PAS (Periodic Acid Schiff) - perjodsyra – klyvning av kol-kol bindningen aldehyder - Schiffs reagens PAS 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Perjodsyra 3. Schiffs reagens 4. Harris hematoxylin 5. Dehydrering och montering PAS-positiv material Kärnor magenta blålila Färgning av kolhydrater • AB (Alcian Blue) - sura mukoplysackarider - katjon färg → binder till negativt laddade grupper - differentiering: pH 1 el pH 2,5 • AB-PAS (PAS-AB) - differentiering mellan neutrala och sura mukopolysackarider - sura mukopolysackarider – AB- färgning - neutrala mukopolysackarider – PAS-färgning - AB före PAS • PAS-Diastas - differentiering mellan glykogen och andra mukosubstanser - diastas (α-amylas) bryter ner glykogenet till glukos AB 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Alcian blå-lösning med önskat pH 3. Neutral rött 4. Dehydrering och montering Sura muciner Kärnor blåa röda AB-PAS 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Alcian blå 3. Perjodsyra 4. Schiffs reagens 5. Harris hematoxylin 6. Dehydrering och montering Sura muciner Neutrala muciner Blandning Kärnor blåa röda lila blålila PAS-Diastas 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Ett snitt i diastaslösning, ett snitt i avjoniserat vatten 3. Perjodsyra 4. Schiffs reagens 5. Harris hematoxylin 6. Dehydrering och montering Glykogen Kärnor magenta i det obehandlade snittet, saknas i det behandlade snittet blålila Färgning av fettceller • Fryssnittning • Lysokrom-metod - hydrofoba färger – löslig i fettcellerna • Neutrala lipider – flytande/halvfast form vid RT • Kolesterol – kristalliserad vid RT färgning vid smältpunkten (150° C) • Fosfolipider – fosfatgrupp, görs mer hydrofila, ej med lysokrommetoder Oil Red O • • Neutrala lipider Hydrofobisk färg 1. Oil Red O 2. Harris Hematoxylin 3. Montering med vattenbaserad monteringsmedel Fettceller Kärnor röda blålila Sudan Black • Kolesterol och fosfolipider • basisk färg 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Bromlösning Natrium metabisulfit 70 % Etanol Sudan Black 70 % Etanol Carmalum Montering med vattenbaserad monteringsmedel Neutrala lipider, fosfolipider och kolesterol Kärnor blå-svarta röda Färgning av enzymer • Fryssnitt/utstryk • Enzymer - hydrolaser - oxireduktaser • Substrat primär reaktionsprodukt (PRP) • PRP + kemiskt ämne slutlig reaktionsprodukt (SRP) • SRP – olöslig (precipitat) Färgning av enzymer • Hydrolaser – fosfataser - Gomoris sura fosfataser - Metallprecipitering - substrat: natrium -glycerolfosfat - PRP: natriumfosfat - SRP: natriumfosfat + bly eller kalcium visualisering med vätesulfid – svart fällning • Oxireduktaser - peroxidaser - substrat: H2O2 - PRP: O2 - SRP: O2 + kromogen (ex DAB) färgomslag (brun om DAB) Färgning av pigmenter • Artefaktspigmenter • Exogena pigmenter • Endogena pigmenter Perls reaktion • Hemosiderrin (järn) 1. Avparaffinering och rehydrering 2. HCl/Kaliumferrocyanid 3. Neutral Red 4. Dehydrering och montering Hemosiderrin Kärnor blå röda Masson-Fontana • Melanin, argentaffina granula • Argentaffin reaktion 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Silverlösning 3. Natriumtiosulfat 4. Neutral Red 5. Dehydrering och montering Melanin Kärnor svart röda Färgning av mikroorganismer • Formaldehydfixerad material • Bakterier • Svamp • Virus • Parasiter Gramfärgning • Bakterier • Cellväggens tjocklek 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Kristallviolett 3. Jodlösning 4. Aceton 5. Neutral Red 6. Dehydrering och montering Grampositiva Gramnegativa blåa röda Ziehl-Neelsen • Syra-fasta organismer (tuberkulosbakterien) • Fettrik cellvägg 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Karbolfuchsin 3. HCl-alkohol 4. Metylenblått 5. Dehydrering och montering Syra-fasta organismer Bakgrund röda blå Grocott • Svamp • Argentaffin reaktion 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Kromsyra 3. Natriumbisulfit 4. Metenamin silverlösning 5. Guldklorid 6. Natriumtiosulfat 7. Light green 8. Dehydrering och montering Svamp Bakgrund svart grön S-Giemsa • • Helicobacter pylori Romanowsky 1. Avparaffinering och rehydrering 2. S-Giemsa 3. Dehydrering och montering Helicobacter pylori blåa Färgning av Amyloid • Onormal protein • Många former - olika metoder - jod/svavelsyra - metylviolett - Kongo rött Kongo rött 1. Avparaffinering och rehydrering 2. Harris hematoxylin 3. Kongo rött 4. Dehydrering och montering Amyloid i polarisationsmikroskop Kärnor rosa-rött äppel grön blålila