Lycke
Slurapport för 2015
”Ett unikt svenskt system för toleransbehandling
av reumatoid artrit”
Övergripande måluppfyllelse:
Projektet startades med tre målsättningar, vilka samtliga har uppnåtts under projektets gång.
1) Den första målsättningen var att erhålla ”proof-of-principle” för att en oral
toleransterapi mot reumatoid artrit (RA), kan uppnås om CTA1R7K-COL-DD
fusionsproteinet skulle kunna uttryckas i ätbara växter. Denna terapi skulle visa sig effektiv i
en experimentell modell i vilken möss äter en sallad som uttrycker rekombinant CTA1R7KCOL-DD. Vi fann att vårt tolerogen CTA1R7K-COL-DD uttryckt i växter skyddades från
nedbrytning i magtarmkanalen och därmed effektivare stimulerade till tolerans i musmodellen.
Detta medförde att leder utsattes för vävnadsdestruktion i långt lägre grad än kontroll-djurens
leder. Vårt nästa mål är nu att pröva om sallads-behandling skulle kunna erbjudas människor i
en klinisk prövning. För detta mål söker vi ytterligare finansiering. 2) Den andra
målsättningen var att byta ut DD-delen av fusionsproteinet mot ”single chain Fv” (ScFv)
antikroppar som skall målsöka dendritiska celler mer direkt. För detta syfte har vi utvecklat
två typer av fusionsproteiner med direkt målsökning; ett baserat på CD103 bindning och ett
med direkt bindning till CD11c. Dessa ytproteiner (CD103) uttrycks på bestämda
undergrupper av dendritiska celler (DC) eller är generella markörer (CD11c) för DC.
Preliminära resultat pekar på att DD- kan ersättas av ScFv och uppnå högre specificitet för
DC och därmed effektivare kan inducera tolerans i CD4 T cellerna, eftersom det är den
CD103+ migratoriska DC-populationen som effektivast stimulerar T cells tolerans. 3) Den
sista och 3dje målsättningen i projektet var att utvärdera i ett humant system om
toleransterapi kan ha en skyddande effekt på en autoimmun sjukdom. För dessa studier
utvecklade vi ett fusionsprotein som bär en peptid från Acetylcholin-receptorn (AChR) och
denna uttrycktes väl i CTA1R9K-MG-DD, vilket är ett fusionsprotein som avses att användas
som en toleransterapi mot myasthenia gravis (MG) sjukdomen. Initiala studier visade på en
bra effekt i en musexperimentell modell av MG och efterföljande prövningar på humana
periferblodsceller visade på tolerogena egenskaper. Denna del av projektet går nu vidare i ett
nystartat bolag, Toleranzia AB, som skall ta behandlingen till klinisk prövning och för vilket
vi erhållit ett stort Eurostar-anslag.
Uppnådda resultat:
1) Proof-of-principle studier: CTA1R7K-COL-DD har genom rekombinant teknik uttryckts
Arabidopsis thaliana växter och denna växt utgör därmed en terapeutisk behandling av
collagen-inducerad artrit (CIA), den mest erkända modellen för reumatoid artrit (RA). Vi har
därefter genomfört en serie försök i CIA-modellen för att ta reda på om vi kan tillföra
CTA1R7K-COL-DD till möss genom födan och om denna behandling har terapeutisk effekt
på ledinflammationen. Vi har uppnått överraskande resultat med mycket god skyddande
effekt mot ledinflammation. Således erbjudes behandlingen som en sallad för mössen.
Behandlingen gick till så att ledinflammationen initierades och därefter gavs mössen sallad en
dag varje vecka i 4 veckor under pågående sjukdomsutveckling. Den terapeutiska effekten av
salladsätandet har visat sig signifikant och 20-25% av djuren utvecklade inte någon artrit alls,
medan de övriga utvecklade en betydligt mildare artrit. Objektiva parametrar på en mildare
Lycke
artrit i form av lägre immunpatologi i lederna och låg frisättning av IL-6 eller MMP-3 i serum
kunde säkerställas i behandlade djur.
COL+CFA
1
-3
Feeding
COL+IFA
21
7
Feeding
14
Feeding
CIA progression
24
Feeding
Som
En värdefull kontroll har vi nyligen tagit fram Arabidopsis thalania som rekombinant
uttrycker CTA1R7K-DD , utan COL peptid. Denna behandling gav inget skydd mot CIA i
försöken, varför vi med säkerhet kan påstå att det är COL-peptiden som ger den specifika
toleransen i modellen och som ger skydd mot CIA-artriten. Vidare har vi dokumenterat
mekanismerna bakom toleransen som induceras genom att äta växterna som uttrycker
CTA1R7K-COL-DD. Vi fann att två skyddande mekanismer stimuleras genom salladsätandet.
Den ena är en ökning av regulatoriska Foxp3-postiva CD4 T celler i blodet och den andra är
förekomsten av IL-10 producerande regulatoriska T celler i de lymfoida organen. Vi
konstaterade att förekomsten av inflammationsdrivande IL-17 och IFN- är klart sänkta i de
behandlade djuren. Detta fynd är i enlighet med andra modeller för inducerad T cells-tolerans
vid autoimmunitet. Arbetet med att utforska varför CTA1R7K-COL-DD ger tolerans i
modellen har utvidgats och vi undersöker nu om IL-27 eller IL-35 är involverade.
Arthritis Incidence
Change
Arthritic Index
Weight
För detta har vi etablerat nya metoder för IL-27 detektion med ELISA för proteindetektion
och PCR-för registrering av IL-27 genuttrycket. Anti-IL-27 behandlingar in vivo planeras för
Lycke
2014 för att utröna om detta är en central mekanism för toleransen som induceras med
CTA1R7K-COL-DD. Preliminära fynd visar på att IL-27 kan vara en mekanistisk förklaring
till att CTA1R7K-COL-DD ger stark tolerans i musmodellen.
2) Genteknologi för att ersätta –DD med ScFv för bättre målsökning av
fusionsproteinet CTA1R7K-COL-DD:
Vi har nyligen dokumenterat att vårt tolerogen CTA1R7K-COL-DD tas upp av DC i
nässlemhinnan om fusionsproteinet appliceras där. Vi har följt hur vårt tolerogen tas upp och
processas av DC i nässlemhinnan och hur DC aktiveras och mognar till tolerogena DC som
dämpar bildandet av autoaggressiva CD4 T celler i de dränerande lymfnoderna. Vi fann ett
tydligt mönster där CD103+ CD11b+ DC specifikt tog upp tolerogenet efter nasal
administration, som också uttrycktes tillsammans med MHC-II på dessa cellers yta (se fig.
nedan)
CD19
CD103--CD11b+
CD103+CD11b+/-
CD103+CD8+
12
h
24
h
Yae: E
MHCII
loaded onto
3) Miljonfinansiering för genombrottsbehandling mot
muskelsjukdom och ”Orphan Drug Designation” status vid
Amerikanska läkemedelsverket (FDA) (press release)
Toleranzia AB är ett läkemedelsbolag som har utvecklat ett patentskyddat koncept med stor
potential för en rad autoimmuna sjukdomar. Fokus ligger på diagnosen Myasthenia Gravis
(MG), där professor Nils Lycke och hans forskargrupp inom Sahlgrenska Akademien gjort
banbrytande insatser för att inte bara behandla utan också bota denna allvarliga
muskelsjukdom. Med anledning av att projektet erhållit Eurostars anslag publicerades denna
”press release”. Nedan visas ett experiment i musmodellen för MG och den effektiva
dämpningen av muskelsymptom som erhålles genom intranasal behandling med CTA1R7KMG-DD. Nästa figur visar den tolerogena effekten på humana DC, som resulterar i en stark
Lycke
produktion av IL-10, vilket talar för att även i ett humant system är stimulering av
regulatoriska CD4 T celler mekanismen bakom en klinisk efffekt av intranasal behandling
med tolerogent fusions protein CTA1R7K-MG-DD.
Personal
Arbetet framskrider nu med att hitta finansiering av en klinisk prövning. Två publikationer,
som redan föreligger i manuskript, kommer att skickas in för bedömning under 2015 med
doktoranden Charlotta Hansson, som förstaförfattare.
Hon genomförde sin
halvtidsutvärdering av doktorandprojektet i december 2013 med strålande resultat. Företaget
Toleranzia AB har avdelad personal som arbetar med MG-delen av projektet.
Avvikelser i projektet mot projektbeskrivningen
Det finns inga avvikelser gentemot den ursprungliga projektplanen.
Publikationer
Manuskript inskickade för bedömning eller under sammanställning
Lycke
1. Hansson C1, Schön K1, Kalbina I2, Stridh Å2, Andersson S2,3, Bokarewa M4, and
N.Y.Lycke Feeding transgenic plants expressing a targeted fusion protein
protects against arthritis. Submitted to Mucosal Immunology
2. Hansson C1, Schön K1, Bokarewa M4, and N.Y.Lycke. The intranasal tolerogen
CTA1R7K-COL-DD specifically targets dendritic cells after nasal administration.
Manuscript under preparation.
Sammanfattning
Arbetet med att ta fram en behandling mot autoimmuna sjukdomar och RA i
synnerhet har fortskridit enligt plan under hela projektet. En doktorand,
Charlotta Hansson har arbetat heltid med att uttrycka fusionsproteinet
CTA1R7K-COL-DD i Arabidopsis thalania växter som sedan möss matats med
för att uppnå tolerans av autoaggressiva CD4 T celler och dämpning av
ledinflammationen. Resultaten har varit mycket lovande och vi kan idag
konstatera att en terapeutisk sallad en gång i veckan tycks reducera incidensen
av artrit med 25% , samt att artriten som utvecklas hos dom drabbade är 50%
lägre. Vi kommer nu att fortsätta att utveckla terapin för klinisk användning. Ett
bolag, Yoleranzia AB , har bildats för att driva projektet vidare mot klinisk
prövning och vi har valt myasthenia gravis, som en lämplig sjukdom att initiera
klinisk toleransterapi mot. För detta har ett Eurostars-anslag erhållits och
“ orphan-drug designation” i USA. Inga personal eller organisationsförändringar
eller avvikelser gentemot den ursprungliga projektplanen har gjorts.
