NORDISK METODIKKOMMITTÉ FÖR
LIVSMEDEL
Nr. 177
2004
No. 177
2004
NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS
Aspergillus flavus och A. parasiticus. Bestämning i livsmedel
och foder.
Aspergillus flavus and A.
parasiticus. Determination in
food and feed.
Denna NMKL-metod är inte validerad i en
kollaborativ avprövning.
This NMKL method is not validated in a
collaborative study.
1.
1.
ÄNDAMÅL
OMRÅDE
OCH
ANVÄNDINGS-
SCOPE AND FIELD OF APPLICATION
Metoden kvantifierar de potentiellt aflatoxinbildande mögelarterna Aspergillus flavus och A.
parasiticus och är avsedd att rutinmässigt
användas för att detektera livs- och fodermedel
som kan innehålla aflatoxin, såsom t ex nötter,
majs och kryddor. Metoden omfattar dels ett
spädningsförfarande och dels utplaceringsmetodik.
The method quantifies the potentially aflatoxin
producing moulds Aspergillus flavus and A.
parasiticus and is suitable for routine detection of
food and feed that may be contaminated with
aflatoxins, e.g. nuts, maize and spices. The
method includes methodology using both dilution
plating and direct plating techniques.
2.
2.
DEFINITION
DEFINITION
Aspergillus flavus och A. parasiticus bildar
kolonier som på undersidan av agarplattan är
färgade i klart orange-gult på Aspergillus flavusparasiticus agar (AFPA).
Aspergillus flavus and A. parasiticus form
colonies with a bright orange-yellow reverse on
Aspergillus flavus-parasiticus agar (AFPA).
Antalet kolonier uttrycks som kolonibildande
enheter (cfu) per gram livsmedel.
The count of moulds is expressed as the number
of colony forming units (cfu) per gram of food.
Den endogena infektionen uttrycks som procent
infekterade partiklar av det totala antal som
utplacerats.
The endogenous infection is expressed as the
percentage of infected food particles out of the
total number of surface disinfected food particles.
3.
3.
REFERENSER
REFERENCES
3.1 Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel,
NMKL metod nr. 91, 3. utg., 2001: Provtagning
och forbehandling af levnedsmidler og foder for
kvantitativ mikrobiologisk undersøgelse.
3.1 The Nordic Committee on Food Analysis,
NMKL Method no 91, 3rd ed. 2001: Sampling
and pre-treatment of foods and animal feedstuffs,
for quantitative microbiological examination.
3.2 Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel,
3.2 The Nordic Committee on Food Analysis,
NMKL metode nr. 177, 2004, side 2 (4)
NMKL method No 17, 2004, page 2 (4)
NMKL rapport nr 5, 2 utg., 1994: Handledning i
kvalitetssäkring för mikrobiologiska laboratorier.
NMKL Report no 5, 2nd ed. 1994: Handbook in
quality assurance for microbiological laboratories.
3.3 Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel,
NMKL rapport nr 19, 1998: Harmonisering av
mikrobiologiska metoder.
3.3 The Nordic Committee on Food Analysis,
NMKL Report no 19, 1998: Harmonization of the
microbiological methods (in Danish and Finnish
only).
3.4 Nordisk metodikkommitté för Livsmedel
NMKL rapport nr 1, 2 utg, 1983: Statistical
evaluation of results from quantitative
microbiological examination.
3.4 The Nordic Committee on Food Analysis,
NMKL Report no 1, 2nd ed. 1983: Statistical
evaluation
of
results
from
quantitative
microbiological examination.
3.5 Pitt, J.I., Hocking, A.D., Samson, R.A. och
King, A.D. (1992). Recommended methods for
mycological examination of foods. In: Modern
methods in food mycology, Samson, R.A.,
Hocking, A.D., Pitt, J.I and King, A.D., editors.
Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1992:
365-8.
3.5 Pitt, J.I., Hocking, A.D., Samson, R.A. and
King, A.D. (1992). Recommended methods for
mycological examination of foods. In: Modern
methods in food mycology, Samson, R.A.,
Hocking, A.D., Pitt, J.I and King, A.D., editors.
Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1992:
365-8.
4.
4.
PRINCIP
PRINCIPLE
Cfu-halten bestäms genom ett spädningsförfarande varvid en känd mängd prov sprids på
Aspergillus flavus-parasiticus agar (AFPA). Efter
inkubering vid 30,0 ± 1,0 °C under 45 ± 3 h,
räknas kolonier med typiskt utseende och cfuhalten beräknas.
The cfu count is obtained by a dilution plating
technique, in which a known amount of sample is
spread on Aspergillus flavus-parasiticus agar
(AFPA). After incubation at 30.0 ± 1.0 °C for 45
± 3 h colonies with a characteristic appearance are
counted.
Frekvensen av endogen infektion bestäms genom
utplacering av ytdesinficerade partiklar på AFPA.
Efter inkubering vid 30,0 ± 1,0 °C under 45 ± 3 h
räknas antalet partiklar där minst en typisk koloni
konstateras och det procentuella antalet beräknas.
The frequency of endogenous infection is
determined by direct plating of surface-disinfected
particles on AFPA. The plates are incubated at
30.0°C ± 1.0 °C for 45 ± 3 h, and the number of
particles from which at least one typical colony
forms, is recorded. The infection percentage is
calculated.
5.
5. DILUENTS AND CULTURE MEDIA
SPÄDNINGSVÄTSKOR OCH
SUBSTRAT
Kommersiellt tillgängliga medier kan användas.
Då dessa används, skall de av tillverkaren
angivna
instruktionerna
följas
vid
framställningen. Färdigberedda substrat och
reagens som ej används direkt skall förvaras i
mörker och kyla (4,0 ± 2,0 °C).
Substraten innehåller toxiska substanser t ex
dikloran och rosbengal. Hantera dessa med stor
försiktighet.
Commercially available media may be used.
When preparing these, the manufacturer’s
instructions should be followed. If prepared media
and reagents are not used immediately, they
should be stored in a cold (4.0 ± 2.0 °C) and dark
place.
The media contain toxic substances, e.g. dichloran
and rose bengal, and should be handled with care.
5.1 Spädningsvätska
5.1 Diluent
Pepton
1,0 g
Destillerat vatten eller likvärdigt vatten 1000 ml
Peptone
Distilled water or equivalent
1.0 g
1000 ml
NMKL metode nr. 177, 2004, side 3 (4)
NMKL method No 17, 2004, page 3 (4)
Lös peptonet i vatten, värm i det fall att peptonet
löser sig ofullständigt. Justera pH till 7,2 ± 0,2
vid 20 – 25 °C. Fördela det välblandade mediet
till lämpliga flaskor eller rör. Tag hänsyn till
vätskeförlust under autoklavering. Autoklavera
vid 121 ± 2 °C i 15 minuter.
Dissolve the peptone in the water, and heat the
solution to ensure complete dissolution. Adjust the
pH to 7.2 ± 0.2 at 20 – 25 °C. Add the diluent to
flasks or tubes as needed. Take into account the
evaporation during sterilization. Sterilize at 121 ±
2 °C for 15 minutes.
Som ett alternativ till ovanstående spädningsvätska kan 0,1% pepton med tillsats av 8,5 g
NaCl per liter användas.
Alternatively, 0.1% peptone with an addition of
8.5 g NaCl per litre may be used as diluent.
5.2 Aspergillus flavus–parasiticus agar (AFPA)
5.2 Aspergillus flavus–parasiticus agar (AFPA)
Pepton
10,0 g
Jästextrakt
20,0 g
Järn-ammoniumcitrat
0,5 g
Klortetracyklin
50 mg
Kloramfenikol
50 mg
Agar
15,0 g
Dikloran (1 ml av 0,2% dikloran lösning i etanol) 2 mg
Destillerat vatten eller likvärdigt vatten 1000 ml
Peptone
Yeast extract
Ferric ammonium citrate
Chlorotetracycline
Chloramfenicol
Agar
Dichloran (1 ml of a 0.2%
dichloran solution in ethanol)
Distilled water or equivalent
10.0 g
20.0 g
0.5 g
50 mg
50 mg
15.0 g
2 mg
1000 ml
Lös de dehydrerade mediekomponenterna utom
antibiotika, eller det fullständiga dehydrerade
mediet i vatten, värm lösningen i det fall att
komponenterna löser sig ofullständigt. Reglera
pH till 6,3 ± 0,2 vid 20 – 25 °C efter
autoklavering. Överför det välblandade mediet
till lämpliga flaskor för autoklavering (15 min,
121 C ± 2 °C). Tillsätt antibiotika efter
autoklaveringen.
Dissolve all the dehydrated culture medium
components except the antibiotics, or the complete
dehydrated medium in the water, and heat the
solution to ensure complete dissolution. Adjust the
pH to 6.3 ± 0.2 at 20 - 25 °C after autoclaving.
Mix the medium well and transfer into suitable
flasks for autoclaving (15 min, 121 C ± 2 °C).
After autoclaving the medium, add the antibiotics.
Det kommersiellt tillgängliga substratet skall
kompletteras med tillsats av antibiotika.
The commercially available medium requires
addition of antibiotics.
5.3 Desinfektionslösning
5.3 Disinfection liquid
Gör en lösning av natriumhypoklorit så att
slutkoncentrationen av aktivt klor blir 0,4%.
Använd alltid nyberedd rumstempererad lösning
vid ytdesinfektion.
Prepare a solution of sodium hypochlorite in such
a way that the final concentration of active
chlorine is 0.4%. The disinfection liquid should
always be used freshly prepared and at room
temperature.
6. APPARATUR OCH GLASVAROR
6. APPARATUS AND GLASSWARE
6.1 Inkubator, 30,0 ± 1,0 °C.
6.1 Incubator, 30.0 ± 1.0 °C.
6.2 Filtrerpapper
6.2 Filter paper
7.
7.
UTFÖRANDE
7.1 Spädningsförfarande
PROCEDURE
7.1 Dilution plating
NMKL metode nr. 177, 2004, side 4 (4)
NMKL method No 17, 2004, page 4 (4)
7.1.1 Homogenisering, ansättning och inkubering
7.1.1 Homogenisation,
incubation
Väg upp 40 g prov och 360 g spädningsvätska.
Torra, hårda prover blötlägges under 30 min.
Homogenisera i Stomacher 2 min. Säkerställ att
homogenatet är ordentligt blandat innan
spädningar görs. Överför 0,1 ml av lämpliga
spädningar till dubletter av AFPA-plattor.
Fördela vätskan med hjälp av steril vinkelböjd
rackla.
Weigh 40 g sample and 360 g diluent. Soak dry,
hard samples for 30 min. Homogenize in a
Stomacher for 2 min. Make sure that the
homogenate is thoroughly mixed before further
dilution. Transfer 0.1 ml of suitable dilutions to
duplicate Petri dishes with AFPA and spread on
the surface using a sterile bent glass rod or similar.
Placera plattorna med ovansidan upp i ventilerade
plastpåsar. Inkubera vid 30,0 ± 1,0 °C under 45 ±
3 h.
Place the plates face up in ventilated plastic bags.
Incubate the plates at 30.0 ± 1.0 °C for 45 ± 3 h.
7.1.2 Avläsning
7.1.2 Reading
Räkna på samtliga plattor kolonier med typiskt
utseende, det vill säga kolonier som är klart
orange-gult färgade på agarplattans undersida.
Beräkna cfu-halten enligt anvisningar i NMKL
rapport nr 1 (3.4).
Count colonies with a characteristic appearance,
that is colonies with a bright orange-yellow
reverse, on all plates and calculate the cfu count
according to NMKL Report No 1 (3.4).
7.2 Utplaceringsmetodik
7.2 Direct plating technique
7.2.1 Ytdesinfektion och inkubering
7.2.1 Surface disinfection and incubation
Lägg partiklar i en bägare med desinfektionslösning. Låt lösningen verka under 2 minuter.
Häll av vätskan och låt överflödig vätska sugas
upp av sterila filtrerpapper. Utplacera totalt 100
partiklar, 5-10 per AFPA-platta.
Submerge the particles in a beaker containing a
0.4% active chlorine solution for 2 min. Pour off
the solution and absorb excess liquid between
sterile filter paper. Transfer a total of 100 particles
to AFPA, with 5-10 per plate.
Placera plattorna i ventilerade plastpåsar och
inkubera dem rättvända i inkubator vid 30,0 ±
1,0 °C under 45 ± 3 h.
Place the plates face up in ventilated plastic bags
and incubate at 30.0 ± 1.0 °C for 45 ± 3 h.
7.2.2 Avläsning
7.2.2 Reading
Räkna antalet partiklar som uppvisar växt av A.
flavus och A. parasiticus. Ange resultatet i
procent endogen infektion.
Count the number of particles from which A.
flavus or A. parasiticus are growing and calculate
the percentage of endogenous infection.
8.
8.
REFERENT
Emma Frändberg, Livsmedelsverket (Sverige) har
utarbetat denna NMKL-metod.
dilution
plating
and
REFEREE
Emma Frändberg, National Food Administration
(Sweden) has elaborated this NMKL method.
© Nordic Committee on Food Analysis
www.nmkl.org
