Hypoxi men inte frånvaro av
glukos, påverkar splitsningen av
muterat ISCU
Analys av hur yttre faktorer påverkar splitsning av
muterat ISCU som orsakar Linderholms sjukdom
Jackie Mbatudde
Vårterminen 2014
Examensarbete, 15 hp
Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp
1
Institutionen för Klinisk mikrobiologi
Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
Kursansvarige lärare: Ylva Hedberg Fransson [email protected]
Analysis of how factors like hypoxia and glucose levels affect the splicing of mutated
ISCU that causes Linderholms myopathy
Handledare: Monica Holmberg, Institutionen för Medicinsk biovetenskap, Umeå
universitet
Läraropponent:
Examinator:
Datum för godkännande:
Solveig Persson-Sjögren
Ylva Hedberg Fransson
2014 – 06 – 17
2
Abstrakt
Linderholms myopati (HML) är en autosomal recessiv sjukdom som härrör från Västerbotten och
Ångermanland. HML-patienterna uppvisar andnöd och hjärtklappning följt av kramper och värk i
musklerna redan vid låg fysisk ansträngning. Sjukdomen beror på en mutation i genen som kodar för
iron-sulfur cluster scaffold proteinet (ISCU), detta leder till en felsplitsning av mRNA och en minskad
produktion av fungerande Fe-S kluster som är viktigt för proteiner i andningskedjan och
citronsyracykeln. Syftet med studien var att undersöka faktorer som kan påverka till vilken grad ISCU
felsplitsas med fokus på syrenivå och glukosnivå som är viktiga för metabolismen. Muskelceller från
en frisk kontroll och en patient inkuberades i högt eller glukosfritt medium samt under normoxi eller
hypoxi och splitsningen av ISCU analyserades. Cellinjer från HM-patienter visade sig producera en
tillräcklig stor mängd fungerande Fe-S kluster för att klara av extrema förhållanden såsom hypoxi eller
inkubation i glukosfritt medium i 24 tim. Slutledningsvis kan man i denna studie konstatera att ingen
skillnad i splitsningen observerades mellan celler odlade under glukosfria eller höga glukos
förhållanden. I celler odlade under hypoxi kunde dock en ökning av felsplitsat ISCU observeras.
Nyckelord
ISCU, hypoxi, glukos, hereditär myopati.
3
Introduktion
Linderholms myopati, även kallad hereditär myopati med laktacidos (HML) är en autosomal recessiv
sjukdom som härrör från Västerbotten och Ångermanland (1, 2). Sjukdomen visar sig genom andnöd
och hjärtklappning följt av kramper och värk i musklerna redan vid låg fysisk ansträngning. Redan
från barndomen uppvisar patienter symptom då de inte utvecklar sin fysiska förmåga i samma takt
med andra barn i en motsvarande ålder. Symptomen varierar med lindriga perioder som snabbt kan
följas av sämre då patienten även i vila upplever dyspné och takykardi. Patienterna uppvisar i dessa
perioder ofta mörk urin som beror på muskelnedbrytning vilket resulterar i att myoglobin frigörs och
transporteras till bland annat njuren via blodet. Under dessa svåra skov kan även låg fysisk aktivitet
leda till sängliggande och i extrema fall till döden (3).
Tidigare studier har visat att genen som orsakar sjukdomen är lokaliserad på kromosom 12 (12q23,124,1) och kodar för proteinet iron-sulfur cluster scaffold protein (ISCU), ett protein som är nödvändigt
för sammansättningen av Fe-S kluster. Mutationen G->C ligger i intron 4 och resulterar i felsplitsning
av mRNA så att 86 eller 100 baspar av intronsekvens inkluderas i det mogna mRNA (2). Translationen
av det felaktigt splitsade mRNA leder till ett icke fungerande ISCU protein och en därmed defekt Fe-S
kluster-syntes hos de drabbade patienterna (4). Det intressanta är att trots att ISCU är viktig för
energiproduktionen i kroppens alla celler så är det främst skelettmuskulatur som är drabbad hos
HML-patienterna (5).
Musklerna får energi från främst cellernas ATP-producerande mitokondrier där tillgång till
järnsvavelkomplex i tillräcklig mängd behövs för att energiproduktionen ska vara tillräcklig i muskeln.
Hos patienter med HML är energiproduktionen otillräcklig eftersom sjukdomen orsakar en låg
produktion av fungerande Fe-S kluster som är viktiga för den syreberoende förbränningen av
näringsämnen. Musklernas oförmåga till att bryta ner näringsämnen leder till mjölksyrebildning vilket
i svåra fall kan få negativa följder med svår acidos och förlamning av andningsmuskulaturen (4).
Till följd av den defekta Fe-S kluster-biosyntesen i musklerna är funktionen hos Fe-S klusterinnehållande enzymerna som succinatdehydrogenas (SDHB) och aconitas (ACO) låg i jämförelse med
vävnad från friska individer (4). SDHB ingår i komplex II i elektrontransportkedjan och medverkar i
citronsyracykeln genom att ombilda succinat till fumarat medan ACO omvandlar citrat till isocitrat i
citronsyracykeln. Enzymerna har en stor betydelse för den syreberoende metabolismen och kan därför
användas som markörer för produktionen av energi/ATP (6). I denna studie jämfördes mängden av
SDHB, aconitas och ISCU i myoblaster som odlats i hypoxi eller i glukosfritt medium från en HML
patient mot en kontroll (7).
När det råder syrebrist uppregleras microRNA-210 (miR-210) vilket nedreglerar den mitokondriella
funktionen, vilket i sin tur uppreglerar glykolysen. Det har visat sig att ISCU nedregleras av miR-210
4
vilket leder till en nedsatt funktion av Fe-S proteiner i andningskedjan och citronsyracykeln.
Nedregleringen av ISCU har även visat sig minska aktiviteten för bland annat aconitas och succinat
dehydrogenas vilket ger en negativ effekt på metabolismen då Fe-S kluster behövs för aktiviteten hos
dessa enzymer (8). Eftersom både tillgången syre och glukos är viktig för regleringen av
energiproduktionen i muskel var syftet med denna studie att jämföra hur syre- och glukosnivåer
påverkar splitsningen av ISCU och även analysera nivåerna av ISCU proteinet i myoblaster från en
HML patient och en frisk kontroll.
5
Material och metoder
Material
Myoblaster från en patient (P) med HML samt från en frisk kontroll (C). Båda individerna var
avidentifierade. Cellerna extraherades via muskelbiopsi, 0,5 cm2 i storlek, från Tibialis anterior.
Isolering och odling av celler
Cellerna odlades i ett DMEM- Dulbeccos modified Eagle medium (199 MEDIUM Invitrogen, DMEM
Invitrogen 61965-026 Carlsbad, CA, USA) supplementerat med 50 µg/ml gentamycin (Sigma-Aldrich
15750–045, St. Louis, Missouri, USA) och 5 ng/ml HGF (Invitrogen PHG0254, USA). Cellerna
inkuberades i 37˚C, CO2 5 % med hög glukos (P+, C+) (25 mM) respektive ingen glukos (P-, C-) eller i
hypoxi (PH, CH; 1%) respektive normoxi (PN, CN; 20%) i 24 tim. Cellerna trypsinerades därefter med
0,05% 1 x Trypsin-EDTA (Invitrogen 25300–054, Gibco, USA).
Extrahering av RNA från celler samt cDNA syntes
RNA extraherades från celler, P eller C, med RNeasy Mini RNA kit (SuperScript TM III Reverse
Transcriptase kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt instruktioner från tillverkaren. Cellerna
lyserades i RLT buffert och renades sedan i RNeasy Mini spin kolumner för extraktion av RNA.
RNA-koncentrationen uppmättes med NanoDrop (NanoDrop. ND-1000 Spectrophotometer Saveen
Werner, Limhamn, Sweden). För cDNA användes SuperScriptTM III Reverse Transcriptase kit,
Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. RNA, 0,1-1 µg, inkuberades med
dNTP (0,5 mM slutkonc), 10 ng random hexamers i 65˚C, 5 min. Sedan tillsattes en mix av 10 mM
DTT och 200u SuperScript III RT i Firststrand buffer och proverna inkuberades i 25˚C 5 min följt av
50˚C i 1 tim. Enzymet inaktiverades sedan i 70˚C, 15 min.
PCR och gel-elektrofores
Reaktionsmixen för PCR innehöll 1-2 µl cDNA i 1x ammonium buffert (Ampliqon, Odense, Danmark),
0.4 mM dNTP (Boehringer Mannheimer, Ingelheim, Tyskland), 5 % DMSO och 1.75 u Taq Polymeras
(Ampliqon, Odense, Danmark). För amplifiering av ISCU-genen användes följande primers; Forward
primern IscU ex3 h/m (5´- ATGAAAAGGGGAAGATTGTGG -3´) (Sigma, St.Louis, Missouri, USA) och
Reverse primern Nifint6R_FAM (5´- [6FAM] TGCTTGCATGAGAGTCATAAC-´3 (Sigma, St.Louis,
Missouri, USA) (fig 1). PCR förhållanden var 95˚C (1 min), 95˚C (15 sek), 54˚C (20 sek), 72˚C (45 sek)
och 72˚C (7 min) x 30 cykler 4˚C. Fragmenten analyserades på 1,2 % Agarosgel med 0,1 M TBE och 0,1
mg Ethidium bromide.
6
Proteinpreparation samt koncentrationsbestämning med BCA assay
För protein-extraktion resuspenderades cellerna i protein lysis buffert (2 % SDS, 0,1 M Tris pH 6,8),
sedan överfördes de till is och sonikerades sedan (5x5 sek, 20 % power). För
koncentrationsbestämning användes BCA assay (PierceTM BCA Protein assay, Thermo Fisher
Scientific, Waltham, Massachusetts USA). Proverna späddes 20x i protein lysis buffert, blandades med
reagenterna A+B (50:1) och inkuberades 30-60 min i rumstemperatur. Proverna analyserades sedan
spektrofotometriskt vid en absorbans på 562 nm (Synergy 2Multi-Mode Microplate Reader, BioTek,
Winooski, VT, USA). Proverna jämfördes mot en BSA-standard med koncentrationer på 0, 120, 250,
500, 750, 1000, 1250 och 1500 µg/µl för att få fram mängden rätt- eller felsplitsade fragment.
Fragmentanalys
PCR-produkter laddades tillsammans med LIZ standard GeneScan 500LIZ standard/ Hi-Di FA
(2:100) på en 96-brunnsplatta. Proverna denaturerades (95˚C, 5 min) och analyserades sedan med
3730xl DNA analyser (Applied Biosystems, Life technologies, Foster City, California, United States).
Gensekvenserna analyserades därefter med GeneMapper software.
Western blot
Proteinprover späddes 4:1 med sample buffer (4x XT Samplebuffer, BioRad 161-0791, USA). Proverna
denaturerades i 3 min, 96˚C innan de laddades på gel (Pre-cast criterion 4-12% Bis-Tris gel, BioRad
343-0123, Hercules, CA, USA). En standard (Precision Plus Protein All Blue Standards, Biorad,
Hercules, CA, USA) med kända molekylvikter inkluderades. Proverna storleksseparerades via SDSPAGE och transfererades sedan till ett filter (GE Healthcare, AmershamTM HybondTM, Little Chalfront,
UK) via en "sandwich"-blot i 45 min, 15V. Innan inkubation med primärantikroppar blockades filtret
med PBST (PBS och 0,1 % Tween) och 5% mjölk (Semper mjölk, Sverige). Filtret inkuberades med
primärantikropparna ACO2 (1:500, A-22), SDHB (1:300, FL-280), ISCU1/2 (1:200, FL-142) (Rabbit
polyclonal IgG, samtliga från Santa Cruz Biotechnology, CA,USA) och GAPDH (1:50 000, 141C10
rabbit mAb, Cell Signaling Technology) över natt.
Filtren tvättades 3x10 min med PBST inför inkubation med sekundär antikropp (1:10 000, 1:30 000,
1:50 000), stabilized Goat Anti-Rabbit PIERCE, HRP-konjugerad) under 60min. Filtren tvättades med
PBST (6x5min) och ECL (SuperSignal West Dura Stable Peroxide Buffer och West Dura
Luminal/Enhancer Solution) användes tillsammans med röntgenfilm för framkallningen.
Etiska överväganden
För användning av myoblaster från HML patient samt frisk kontroll godkändes projektet av den
regionala etikprövningsnämndeni Umeå 2009-06-09. Diarie numret är 09-105.
7
Resultat
Analys av splitsningen av ISCU-genen i myoblaster under olika yttre
förhållanden
Regionen mellan exon 4 och 5 på ISCU-genen amplifierades med RT-PCR. För prover från C gav det
en produkt på 419 bp som representerar normalsplitsat ISCU. Hos P sågs två band, en produkt på 519
bp där en intronsekvens mellan exon 4 och 5 inkluderats (Fig 1 och 2). Den normalsplitsade produkten
var svagare i patientprovet än i kontrollprovet. Ingen skillnad observerades dock i patient- eller
kontrollproverna vid olika glukosförhållanden (Fig 2). Proverna från C innehöll liknande mängder i
förhållande till varandra, likaså var prover från P sinsemellan oberoende av mängden glukos.
För att studera påverkan av hypoxi vid splitsningen av ISCU odlades myoblaster vid normoxi och
hypoxi. Även här analyserades cellerna med RT-PCR. Analysen visade fragment på 519bp och 419bp. I
patientprov inkuberat vid hypoxi var bandet för vildtyp (WT) något svagare än för den muterade
ISCU-genen medan det för PN var lika starkt för WT som för den muterade genen (Fig 2).
Kontrollproverna hade inget fel-splitsat ISCU vilket resulterade i att 100 % var av WT. För patientproverna i glukosexperimentet sågs ingen skillnad i den relativa nivån fel-splitsat ISCU med 44 %
felsplitsat för P+ och 45% för P-. I motsatts till detta observerades en skillnad mellan patientprov i
hypoxi experiment då 44% ISCU var fel-spltsat vid normoxi medan 50 % var felsplitsat vid hypoxi (Fig
3).
Proteinmängd i patient och kontrollprover
Inga större skillnader i mängden protein då det gäller ACO och SDHB observerades mellan de fyra
proverna inkuberade i hög glukos eller med inget glukos i mediet. Däremot antas det en skillnad
mellan samtliga prover när det gäller ISCU. De lägsta nivåerna av ISCU observerades i patientcellerna
under högglukos-förhållanden där både 18 kDa och 15 kDa bandet är knappt synbara (Fig 4). Ingen
skillnad kunde observeras i mängden protein för proverna inkuberade vid normoxi och hypoxi. I
proverna från CH och PH för ISCU bandet på 18 kDa kunde man ana svagare band (Fig 5).
8
Diskussion
Eftersom både tillgången på syre och glukos är viktig för regleringen av energiproduktionen i
muskelceller jämförde vi i denna studie hur syre- och glukosnivåer påverkar splitsningen av ISCU och
analyserade även nivåerna av ISCU proteinet i myoblaster från en frisk kontroll och en HML patient.
I vanliga fall bildas det i kroppen en tillräcklig mängd av fungerande Fe-S kluster för att upprätthålla
en metabolism där ATP bildas i lagom mängder. Hos en HML-drabbad patient är denna produktion
påverkad av en mutation i ISCU-sekvensen som ansvarar för bildningen utav Fe-S kluster. Detta leder
till bildning av mjölksyra då musklerna inte kan förlita sig på den syreberoende metabolismen för sin
ATP produktion. Vid detta skede kan svår acidos, förlamning av andningsmuskulaturen och
cirkulatorisk insufficiens vara en orsak till patientens död om behandling inte ges (4).
I tidigare studier har man analyserat den relativa mängden felsplicat ISCU i olika vävnader från HML
patienter (5) och i musvävnader från möss som uttrycker en human ISCU transgen ( 9). Dessa studier
har visat att felsplitsningen av ISCU är tydligast i skelettmuskulatur där nästan allt ISCU är felsplitsat i
kontrast till t.ex. hjärtmuskulatur där huvuddelen är korrekt splitsat (5).
För att studera molekylära mekanismer är det enklare att använda sig av cellinjer då det är lättare att
manipulera dessa. Nackdelen är att man tar bort cellen från sin naturliga omgivning och inte kan
efterlikna dess naturliga miljö fullt ut då experimentet utförs in vitro.
I denna studie visade resultatet på en liten skillnad mellan patientcellerna som odlats vid normoxi och
de som odlats under hypoxi medan olika glukosnivåer inte resulterade i någon större skillnad. För att
studera de olika fragmenten optiskt semikvantifierades mängden WT (419 bp) och muterat (519 bp) på
en 1,2% agarosgel. Värt att notera var att bandet för PH vildtyp är något svagare jämfört med PN.
Detta kan man vid fragmentanalysen observera då en skillnad mellan patientproverna från hypoxi
experimentet var 44 % ISCU fel-splitsat vid normalt syre medan 50 % var fel splitsat vid hypoxi. Då
provmaterialet inte är tillräcklig behöver försöket upprepas för att statistiska slutsatser ska kunna dras
då det gäller hypoxi experimentet.
Vid analys av ISCU proteinnivåer såg man en skillnad mellan kontroll och patientprover både vid hög
och låg glukosnivå. Både 18 kDa bandet och 15 kDa var svagare hos patientcellerna. Huruvida det
tyder på en skillnad i splitsningen går inte att konstatera utan vidare undersökningar med bland annat
upprepade försök med liknande resultat. För ACO och SDHB observerades inga större skillnader
mellan kontroll och patientceller vilket skulle kunna bero på att det tillskillnad från muskelbiopsier
rättsplitsas mer ISCU i patientcellerna. Detta resulterar i att de producerar tillräckligt med ISCU för
att överleva de extrema förhållanden de utsätts för i experimentet. Från ett experiment där man
9
jämförde splitsningen i muskel, hjärta och lever var det bara ca 20 % ISCU som var rättsplitsat i
muskelvävnaden (5).
För att gå vidare med detta experiment skulle man eventuellt kunna förlänga inkubationstiden innan
skörd. Då kanske det visar det sig hur produktionen av proteinerna skiljer mellan friska kontroller och
HML-patienter. Vid tidigare studier, med celler i glukos respektive glukos-fritt medium, med en
inkubationstid på 72 tim, har man kunnat upptäcka skillnader i celldifferentieringen då HeLa celler
dör på grund av glukosbrist (10).
Den slutsats man kan dra av studien var att splitsningen av ISCU inte påverkas om patientcellerna
eller kontrollcellerna inkuberas i högt eller glukosfritt medium. Den skillnad man såg var bland annat i
hypoxi proverna vid fragmentanalysen. Trots det är skillnaderna inte tillräckligt stora för att någon
slutsats ska kunna dras utan ytterligare experiment. Resultaten skulle kunna tyda på att den
producerande mängden av rättsplitsat ISCU är tillräckligt för att patientcellerna utan problem skulle
kunna klara av hypoxi och inkubering i glukosfritt medium i 24 timmar och därför ses ingen tydlig
påverkan på splitsningen.
Vid hypoxi experimentet skulle en reducering av syre-nivån från 1 % till 0,1 % kunna göras för att se
om skillnaden i splitsning jämfört med celler i normoxi är tydlig. Detta skulle kunna bidra till
kunskapen om hur yttre faktorer som hypoxi och glukosnivåer påverkar splicingen av muterat ISCU
vid Linderholms myopati.
10
Tack tillägnas
Jag vill tacka min handledare professor Monica Holmberg vid Institutionen för Medicinsk
biovetenskap, avdelningen för Medicinsk genetik, Umeå universitet, för bra handledning. Jag vill även
visa min uppskattning till Denise Rawcliffe och Lennart Österman för teknisk assistans med de
laborativa momenten i denna studie.
11
Referenser
1. Drugge U, Holmberg M, Holmgren G, Bela G L Almay, Linderholm H. Hereditary myopathy with
lactic acidosis, succinate dehydrogenase and aconitase defiency in northern Sweden: a genealogical
study. J Med Genet. 1995;32:344-347.
2. Olsson A, Lind L, Thornell L E, Holmberg M. Myopathy with lactic acidosis is linked to
chromosome 12q23.3-24.11 and caused by an intron mutation in the ISCU gene resulting in a
splicing defect. Hum Mol Genet. 2008;17:1666-1672.
3. Larsson L. –E, Linderholm H, Müller R, Ringqvist T, Sörnäs R. Hereditary metabolic myopathy
with paroxysmal myoglobinuria due to abnormal glycolysis. J. Neurol Neurosurg Psychiat. 1964;
27:361.
4. Mochel F, Knight M A, Tong W-H, Hernandez D, Ayyad K, Taivassalo T, Andersen P M, Singleton
A, Rouault T A, Fischbeck K H, Haller R G. Splice Mutation in the Iron-Sulfur Cluster Scaffold
Protein ISCU Causes Myopathy with Exercise Intolerance. A J Hum Genet. 2008;82:652-660.
5. Nordin A, Larsson E, Thornell L-E, Holmberg M. Tissue-specific splicing of ISCU results in a
skeletal muscle phenotype in myopathy with lactic acidosis, while complete loss of ISCU results in
early embryonic death in mice. Hum Genet. 2011;129:371-378.
6. Cecchini G. Function and structure of complex II of the respiratory chain. Annu Rev Biochem.
2003;72:77-109.
7. Haller RG, Henriksson KG, Jorfeldt L, Hultman E, Wibom R, Sahlin K, Areskog NH, Gunder M,
Ayyad K, Blomqvist CG, et al. Defiency of skeletal muscle succinate dehydrogenase and aconitase.
Pathophysiology of exercise in a novel human muscle oxidative defect. J Clin Invest. 1991;88:1197206.
8. Favari E, Ramachandran A, McCormick R, Gee H, Blancher C, Crosby M, Devlin C, Blick C, Buffa F,
Li J-L, Vojnovic B, Pires das Neves R, Glazer P, Iborra F, Ivan M, Ragoussis J, Harris A L.
MicroRNA-210 Regulates Mitochondrial Free Radical Response to Hypoxia and Krebs Cycle in
Cancer cells by Targeting Iron Sulfur Cluster Protein ISCU. PLoS One. 2010; 5: e10345.
9. Rawcliffe D. Muscle Specific Aberrant Splicing of Mutated ISCU in Hereditary Myopathy with
Lactic Acidosis. Unpublished Data.
10. Caro-Maldando A, Tait S W G, Ramirez-Peinando S, Ricci J-E, Fabregat I, Green D R, MuñozPinedo C. Glucose deprivation induces an atypical form of apoptotis mediated by caspase-8 in Bax-,
Bak-deficient cells. Cell Death Different. 2010;17:1335-1344.
12
E1a
E1b
E2
E3
E4
E1a
E5
? In5
E2
E1 a
E3 E4
E2
E3
? In5
E4
E5
E5
Figur 1 Schematisk representation av ISCU-genen med intronsekvens 4 mellan exon 4 och 5. Patienter
med hereditär myopati med laktacidos har en mutation G->C i intron 4 av genen ISCU. Mutationen
leder till felsplitsning av mRNA. Vid PCR amplifieras området mellan exon 3 och exon 5 med forward
och reverse primer vilket ger en produkt på 419bp för vildtyp (WT) vid korrekt splitsning och en
produkt på 519 bp då intronsekvens inkluderats vid splitsning för muterad (MUT) sekvens.
13
Figur 2 RNA reverse-transkriberades till cDNA och amplifierades med PCR. Analys av RT-PCR
produkterna utfördes med gelektrofores på 1,2% agarosgel. Fel-splitsat ISCU (MUT: muterat) 519 bp.
och korrekt splitsat ISCU (WT:vildtyp), 419 bp. RNA extraherades från myoblaster från en frisk
kontroll (C) och från myoblaster från en patient med hereditär myopati med laktacidos (P).
Myoblasterna hade inkuberats i högt glukos (+) 25 mM eller glukosfritt (-) medium (övre panel) eller
vid normoxi, 20% syre (N) eller hypoxi 1% syre (H). (n=1)
14
A
Glucose
100%
MUT 100
90%
MUT 86
80%
WT
U 70%
C
SI 60%
l
at 50%
o
t f 40%
o
%30%
20%
10%
0%
B
C+
P+
C‐
P‐
Hypoxi
100%
MUT 100
90%
MUT 86
80%
WT
U70%
C
SI 60%
l
at 50%
o
t f 40%
o
%30%
20%
10%
0%
CN
PN
CH
PH
Figur 3 Den relativa nivån av rättsplitsat (WT: vildtyp) respektive felsplitsat (MUT: muterat) ISCU i
myoblaster från patient med hereditär myopati med laktacidos analyserades genom fragmentanalys av
PCR-amplifierat cDNA. (A) Relativa nivåer av MUT100 och MUT86 samt WT ISCU i celler inkuberade
i högt glukos (+) respektive medium utan glukos (-). (B) Relativa nivåer av MUT100 och MUT86 och
WT ISCU i celler inkuberade vid normoxi, 20% (N), respektive hypoxi, 1% (H).
15
Figur 4 Western blot visar nivåer av aconitase (ACO), succinatdehydrogenas (SDHB), iron-sulfur
cluster scaffold protein (ISCU) och glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH: intern kontroll) i
proteinextrakt från myoblaster från kontroll (C) och patient (P) med hereditär myopati med
laktacidos. Cellerna hade inkuberats i medium utan glukos (-) respektive medium med högt glukos, 25
mM (+). (n=1)
16
Figur 5 Western blot visar nivåer av aconitase (ACO), succinatdehydrogenas (SDHB), iron-sulfur
cluster scaffold protein (ISCU) i proteinextrakt från från myoblaster från kontroll (C) och patient (P)
med hereditär myopati med laktacidos. Cellerna var inkuberade vid normoxi, 20 % (N) respektive
hypoxi, 1 %, (H). (n=1)
17
