Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet Resistenta bakterier — ett hot mot mänskligheten Jonas Stenhoff Bakterier är nödvändiga för människan på många sätt. De är närvarande i stort sett överallt i vår omgivning och finns även i stor mängd inuti oss (ca 2 kg). Dessa inneboende är helt nödvändiga för att vi skall överleva. Bland annat hjälper de oss med att bryta ned vissa substanser vi får i oss via födan som vi inte kan bryta ned själva. Dock är det viktigt att bakterierna håller sig till de platser i kroppen där de får vara, t.ex. i magtarmkanalen. De får inte heller äta upp näringsämnen som människan behöver eller producera ämnen som är skadliga för oss. Händer detta blir vi sjuka. Beroende på vilken bakterie det är som åsamkar oss en sjukdom kan läkarna välja på en mängd olika s.k. antibiotika. Antibiotika är ämnen, producerade av mikroorganismer eller syntetiserade av kemikalier, med förmåga att hindra bakterieväxt eller döda bakterier. Bakteriers förmåga att stå emot och överleva behandling med antibiotika är dock ett tilltagande bekymmer. Detta beror ofta på bakteriers förmåga att snabbt anpassa sig, och därmed överleva under nya omständigheter. Ett exempel på detta kan vara att en patient inte sköter sin medicinkur ordentligt. Detta kan då leda till att den sjukdomsalstrande bakterien inte dödas utan i stället anpassar sig till att leva i närvaro av antibiotika; den utvecklar resistens. Bakteriers resistens mot antibiotika har många olika grunder. För det första omger sig bakterier med en cellvägg som kan vara svårgenomtränglig för antibiotika. Det kan även finnas vissa proteiner inne i bakteriecellen som kan bryta ned och oskadliggöra antibiotika. Därtill finns andra proteiner som kan fånga upp antibiotikamolekyler inne i bakteriecellen och föra ut dem ur cellen igen, så kallade efflux-pumpar. Ett annat sätt är att bakteriens DNA muteras på vissa specifika platser. Eftersom DNA är informationen utifrån vilken proteiner tillverkas kan en mutation ändra ett proteins uppbyggnad. Om denna ändring i proteinets s.k. aminosyrasekvens sker på den plats där ett antibiotikum vanligtvis binder till proteinet, och hindrar det från att fungera, kan detta leda till att detta antibiotikum inte längre verkar. I mitt examensprojekt har jag studerat två gener i en bakterie vid namn Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kan förorsaka urinvägs-, sår- och luftvägsinfektioner i människor vars immunförsvar är försvagat. Speciella riskgrupper är bl.a. patienter med cystisk fibros, cancerpatienter samt patienter som behöver lång vistelse på intensivvårdsavdelningar. De två generna heter gyrB och parE . Dessa kodar var för sig för delar av ett protein, s.k. subenheter, som sedan tillsammans med andra subenheter utgör ett fungerande protein. Två GyrB-subenheter bildar tillsammans med två GyrA-subenheter ett protein som heter gyras vilket har till uppgift att underhålla strukturen på DNA:t i cellen. På liknande sätt bildar två ParEsubenheter tillsammans med två ParC-subenheter ett protein vid namn topoisomeras IV. Detta proteins huvudsakliga funktion är att frigöra DNA som sitter ihop, t.ex. efter en replikation, så att bakterien sedan kan dela sig och bilda två bakterier, båda med varsin kromosom. Man har tidigare visat att vissa mutationer i gyrA och parC gör att en grupp antibiotika vid namn kinoloner inte verkar lika effektivt. Vår frågeställning var om mutationer i de andra subenheterna GyrB och ParC bidrog till resistensen. I de 20 kliniska stammar av Pseudomonas aeruginosa jag studerade med hjälp av DNA-sekvensering hittades några mutationer i gyrB och parC som eventuellt kan bidra till kinolonresistens. Dock återstår att testa om de verkligen är resistensgivande vilket görs genom att man ersätter den normala genen i en icke-resistent bakterie med en gen som har den mutation man vill testa. Ökar bakteriens resistens då antyder det att mutationen verkligen är en bidragande faktor till resistensen. Det är viktigt att kartlägga möjliga resistensgivande mutationer eftersom man genom denna kunskap kan få möjlighet att tillverka nya antibiotika som verkar på andra delar av proteinet. Dessutom kan man avgöra huruvida vissa antibiotika skall användas, t.ex. om de bör undvikas p.g.a. att bakterier lätt muterar som svar på dem eller om en blandning av olika antibiotika (en cocktail) ger ett bättre behandlingsresultat. Swedish official title: Mutationer i gyrB och parE generna i florokinolonresistenta stammar av Pseudomonas aeruginosa Swedish credits: 20p E-mail address of first author: [email protected] Supervisor: Doc. Lars-Olov Hedén , Dept. of Microbiology Submission date/time: 2001-11-27 Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet Mutations in the gyrB and parE Genes in Fluoroquinolone Resistant Isolates of Pseudomonas aeruginosa Jonas Stenhoff Biology, Microbiology Spring 2000 Abstract in English Alterations in the target enzymes DNA gyrase and topoisomerase IV and/or reduction of the intracellular concentration of antibiotics due to efflux systems constitute the principal mechanism of quinolone resistance in bacteria. In this study we examined 19 clinical strains of Pseudomonas aeruginosa for mutations in the genes gyrB and parE , encoding the corresponding subunits of gyrase and topoisomerase IV, respectively. A previous study by Jalal and Wretlind had shown these strains to harbour mutations in other genes participating in fluoroquinolone resistance. Therefore, the aim of this study was to determine the relative contribution of mutations in gyrB and parE to quinolone resistance. Sequence analysis showed that four strains had mutations in gyrB with possible connection to quinolone resistance. Three strains harboured novel parE mutations situated in the putative quinolone resistance determining region of the gene. Our data support the hypothesis that high-level resistance is the result of an accumulation of mutations in the target genes and/or efflux systems.