_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
KORTSVARSFRÅGOR (brief answer)
1. Vilka parametrar påverkar kristallisationsprocessen. Kortfattad diskussion.
(2 p)
(SVAR: PROTEINKONCENTRATION; TEMPERATUR; pH; SALTHALT;
KONCENTRATION AV KRISTALLISATIONSMEDEL (t ex ammoniumsulfat))
2. Du har överuttryckt en proteindomän som ingår i ett protein med flera
domäner, men tyvärr är den enskilda domänen inte vattenlöslig. Man vet att en
del av domänen ingår i ett β-flak som i det intakta proteinet binder till en annan
domän, och man vet att fenylalaninen i sekvensen nedan, som ingår i β-flaket, är
i direkt kontakt med denna andra domän:
Ala – Phe – Val – Ile – Gly – Val – Ala – Leu –
Vilken/vilka mutation(er) skulle man kunna introducera i denna sekvens för att
förbättra domänens löslighet? Motivera ditt svar. (2 p)
(SVAR:MUTERA VARANNAN AMINOSYRA (INKLUDERANDE PHE) TILL EN
POLÄR – I ETT β-FLAK ÄR VARANNAN AMINOSYRA ”UTÅT” (OCH DE ANDRA
”INÅT”) SÅ OM VI BYTER HYDROFOBA MOT HYDROFILA PÅ DET SOM NU ÄR
UTSIDAN BÖR LÖSLIGHETEN BLI BÄTTRE)
1
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
3. När kan man använda homologimodellering, och hur går det till i huvuddrag?
(4 p)
(SVAR: HAR SEKVENS OCH VILL HA 3D-STRUKTUR; HITTA HOMOLOGT
PROTEIN MED KÄND STRUKTUR; SEKVENSALIGMENT; ÖVERFÖR
KOORDINATER TILL MIN SEKVENS FRÅN KÄNDA STRUKTUREN DÄR DET
PASSAR; BYGG LOOPAR SOM SAKNAS, T EX FRÅN DATABAS ÖVER LOOPAR;
BYGG SIDOKEDJOR SOM SAKNAS; FÖRFINA MODELLEN; UTVÄRDERA
MODELLEN)
4. Vi känner bara till ett litet antal 3D strukturer för membranbundna
proteiner. Varför är det så? Vilka metoder kan man använda för
strukturbestämning av membranproteiner. (2 p)
(SVAR: MEMBRANPROTEINER ÄR HYDROFOBA OCH ALLTSÅ INTE
VATTENLÖSLIGA, NMR OCH RÖNTGENKRISTALLOGRAFI ÄR DÄRFÖR SVÅRA.
PROTEINERNA KAN IBLAND GÖRAS VATTENLÖSLIGA MHA DETERGENTER;
DET HAR HITTILSS VARIT SVÅRT ATT ÖVERUTTRYCKA
MEMBRANPROTEINER; EM ÄR BRA FÖR MEMBRANPROTEINER SOM KAN
BILDA 2D-KRISTALLER, VILKA KAN ANVÄNDAS I EM)
2
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
5. Nedanstående figur är en schematisk bild av en del av ett komplex mellan det
genreglerande proteinet Zif268 och DNA. Vilken funktion har den avbildade
aspartaten? Motivera kortfattat. (3 p)
(SVAR: SEVENSSPECIFIK IGENKÄNNING; ASP SIDOKEDJAN VÄTEBINDER
TILL EN BAS)
H
C
H
N
C
O
N
Zif268
P
O
Zif268
P
3
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
6. Definiera följande begrepp
(4 p)
a. Konstitutionell kromosomavvikelse
b. Förvärvad kromosomavvikelse
c. Numerisk kromosomavvikelse
d. Strukturell kromosomavvikelse
Svar:
a. Finns vid befruktningen, finns i kroppens alla celler
b. Uppkommer senare i livet finns endast i en del av kroppens celler t ex cancer
c. Förändringar i ploidi graden ex haploidi =n, triploidi =3n, aneuploidi ex trisomi
2n+1
d. Ombyggnad av kromosomer. Ex deletioner, Inversioner, Robertsonska
translokationer, reciproka translokationer
7. Vad är ett mikrodeletionssyndrom? Nämn ett exempel. Hur diagnostiseras
dessa lättast? (3 p)
Svar:
a) En förlust av genetiskt material som är så liten att den är svår eller omöjlig att
se cytogenetiskt (ur molekylärgenetisk synvinkel är de dock oftast stora och
involverar vanligen flera gener).
b) CATCH22/ DiGeorge, Williams, Prader-Willi, Angelman, mfl
c) FISH
4
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
8. Hur vet man om en s.k. vanlig sjukdom har en genetisk komponent?
(nämn minst 2 faktorer) (2 p)
•
•
•
•
Svar:
Ansamling av sjuka i familjer
Ökad relativ risk i familjer; RR= upprepningsrisken i familjen/risken i
population
Heritabilitet (dataanalys som kan räkna ut om gener spelar en roll i
sjukdomsuppkomst)
Tvillingstudier (där man jämför hur ofta monozygota tvillingar har samma
sjukdom och hur ofta bara en av dem är sjuk. I det första fallet är genetiska
faktorer viktiga och i det senare fallet är miljöfaktorer viktigare eftersom
genuppsättningen hos monozygota tvillingar är identisk)
9. En kvinna vars två yngre bröder haft Duchennes muskeldystrofi väntar sitt
första barn. Den ena av bröderna avled i 20-årsålder, men den yngre är ännu i
livet. A) Hur stor är risken att det väntade barnet får sjukdomen? B) Vilka är
möjligheterna till genetisk diagnostik? (2 p)
Svar:
A) 1/2 (risken att probanden bär anlaget) x 1/2 (risken att avkomman ärver den
sjuka X-kromosomen) x 1/2 (risk att barnet är en pojke) = 1/8 (2p)
B) Genetisk diagnostik med PCR kan påvisa deletioner i dystrofingenen i ca 70% av
alla sjuka pojkar med DMD. Om en sådan mutation kan påvisas hos den sjuke pojken
kan anlagsbärartest med FISH erbjudas kvinnan. Om hon är anlagsbärare kan också
fosterdiagnostik utföras om hon blir gravid och fostret visats vara en pojke.
(2p)
5
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
10. Lenas bror avled i späd ålder i en autosomalt recessiv sjukdom. I Lasses släkt
har ingen haft denna sjukdom. Lasse och Lena är inte släkt. Sjukdomens
incidens i befolkningen är 1/40 000. Varken prenatal diagnostik eller bärar
diagnostik är möjlig.
a) Hur stor är risken att Lasse respektive Lena är anlagsbärare?
b) Hur stor är risken att parets första barn får sjukdomen?
( 3 p)
Svar: Lena risk 2/3, Lars risk 1/100 (hur man kommit fram till detta måste redovisas),
barnets risk: 2/3 x 1/100 x 1/4 = 1/600
11. Du gör en BLAST-sökning med protein X mot GenPept databasen. Du får
upp två träffar: protein Y och Z. Protein Y har en expect (E) value på 0 när den
jämförs med protein X. Protein Z har en expect value på 1 när den jämförs med
protein X. Vilket av följande påståenden är korrekt? (1 p)
A.
B.
C.
D.
Både Y och Z är signifikanta träffar (dvs homologer till X).
Varken Y eller Z är signifikanta träffar.
Endast Y är signifikant.
Endast Z är signifikant.
(correct answer is C)
12. Hur uppstår paraloga gener? (1 p)
(answer: genom DNA duplikationer)
13. Why can we be certain that yeast Sacharomyces cerevisiae has no homologues
of the vertebrate nuclear receptor family? ( 1 p)
Because the entire yeast genome sequence is known and homology search revealed
the lack of any nuclear receptor-like protein coding sequences.
6
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
18. What "features" make C. elegans a good model system for molecular biology.
(2 p)
Small size,
transparent, whole developent can be followed life under the microscope complete
cell lineage, cell division pattern known all cells, neurons known
complete nervous system wiring known
fast reproductive cycle (3 days)
large brood size (200-300 progeny)
easy to maintain on agar plates with e. coli stocks can be frozen
short life span (this is mainly useful for aging studies, otherwise perhaps not so
useful)
hermaphrodite and male sexes, hermaphrodite self-fertilizing, thus easy to maintain,
easy to obtain isogenic strains. But still easy to do genetic crosses, since males
available.
complete sequence known (not so special anymore)
19. Which two major technologies exist to study the function of a gene (not its
expression!) in C. elegans, when initially only the sequence is known. (1 p)
RNAi, RNA interference
Gene knock-outs generated by mutagenesis, identified by PCR. This can be either
straight mutagenesis and identification by PCR.
Or by using strains with transposons hopping around, identify the transposon insertion
by PCR (or get transposon strains from the genome center) and then identify deletions
when the transposon jumps out.
20. Describe at least two features that discriminate apoptosis from necrosis.
Describe at least two biological processes where apoptosis is relevant for
“normal” development to occur. (2 p)
cell swelling due to injury, “unscheduled” (necrosis) versus cell shrinkage as part of a
“scheduled” removal of the cell undergoing apoptosis (apoptosis)
cell lysis due to cytoplasma membrane integrity loss (necrosis) versus break-up of cell
into apoptotic bodies that keep the cytoplasma membrane intact (apoptosis)
7
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
organelles become dysfunctional early in the process (necrosis) versus late in the
process (apoptosis)
random DNA/chromosome/chromatin degradation (necrosis) versus ordered
disintegration of DNA/chromosome/chromatin into nucleosomal fragments
(apoptosis)
21. List at least three types of histon modifications and the enzymes carrying out
these modifications. (3 p)
phosphorylation, acetylation, methylation, ribosylation, ubiqutination
22. Name at least two discoveries that have been crucial for the development of
molecular (DNA) cloning techniques. (1 p)
tex: restriction enzymes, DNA ligase, reverse transcriptase, PCR …
24. Explain why the human transcription factor X can function at the same
target gene as an activator in one cell type but as an repressor in another cell
type ! (2 p)
Cell-type specific composition of coactivators and corepressors
25. What is the general purpose of developing synthetic drugs for nuclear
receptors. Give one example of specific medical relevance. (2 p)
To modulate receptor activity (agonists to enhance, antagonists to inhibit) and thereby
to prevent or treat disease conditions.
Examples:
Inhibition of estrogen receptors in breast cancer cells by using anti-estrogens
(tamoxifen, raloxifen)
Activation of glucocorticoid receptor in anti-inflammatory processes by using
synthetic glucocorticoids
8
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
26. Describe some general features of transcriptional co-regulators and give one
specific example for coactivators with chromatin-modifying activities. (3 p)
enhance of inhibit the transcriptional activity of DNA-bound transcription factors
do not directly bind to DNA
directly interact with DNA-bound transcription factors
function often in multi-protein complexes
often larger, multidomain proteins
Example: HAT (histone acetyltransferases) e.g. SRC1, p300/CBP, PCAF, GCN5
27. Nämn två fördelar med att använda tetracyklinreglerad genexpression
i en cell i jämförelse med transient transfektion. Vilken bild beskriver vilket
system TET-OFF respektive TET-ON? (2 p)
all cells are transfected and thus express protein
protein expression levels can be regulated by tetracyclin-dose
cell-toxic effects of protein expression can be avoided
28. Describe (rita gärna) the three different type of plasmids which are
components of a mammalian two-hybrid system. Explain what type of protein is
expressed – and for what reason - from each of these plasmids! (3 p)
DNA-binding domain (e.g. GAL4, lexA) - protein X hybrid (bait)
Activation domain (e.g. GAL4, VP16) – protein Y hybrid (prey)
Reporter plasmid (e.g. GAL4-responsive luciferase reporter)
29. När kan man tänka sig att peptiden SSNHQSSRLIELLSR binder till en
nukleär receptor och varför? (1 p)
När receptorn befinner sig i en aktiv konformation och har bundit en agonist
(estrogen), då bildas en yta för LXXLL motiv som ofta finns i coaktivatorer.
9
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
30. Fluorescence cell imaging: Describe how FRAP works. (1 p)
You bleach an area where the fluorescent protein is localized and then take time laps
images to study the recovery of fluorescence.
31. Beskriv hur en vektor som används till att framställa knockout möss kan se
ut. (1.5 p)
SV. Den ska innehålla en positiv selektionsmarkör (vanligen neo) som flankeras av
isogent DNA (c:a 5 kb på var sida) där homolog rekombination kan ske. Vektorn ska
vara konstruerad så att en mutation som förstör en specifik gen skapas, t. ex en viktig
exon tas bort eller ett stopp kodon i den kodande regionen bildas. Dessutom bör
vektorn innehålla en negativ selektionsmarkör i ena ändan av konstruktionen för att
hindra slumpvis integrering av konstruktet i genomet.
32. Name at least three different methods to study protein-protein interactions.
(1.5 p)
GST-pull-down
two-hybrid assay
co-immunoprecipitation
SPR (surface plasmon resonance) / BIAcore
FRET (fluorescense energy transfer)
10
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
BERÄTTARFRÅGOR (essay-type longer answer)
33. Western blot analysis and immunohistochemistry of many tissues and cell
lines shows that protein X is exclusively expressed in the cytoplasm of the human
breast cancer cell line MCF-7. Explain all experimental steps which are
necessary to clone the cDNA encoding protein X. (Note: The protein/cDNA is
novel and not available from other researchers or commercial suppliers, so you
have to clone it yourself!) (6 p)
Common steps:
Isolate mRNA from the MCF-7 cell line
make cDNA using reverse transcription
Alternative A:
generate a cDNA expression library
immunoscreen using antibody against protein X (expression cloning)
isolate positive clones
sequence the cDNA inserts
Alternative B:
We assume the amino acid sequence of protein X is known (since we can predict all
human proteins / open reading frames):
BLAST search to obtain the corresponding cDNA sequence encoding protein X
Design of 5´and 3´PCR primers to amplify the full coding region (5´ATG-3´Stop
codon)
PCR using MCF-7 cDNA and TAQ polymerase
Cloning of the PCR-products into T-vectors (to propagate stable clones in a plasmid)
Direct sequencing to confirm DNA sequence identity (absence of PCR-based
mutations)
11
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
34. Beskriv kortfattat principerna för FRET (Förster Radiationless Energy
Transfer / Fluorescence Resonance Energy Transfer) och ge minst två exempel
på molekylär- eller cellbiologisk tillämpningar. (6 p)
(SVAR: TVÅ KROMOFORER DÄR DEN ENAS (DONOR) EMISSION MATCHAR
DEN ANDRAS (ACCEPTOR) ABSORPTION; EXCITATION AV DONOR I
NÄRVARO AV ACCEPTOR GER FLUORESCENS FRÅN ACCEPTORN; BEROR PÅ
AVSTÅNDET; SAMLOKALISERING ELLER KONFORMATIONSOMVANDLING)
12
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
89 p
(vg 89 - 71, g 70 – 48, u 47 – 0)
5.
(5 p)
Du har transfekterat celler med tre olika plasmider som kodar för tre olika
mutanter av en transkriptionsfaktor. Nu vill du ta reda på vilken mutant som
har bäst transaktiveringsförmåga. För att detektera detta använder du luciferas
som reportergen vars uttryck aktiveras av dina muterade
transkriptionsfaktorer.
Efter skörd av dina celler har du följande tre prover:
Prov 1 = transfekterad med mutant 1
Prov 2 = transfekterad med mutant 2
Prov 3 = transfekterad med mutant 3
Med hjälp av Bradford metoden vill du bestämma proteinhalten i dina prover.
(A) Rita med hjälp nedanstående data en standardkurva ur vilken du
bestämmer total proteinmängd i dina prov. Din totala provvolym är 100 l och
du har mätt absorbansen på 1 l resp. 10 l av varje prov.
Proteinbestämning
Abs 595 nM
13
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
g BSA
Absorbans
595nM
0
200
400
600
800
1000
1100
1200
1100
1200
1100
Prov 1
Prov 2
Prov 3
1 l
1 l
1 l
Absorbans
595nM
500
200
800
Prov 1
Prov 2
Prov 3
10 l
10 l
10 l
1000
1100
1200
14
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
(B) Efter att du mätt luciferasaktiviteten på 10 l av ditt prov får du följande
data :
luciferasaktivitet
2000
1000
400
Prov 1
Prov 2
Prov 3
Viken mutant har bäst transaktiveringsförmåga?
SVAR: Rita en standardkurva. Använd data från 1 l provvolym som hamnar inom
det linjära området för att beräkna proteinmängden i resp. prov. (2p)
Proteinbestämning
1400
1300
1200
1100
1000
Abs 595nM
900
800
700
Abs 595 nM
600
500
400
300
200
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
mg protein
Prov 2
= 2µg/µl
Prov 1
= 5µg/µl
Prov 3
= 8µg/µl
1) SVAR: Total proteinmängd (1p)
Prov 1 = 5 g/ l x 100 l = 500 g
Prov 2 = 200 g
Prov 3 = 800 g
2) SVAR: Mutant nr:2 har högst transaktiveringsförmåga
50 luciferasenheter/ g protein
Luciferasvärderna skall normaliseras mot proteinhalten.
15
20
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
Proteinhalt i 10 l provvolym: (1p)
Prov 1: 5 g/ l x10 l=50 g
Prov 2: 20 g
Prov 3: 80 g
Luciferasaktivitet/ g protein skall beräknas (1p)
Luciferasaktivitet/10 l prov
Prov 1: 2000
Prov 2: 1000
Prov 3: 400
Prov 1: 2000/50 g prot = 40 luc.akt/ g prot
Prov 2: 1000/20 g prot = 50 luc.akt/ g prot
Prov 3: 400/80 g prot = 5 luc.akt/ g prot
16
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
Tentamen
Molekylärbiologi T3 / HT04
2004-10-28
36. Choose to answer only ONE of the two following questions:
36 A.The transcription factor A2 is a ligand-dependent DNA binding protein the
regulates gene expression by binding to A2 response elements in the 5`regulatory
region of its target genes, such as TG1. Describe how you would design a ChIP
(chromatin immunoprecipitation) assay to verify the recruitment of
transcription factor A2 to the TG1 gene using immortalized human cells, and
summarize the expected results. (6 p)
The students should mention that they need an antibody to A2, and they must design
PCR primers to amplify the TG1 gene promoter containing the A2 response element.
They should also mention that the cells would be treated with ligand, cross-linked,
sonicated, immunoprecipitated with anti A2 antibody. The sequences should be
amplified by PCR and separated by agarose gels. An amplified band should be visible
in the treatment lane but not in the time 0 or untreated lane. Bands should be visible
all total samples.
OR
36 B. Describe in detail how in vitro transcription assays works and the
important components of the assay. (6 p)
Answer: A DNA or chromatin template with binding sites for an activator and a
promoter is incubated with an activator and appropriate cofactors (optional) to allow
for factor binding. RNA polymerase II, GTFs (general transcription factors) and
cofactors, either as recombinant purified factors or in HeLa nuclear extract, are added
to allow for preinitiation complex formation and after further incubation rNTPs are
added to allow for transcription initiation. RNA analysis can de done by using a Gless cassette or with primer extension assay.
17
