Enterobacteriaceae och amoxicillin-klavulansyra.

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap
Examensarbete
Enterobacteriaceae och amoxicillin-klavulansyra.
- Effekt av bestämt förhållande respektive bestämd
koncentration av klavulansyra på MIC-värden och
zon/MIC-korrelation.
Liselott Byhlén
Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Nivå: Grundnivå
Nr: 2013:BL4
Enterobacteriaceae och amoxicillin-klavulansyra. Effekt av bestämt förhållande respektive
bestämd koncentration av klavulansyra på MIC-värden och zon/MIC-korrelation
Liselott Byhlén
Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 hp
Biomedicinska analytikerprogrammet, 180 hp
Linnéuniversitetet Kalmar
Kalmar Växjö
Filosofie Kandidatexamen
Extern handledare: Fil. dr, Erika Matuschek
EUCAST Laboratory for Antimicrobial
Susceptibility Testing
c/o Avdelningen för Klinisk Mikrobiologi
Centrallasarettet Växjö
SE-351 85 Växjö
Intern handledare: Fil. dr, Conny Tolf
Institutionen för biologi och miljö
Linnéuniversitetet
SE-395 82 Kalmar
Examinator: Fil. dr, Britt- Inger Marklund
Institutionen för kemi och biomedicin
Linnéuniversitetet
SE-395 82 Kalmar
SAMMANFATTNING
Förekomsten av bakterier med olika typer av resistensmekanismer ökar globalt. De varianter som på
engelska benämns ”Extended spectrum β-lactamases” (ESBL) är en heterogen grupp β- laktamaser
som genom hydrolys inaktiverar β-laktamantibiotika och därigenom ger resistens mot bland annat β
-laktamantibiotika som penicilliner och cefalosporiner. Resistensbestämning på kliniska laboratorier
utförs huvudsakligen med lappdiffusion eller Minimum Inhibiting Concentration (MIC)-bestämning
med gradienttester. Infektioner orsakade av ESBL-producerande organismer kan behandlas med βlaktamantibiotika kombinerat med en β-laktamasinhibitor. I Europa rekommenderas
resistensbestämning med bestämd koncentration β-laktamasinhibitor, men produkter på marknaden
saknas.
Syftet med projektet var att utvärdera olika typer av gradienttester med amoxicillinklavulansyra från två leverantörer (Etest och MIC Test Strip, MTS) och undersöka hur
klavulansyra påverkar resistensbestämningen, samt att se hur resultat från lappdiffusion
korrelerar med resultat från ovan nämnda tester.
Lappdiffusion och MIC- bestämning med gradienttester med antingen bestämt förhållande av
amoxicillin-klavulansyra (2:1) (Etest och MTS) eller bestämd koncentration klavulansyra (2mg/L)
(MTS) utfördes med Escherichia coli (både med ESBL-positiva och ESBL-negativa stammar) samt
med Proteus mirabilis. ESBL-detektion med cefpodoxim och cefpodoxim-klavulansyra utfördes
parallellt.
För P. mirabilis korrelerade lappdiffusionsresultat mycket bra med resultat från samtliga
gradienttester. För E. coli korrelerade lappdiffusionsresultat mycket bra med MIC-värden vid
användning av Etest 2:1 medan MTS 2:1 gav högre MIC-värden än referensdistributionen och
resulterade i sämre korrelation. MIC-bestämning med MTS 2 mg/L resulterade i högre MIC-värden.
Den nuvarande zonbrytpunkten behöver justeras för att korrelera med tolkningen från amoxicillinklavulansyra med bestämd koncentration av klavulansyra 2 mg/L, framförallt för ESBLproducerande E. coli.
ABSTRACT
The presence of bacteria with increased antibiotic resistance increases globally. Extended
spectrum β-lactamases, ESBLs is a heterogeneous group of β-lactamases, which by hydrolysis
inactivate β- Lactam antibiotics that may result in resistance to penicillins and cefalosporins.
Antimicrobial susceptibility testing is commonly performed by disc diffusion or
determination of the Minimum Inhibiting Concentration (MIC) using gradient tests. ESBLproducing organisms may be treated by β- Lactam antibiotic and β-lactamase inhibitor
combinations.
The purpose of this study was to evaluate various gradient tests of amoxicillin-clavulanic acid
from two suppliers and to examine the impact of clavulanic acid in antimicrobial
susceptibility testing. The correlation between disc diffusion results and gradient testresults
was also investigated.
Disc diffusion and gradient MIC testing with either a fixed ratio of amoxicillin-clavulanic
acid 2:1 (Etest and MIC Test Strip, MTS) or fixed concentration of clavulanic acid 2 mg/L
(MTS) were performed with Escherichia coli (with and without ESBL) and Proteus mirabilis.
ESBL detection using cefpodoxime and cefpodoxime-clavulanic acid was performed
simultaneously.
For P. mirabilis, disc diffusion results correlated well with results from all gradient tests, i.e
isolates with small inhibition zones had high MICs and vice versa.. For E. coli, disc diffusion
correlated well with Etest 2:1, whereas MTS 2:1 resulted in higher MIC values and a poorer
correlation. MTS with a fixed concentration of clavulanic acid 2 mg/L resulted in higher MIC
values.
A small adjustment of the zone diameter breakpoint is required for amoxicillin-clavulanic
acid to correlate with a fixed concentration of clavulanic acid 2 mg/L.
i
INNEHÅLL
ABSTRACT ............................................................................................................................................. i
INNEHÅLL ..............................................................................................................................................ii
FÖRKORTNINGSLISTA ....................................................................................................................... iv
INTRODUKTION .................................................................................................................................. 1
Antibiotika, verknings- och resistensmekanismer ............................................................................... 1
Extended Spectrum β-lactamases ........................................................................................................ 2
Kända ESBL-varianter ........................................................................................................................ 2
ESBLA .............................................................................................................................................. 2
ESBLM .............................................................................................................................................. 2
ESBLCARBA ........................................................................................................................................ 3
ESBL idag ........................................................................................................................................... 3
Behandling av infektioner orsakade av ESBL-producerande bakterier .............................................. 3
Metoder för resistensbestämning samt detektion av ESBL-producerande bakterier........................... 4
Resistensbestämning........................................................................................................................ 4
Lappdiffusion ................................................................................................................................... 4
MIC-bestämning med gradienttest .................................................................................................. 4
Metoder för detektion och karaktärisering av ESBL ....................................................................... 5
Resistensbestämning med β-laktam/β-laktamasinhibitorer-kombinationer .................................... 6
SYFTE..................................................................................................................................................... 6
MATERIAL OCH METOD .................................................................................................................... 7
Etiskt perspektiv .................................................................................................................................. 7
Resistensbestämning ........................................................................................................................... 7
Utförande ........................................................................................................................................ 7
Avläsning ......................................................................................................................................... 7
Påvisning av ESBL .......................................................................................................................... 8
AmpC- Etest......................................................................................................................................... 8
Buljongspädning.................................................................................................................................. 8
Kvalitetskontroll .............................................................................................................................. 8
Statistisk analys ................................................................................................................................... 8
RESULTAT ............................................................................................................................................ 9
MIC-distributioner .............................................................................................................................. 9
Jämförelse av gradienttester ......................................................................................................... 13
Jämförelse av gradienttester och mikrobuljongspädning ............................................................. 14
Zondistributioner ............................................................................................................................... 15
Korrelation mellan hämningszoner och MIC-värden ........................................................................ 16
ii
DISKUSSION ....................................................................................................................................... 20
Jämförelse av MIC-fördelningar och EUCASTs referensdistributioner ........................................... 20
Jämförelse av de olika gradienttesterna............................................................................................. 20
Zon/MIC-korrelation ......................................................................................................................... 22
Slutsatser ........................................................................................................................................... 22
REFERENSER ...................................................................................................................................... 24
iii
FÖRKORTNINGSLISTA
AMC: amoxicillin-klavulansyra
BMD: Broth Micro Dilution, mikrobuljongspädning
CN: cefotetan
CNI: cefotetan med kloxacillin
CPCV: cefpodoxim med klavulansyra
CPD: cefpodixim
ESBL: Extended Spectrum β-lactamases
EDTA: etylendiamintetraättiksyra
Etest 2:1: Epsilometer test, Gradienttest från BioMérieux, innehåller en
koncentrationsgradient av amoxicillin och klavulansyra med bestämt förhållande 2:1
EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
KPC: Klebsiella pneumoniae cefalosporinaser
MH: Müller Hinton
MIC: Minimum Inhibition Concentration, minsta hämmande koncentration, [µg/ml]
MTS 2:1: MIC Test Strip, Gradienttest från Liofilchem, innehåller en koncentrationsgradient
av amoxicillin och klavulansyra med bestämt förhållande 2:1
MTS 2 mg/L: MIC Test Strip, Gradienttest från Liofilchem, innehåller en
koncentrationsgradient av amoxicillin och en bestämd koncentration klavulansyra [2 mg/L]
PTZ: piperacillin-tazobaktam
iv
INTRODUKTION
Bakteriella infektioner behandlas ofta med antibiotika. Idag förekommer bakterier som är
naturligt resistenta eller genom genmutation utvecklat resistensmekanismer mot antibiotika
och infektioner kan därmed inte behandlas med samma preparat som tidigare (1).
Vid behandling med antibiotika påverkas förutom patogenen även kroppens normala
bakterieflora. Den nya miljön ger möjlighet för andra bakterier att växa och patienter som
behandlas med antibiotika löper därför en större risk att bli infekterade med resistenta
mikroorganismer. Dessa infektioner kan innebära längre sjukdomsförlopp och högre
dödlighet. Antibiotikaresistens förekommer lokalt och dess spridning världen över fortsätter
att öka (2). En stor del resistenta bakterier hittas vid odlingar från urinvägsinfektioner (3).
Resistens mot vanliga orala och intravenösa antibiotika som aminoglykosider, cefalosporiner,
β-laktam/β-laktamasinhibitor-kombinationer och karbapenemer ökar globalt (4). Den höga
konsumtionen av antibiotika i samhället tillsammans med felaktig förskrivning av olika typer
av antibiotika anses vara en bidragande faktor till den ökande frekvensen resistenta bakterier
(1, 3).
Antibiotika, verknings- och resistensmekanismer
Bakteriecellen skiljer sig från människans celler med avseende på dess unika
cellväggsstruktur. Antimikrobiell kemoterapi bygger på selektiv toxicitet. Antibakteriella
ämnen kan verka genom att inhibera uppbyggnaden av bakteriers cellvägg, påverka bakteriers
proteinsyntes eller påverka replikation och transkription av DNA. Relativt få antibiotika
verkar på bakteriers cellmembran eller metaboliska process. Vanligtvis penetrerar antibiotikan
cytoplasmamembranet genom diffusion eller aktiv transport. Resistens mot βlaktamantibiotika kan bero på förändringar som försvårar penetration. Resistens kan även
förekomma i form av β-laktamasproduktion eller mutationer hos PBP (penicillin binding
protein) (5).
Enterobacteriaceae är gramnegativa organismer vars cellvägg består av ett tunt
peptidoglykanlager samt ett yttre cellmembran av ett lipopolysackarid-lipoproteinkomplex.
Det yttre cellmembranet och cytoplasmamembranet hindrar flertalet varianter av antibiotika
att nå till det intracellulära målet. En del antibiotika kan passera akvaporiner i
cytoplasmamembranet för att sedan verka intracellulärt.
Penicilliner, cefalosporiner och andra β- laktamantibiotika inhiberar selektivt olika steg i
uppbyggnaden av cellväggens peptidoglykan och är baktericida, dvs. bakteriedödande. βlaktamasinhibitorer har låg antimikrobiell aktivitet men verkar synergistiskt tillsammans med
β- laktamantibiotika. β-laktamasinhibitorer verkar kompetitivt på β-laktamasenzymet och
bildar ett komplex där både enzymet och inhibitorn inaktiveras (5).
1
Extended Spectrum β-lactamases
Bakterier som producerar enzymer av typen β-laktamas kan bryta ner β-laktamantibiotika,
främst penicilliner, cefalosporiner men även monobaktamer och karbapenemer. Tredje
generationens cefalosporiner (cefpodoxim, cefotaxim, ceftazidim och ceftriaxon) togs fram
för att bekämpa bakterier med ökad β-laktamasförekomst, främst Escherichia coli och
Klebsiella pneumoniae. När den tredje generationens cefalosporiner introducerades i den
kliniska praktiken på åttiotalet innebar det ett stort genombrott i kampen mot βlaktamasmedierad bakteriell resistens mot antibiotika.
De första kliniska fallen av plasmidburet β-laktamas som kunde hydrolysera tredje
generationens cefalosporiner rapporterades 1983. Även β–laktamaser med förmåga att ge
resistens mot tredje generationens cefalosporiner upptäcktes. De kom att kallas Extended
Spectrum β- Lactamases (ESBLs) (6).
ESBL är en heterogen grupp β- laktamaser som genom hydrolys inaktiverar βlaktamantibiotika och kan ge resistens mot β–laktamantibiotika som penicilliner, första-,
andra och tredje generationens cefalosporiner och monobaktamer som aztreonam (1, 6).
ESBL kan hämmas av β-laktam/β-laktamasinhibitor-kombinationer som exempelvis
amoxicillin-klavulansyra (5).
Cefalosporiner kategoriseras beroende på deras aktivitetsspektrum. Första generationens
cefalosporiner har högre aktivitet mot grampositiva bakterier än mot gramnegativa bakterier.
Andra generationens cefalosporiner har liknande aktivitet som första generationens
cefalosporiner men kan ha något sämre aktivitet mot grampositiva kocker. Tredje
generationens cefalosporiner har högre aktivitet mot gramnegativa än de har mot
grampositiva bakterier. Fjärde generationens cefalosporiner kan användas vid infektioner
orsakade av både gramnegativa och grampositiva bakterier (7).
Kända ESBL-varianter
Överförbara betalaktamaser hos Enterobacteriaceae kan delas in efter deras enzymatiska
nedbrytningsprofil: penicillinaser, cefalosporinaser (ESBL-varianter och plasmidmedierad
AmpC) och karbapenemaser (Metallobetalaktamaser och KPC) (8).
ESBLA
ESBLA är den vanligaste ESBL- typen i kliniska isolat. ESBLA hydrolyserar cefalosporiner
(cefotaxim, cefpodoxim och i viss mån ceftazidim). Denna typ av ESBL kallas klassiskt
ESBL och hämmas av klavulansyra. Klassiskt ESBL har upptäckts i stor utsträckning i
Enterobacteriaceae (6).
ESBLM
AmpC-typ β-laktamas har tredje generationens cefalosporiner som substrat, men hämmas inte
av klavulansyra (6). Den plasmidmedierade AmpC-typen, ESBLM, ger resistens mot
cefotaxim och/eller ceftazidim samt cefoxitin. Även bakterier med klassiskt ESBLA kan vara
ESBLM--positiva (9). Generellt används kloxacillin och fjärde generationens cefalosporiner
mot AmpC-typ β-laktamasproducerande organismer (6).
2
ESBLCARBA
Karbapenemaser (ESBLCARBA) hydrolyserar både cefalosporiner och karbapenemer.
Infektioner med ESBL CARBA anses därför vara mest allvarliga av samtliga ESBLproducerande organismer. ESBLCARBA hämmas av EDTA (Metallolaktamaser) eller borsyra
(Klebsiella pneumoniae cefalosporinaser, KPC) (10).
ESBL idag
ESBL-producerande E. coli är en vanlig orsak till infektioner. Idag finns ESBL-producerande
organismer över hela världen med variation mellan länder och kontinenter. Personer med hög
risk att koloniseras och infekteras med ESBL-producerande organismer är ofta allvarligt sjuka
patienter med långa vistelser på sjukhus eller vårdhem och som behandlas med medicinsk
utrustning som urinkateter, dialys och andningsutrustning (6). Flest ESBL-producerande
organismer hittas bland isolat från urinprover (2). I en studie från 2009-2010 isolerades 3646
isolat av Enterobacteriaceae från urinprover från patienter på sjukhus i Nordamerika och
Europa. ESBL-produktion detekterades från 8,5 % av E. coli i Nordamerika och i 17,6 % av
E. coli i Europa (4). Några andra vanliga bakterier med ESBL-produktion är Proteus
mirabilis, Klebsiella pneumoniae och Enterobacter (6).
Förekomsten av ESBL-producerande stammar av Enterobacteriaceae har fortsatt att öka under
det senaste årtiondet både i Europa och globalt (11). Denna ökning av ESBL- producerande
patogener får terapeutiska konsekvenser vid behandlingar och begränsar
behandlingsalternativen. Det innebär att sjukhusvistelsen förlängs och dödligheten hos
patienter med infektioner ökar samt att vårdkostnaderna ökar (1, 11). Utbrott av ESBLproducerande K. pneumoniae och E. coli där tredje generationens cefalosporiner, främst
ceftazidim har överanvänts, har rapporterats (2).
Behandling av infektioner orsakade av ESBL-producerande bakterier
Eftersom ESBL hämmas av β-laktamasinhibitorer som klavulansyra, sulbaktam eller
tazobaktam, kan en kombination av β-laktamantibiotika och β-laktamasinhibitorer användas
för behandling av infektioner orsakade av ESBL-producerande bakterier (2). Amoxicillinklavulansyra (AMC) och piperacillin-tazobaktam (PTZ) är penicilliner i kombination med βlaktamasinhibitorer som är aktiva mot en stor del av ESBL-producerande Enterobacteriaceae,
särskilt E. coli. Effektiviteten hos β-laktam/β-laktamasinhibitor-kombinationer vid behandling
av allvarliga infektioner orsakade av ESBL-producerande Enterobacteriaceae är
kontroversiell. En del författare rekommenderar inte β-laktam/β-laktamasinhibitorkombinationer, medan andra anser dem vara användbara alternativ. PTZ och AMC ges
intravenöst i Sverige, men AMC kan även tas oralt (12). Karbapenemer påverkas inte av
klassiska ESBL (ESBLA). Karbapenemer anses vara det bästa behandlingsalternativet för
allvarliga infektioner orsakade av ESBL-producerande organismer. Prognosen för patienter
som behandlats med karbapenemer är bättre än för de som behandlats med andra alternativ
som cefalosporiner och fluorokinoloner. Detta kan leda till en ökad konsumtion av
karbapenemer, vilket är problematiskt då karbapenemasproducerande organismer också sprids
i samhället. Av den anledningen behövs fler alternativ till karbapenemer för behandling av
ESBL-producerande bakterier (12).
3
Metoder för resistensbestämning samt detektion av ESBL-producerande bakterier
Resistensbestämning
Vid resistensbestämning prövas ett antibiotikums effekt in vitro, på bakterier som fått växa
under gynnsamma och standardiserade betingelser. Resistensbestämning underlättar för
patientens läkare genom att ge vägledning om vilken antibiotikabehandling som kan ordineras
(13).
Lappdiffusion
En vanlig metod för rutinmässig resistensbestämning som används på de flesta kliniskt
mikrobiologiska laboratorier är den kvalitativa lappdiffusionsmetoden. Vid lappdiffusion
diffunderar ett antibiotikum ut från en papperslapp som innehåller en standardiserad mängd
antibiotika. Det bildas en koncentrationsgradient i fast medium (agar) som har inokulerats
med en bakteriesuspension. Om bakterieväxten hämmas av ett antibiotikum uppstår en
bakteriefri zon runt antibiotikalappen. Den bildade hämningszonens storlek kan korreleras till
bakteriens Minimum Inhibition Concentration (MIC)-värde för medlet. Ju större zon, desto
känsligare är bakterien in vitro. Zonerna tolkas enligt standardiserade tolkningskriterier, så
kallade brytpunkter och isolaten delas in i känslighetsgrupperna SIR, Susceptible/Känslig,
Intermediär eller Resistent. I Sverige används brytpunkter fastställda av EUCAST, European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (13).
Den nordiska referensgruppen för resistensbestämning, NordicAST, rekommenderar två
alternativa metoder för detektion av kliniskt relevanta ESBL. Den ena metoden baseras på
användning av cefpodoxim som screeningslapp. Isolat som karakteriseras som resistent (R)
vid analys med cefpodoxim testas vidare för förekomst av ESBL. I den andra metoden
används cefotaxim och ceftazidim. Om isolatet kategoriseras som R för minst en av dem
enligt gällande europeiska gränsvärden för zondiameter görs ESBL-testning för E. coli och P.
mirabilis. ESBL-testet är ett synergitest som baserar sig på klavulansyras inaktivering av
enzymer och kan göras med lappar eller Etest (8).
MIC-bestämning med gradienttest
Gradienttest är en kvantitativ teknik där bakteriers känslighet för ett antibiotikum bestäms och
används ofta som komplement till resistensbestämning med lappdiffusion. Det finns
gradienttester från tre olika leverantörer på marknaden: Etest (bioMérieux), MIC Test Strip
(MTS, Liofilchem) och M.I.C.Evaluator (Thermo Fisher Scientific). Gradienttester består av
en plast- eller pappersremsa (5 mm bred och 60 mm lång) innehållande en
koncentrationsgradient av antibiotika, oftast från 0,016-256 mg/l. När gradienttestet
appliceras på inokulerad agarplatta frigörs antibiotikan och diffunderar ut i agarn. Då bildas
en kontinuerlig koncentrationsgradient som ger en symmetrisk hämningsellips kring remsan
efter inkubering. Resultatet avläses som den minsta hämmande koncentrationen, MIC, dvs.
den lägsta koncentrationen av det testade antibiotikumet som hämmar bakterietillväxt (figur
1) (14).
4
MIC-bestämning med gradienttest är ett komplement till resistensbestämning med
lappdiffusion och resultaten har i de flesta fall god överensstämmelse med
mikrobuljongspädning, broth micro dilution (BMD) som är referensmetod för MICbestämning. Vid buljongspädning ympas en bestämd mängd bakterier per volym (0.5 ml
buljong med antibiotikum + 0.5 ml bakteriekultur, i "mikro"-skala 50-100 µl/brunn) i rör med
MH- buljong innehållande olika koncentrationer av ett antibiotikum. Det rör med den lägsta
koncentrationen utan bakterieväxt, anger MIC- värdet (15).
Figur 1. MIC-test innehållande en koncentrationsgradient (mg/L) antibiotika. MIC-värdet avläses där
hämningsellipsens kant skär in mot remsan och avrundas till närmsta övre spädningssteg. Det lägsta
spädningssteget är 0,016 mg/L. Nästa spädningssteg är 0,032, följt av 0,064 osv upp till 256 mg/L. Figuren har
en förlaga i Lecorn. et al. (16).
Metoder för detektion och karaktärisering av ESBL
Synergitest för detektion av ESBLA kan utföras med lappdiffusion med cefpodoxim (CPD)
och cefpodoxim med klavulansyra (CPC). ESBLA påvisas om CPC- zonen är ≥ 5 mm större
än CPD- zonen.
Test för detektion av ESBLM kan göras med AmpC Etest innehållande cefotetan med
kloxacillin (CNI) och cefotetan (CN). ESBLM påvisas om kvoten mellan CN och CNI (MICvärden i mg/L) är ≥ 8. Om resistensresultatet vid analys med meropenem är intermediär (I)
eller R bör detta ses som en indikation på förekomst av ESBLCARBA (10). Samtliga ESBLproducerande organismer är anmälningspliktiga till Smittskyddsinstitutet, SMI (17).
Genotypisk karaktärisering av ESBL utförs vanligen med PCR-baserade metoder, men endast
på referenslaboratorier eller laboratorier med specialintresse för ESBL. Genotypisk
karaktärisering är ett komplement till epidemiologiska typningsmetoder, vilket kan vara
värdefullt vid exempelvis utbrottsutredningar (17).
5
Resistensbestämning med β-laktam/β-laktamasinhibitorer-kombinationer
Vid testning av β- laktam/β-laktamasinhibitor-kombinationer in vitro kan man använda
antingen ett bestämt förhållande mellan β-laktam och inhibitor eller en bestämd koncentration
av inhibitorn. Det har förekommit meningsskiljaktigheter om bestämd koncentration inhibitor
eller inhibitor med bestämt förhållande till mängden antibiotika ska användas vid
resistensbestämning. Amoxicillin-klavulansyra med bestämt förhållande ger betydligt högre
koncentration av klavulansyra in vitro, än vad som är kliniskt möjligt i kroppen vid
behandling. Förhållandet mellan amoxicillin-klavulansyra som uppstår i kroppen ser
annorlunda ut än i de farmaceutiska preparationerna och ett bestämt förhållande mellan
substanserna vid infektionsstället erhålls aldrig. European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing (EUCAST) föreslår därför att amoxicillin-klavulansyra med bestämd
koncentration klavulansyra ska tillämpas Det är oklart hur MIC- distributionen för
amoxicillin-klavulansyra bestämd koncentration klavulansyra korrelerar med gällande MICdistribution för amoxicillin- klavulansyra bestämt förhållande. Fram tills nu har det enbart
funnits kommersiella produkter för MIC-bestämning med amoxicillin-klavulansyra i
förhållande 2:1 och EUCASTs nuvarade zonbrytpunkter är kalibrerade mot dessa MIC-värden
(18, 19).
SYFTE
Syftet med projektet var att utvärdera olika typer av gradienttester med amoxicillinklavulansyra från två leverantörer (Etest och MIC Test Strip, MTS) och undersöka hur
klavulansyra påverkar resistensbestämningen, samt att se hur resultat från lappdiffusion
korrelerar med resultat från ovan nämnda tester.
6
MATERIAL OCH METOD
Resistensbestämningar med gradienttester och lappdiffusion utfördes på 253 isolat av P.
mirabilis och E. coli (med och utan ESBL). Isolaten kom från patientprover som analyserats
på avdelningen för klinisk mikrobiologi, Växjö, år 2004-2013.
Etiskt perspektiv
Samtliga bakterieisolat som användes i studien analyserades anonymt och därför behövdes
inget medgivande från patienter. Patientens kön, ålder och bakterieinfektion var okänt för
laboranten.
Resistensbestämning
Utförande
Frysta artidentifierade bakterieisolat i buljong (E. coli och P. mirabilis med eller utan ESBL)
togs upp från frysen. Cirka 1 µl från varje frysprov ströks ut med platinös på blodagarplatta
och inkuberades 18 timmar i 35°C. Material från morfologiskt lika kolonier plockades från
övernattskulturen på blodplattan med steril bomullspinne. En suspension gjordes i 1,5 ml
steril 0,85 % NaCl. Suspensionen justerades till 0,4-0,6 MacFarland genom att tillsätta mer
NaCl-lösning eller fler bakterier. Tätheten för inokulatet mättes med en densitometer
(Densichek), vilken mäter lösningens grumlighet. Överflödig vätska trycktes ut ur
bomullspinnen innan utstrykning för att undvika överinokulering. Inom loppet av 15 minuter
ströks inokulatet på tre agarplattor, Müller Hinton (MH) med hjälp av plattrotator (20).
Inokulatet spreds jämnt över plattan för att erhålla konfluent växt. För varje isolat testades
olika produkter innehållande amoxicillin-klavulansyra enligt följande: antibiotikalapp med 20
µg amoxicillin och 10 µg klavulansyra (AMC 30), Etest (bioMérieux) med amoxicillin och
klavulansyra i förhållande 2:1 (Etest 2:1) samt MIC Test Strip (Liofilchem) med amoxicillin
och klavulansyra i förhållande 2:1 (MTS 2:1) och med bestämd koncentration av klavulansyra
på 2 mg/L (MTS 2 mg/L).
För att undersöka vilka isolat som var ESBL-producerande applicerades även
antibiotikalappar innehållande cefpodoxim 10 µg (CPD 10) samt cefpodoxim 10 µg med
klavulansyra 1µg (CPDCV) (20). Appliceringen gjordes med vakuumapplikator (Nema C88)
inom 15 minuter efter att plattan strukits. Plattorna inkuberades upp-och-ner-vända inom 15
minuter från att lapparna/testerna applicerats. Alla plattor inkuberades i luft i 35° C i 18
timmar innan avläsning (13).
Avläsning
Vid avläsning av zoner runt antibiotikalappar togs hänsyn till all växt som syntes med blotta
ögat (100 % hämning) när plattan hölls på en armlängds avstånd. MH- plattor med
antibiotikalappar lästes från baksidan av plattan mot en svart bakgrund. Vid avläsningen
användes bra punktbelysning. Zonerna mättes med skjutmått och avrundades till närmsta hela
millimeter. Svärmning bortsågs från vid avläsning av zoner för P. mirabilis (13).
7
Locket togs bort vid avläsning av gradienttester och plattan avlästes mot ljus bakgrund.
Värden avlästes och avrundades uppåt till närmsta hela spädningssteg. Vid avläsning togs
hänsyn till all växt som syntes med blotta ögat och MIC-värdet lästes av där ellipsen skar
remsan. Även kolonier i ellipsen som var placerade nära remsan inkluderades vid avläsning.
Påvisning av ESBL
Skillnaden mellan cefpodoxim och cefpodoxim-klavulansyras zondiametrar bedömdes. Isolat
där de bakteriefria zonerna kring cefpodoxim med klavulansyra bedömdes ≥5 mm större än
zonen runt cefpodoxim utan β-laktamasinhibitor definierades som klassiskt ESBL, ESBLA
(10).
AmpC- Etest
För isolat som visat resistens mot både cefpodoxim och cefpodoxim-klavulansyra (dvs. inte
klassiska ESBL) utfördes AmpC- Etest. Utförandet gjordes på samma sätt som tidigare (se
ovan), men istället applicerades ett AmpC-Etest på MH-plattan. Jämte AmpC-Etestet
applicerades en Meropenem 10 µg lapp för detektion av metallobetalaktamaser som
ESBLCARBA (10).
Buljongspädning
På 9 stycken utvalda E. coli med ESBL gjordes även MIC-bestämning med
mikrobuljongspädning, som är referensmetod för MIC-bestämning. Gradienttester är
kalibrerade mot buljongspädning (guldstandard för MIC-bestämning) och MIC-bestämning
med gradienttester används därför som referens i det här projektet (med undantag för MTS
2:1 som uteslöts som referens på grund av resultat som erhölls under studiens gång).
Femtio µl bakteriesuspension (0.5 MacFarland) överfördes med automatpipett till ett rör
innehållande 500 µl MH-buljong. Rören vändes några gånger innan de placerades i en
dispenseringsrobot som pipetterade 100 µl från buljongen till varje brunn på en 96-håls
mikrotiterplatta innehållande olika mängd intorkad antibiotika (Sensititre, Thermo Fisher
Scientific/TREK Diagnostics). MIC-värdet lästes av i den första brunnen utan synlig växt
med hjälp av en kameraenhet (Vizion, Thermo Fisher Scientific/TREK Diagnostics) (15).
Kvalitetskontroll
Kvalitetskontroll för amoxicillin-klavulansyra utfördes fyra gånger i veckan på två olika
stammar: Escherichia coli ATCC 25922 som är känslig för β-laktamantibiotika och
Escherichia coli ATCC 35218 som producerar β-laktamas. Zondiametrar och MIC-värden för
kontrollstammen jämfördes med EUCASTs kvalitetskontrollgränser (21).
Statistisk analys
Skillnader i metodernas känslighet vid jämförelse av värden från MIC-test, Etest 2:1 och MTS
2:1 analyserades statistiskt med regressionsanalys på 95%-ig konfidensnivå (Bilaga 1) (22).
8
RESULTAT
Totalt testades 253 isolat, varav 89 var P. mirabilis och 164 var E. coli och bland dessa E. coli
var 71 ESBL-stammar, alternativt hade någon annan typ av cefalosporinresistens. Av de 71
isolaten med cefalosporinresistens var 65 stycken av klassisk ESBL-typ, tre isolat var av
AmpC-typ och tre isolat hade någon annan, okänd typ av cefalosporinresistens. Inget isolat
hade nedsatt känslighet för meropenem.
Kontroller med en referensstam (Escherichia coli ATCC 25922) användes för att validera
analysmetoden. Dessa kontrollanalyser gav förväntade resultat med MIC-värden inom det
tillåtna intervallet, men i överkant inom kontrollens referensintervall (2-8 mg/L) för både
Etest (amoxicillin-klavulansyra 2:1) och MTS (amoxicillin-klavulansyra 2:1) (23). Kontroller
med Escherichia coli ATCC 35218 låg inom gränserna, men i intervallets (4-16 mg/L)
underkant för Etest (amoxicillin-klavulansyra 2:1) och i intervallets överkant för MTS
(amoxicillin-klavulansyra 2:1) (24). För amoxicillin-klavulansyra med fast koncentration av
klavulansyra finns i dagsläget inga kvalitetskontrollgränser. Escherichia coli ATCC 25922
hade MIC-värden mellan 8 och 16 mg/L, medan Escherichia coli ATCC 35218 hade MICvärden som varierade mellan 4 och 8 mg/L.
Den statistiska analysen visade att det inte var någon signifikant skillnad mellan resultaten
från Etest 2:1 och MTS 2:1 vid analys av E. coli (med ESBL) och E. coli (utan ESBL).
Regressionsanalysen (konfidensintervall) visade att metoderna inte ger samma resultat vid
analys av P. mirabilis (Bilaga) (22).
Analysen visar att det finns en korrelation mellan resultat från de olika metoderna men att
vissa värden avviker (t ex värdet 64 mg/L för MTS 2:1). Den högsta korrelationen observeras
för P. mirabilis (R2=0.79), men även här finns värden som avviker kraftigt från
regressionslinjen (värdet 16 mg/L för MTS 2:1) (Bilaga 1).
MIC-distributioner
MIC-fördelningarna för P. mirabilis för de tre olika gradienttesterna visas i Figur 2. Medianen
för P. mirabilis var 1 mg/L för båda gradienttesterna med amoxicillin-klavulansyra i 2:1
förhållande. Resultatet för bestämd koncentration avvek från de andra med en median på 2
mg/L. Spridningen kring medianen varierade mellan 1-3 spädningssteg för samtliga
gradienttester men med MTS bestämd koncentration klavulansyra 2 mg/L hade fler isolat
högre MIC-värden. För E. coli visas MIC-fördelningarna dels för alla testade isolat (Figur 3)
och dels för E. coli utan ESBL (Figur 4). Höga MIC-värden (≥8 mg/L) och därmed resistenta
isolat förekom framför allt med MTS 2:1 och MTS 2 mg/L där MIC-värden upp till ≥512
mg/L var vanligt förekommande.
9
Figur 2. Resultat av resistensbestämning av P. mirabilis med amoxicillin-klavulansyra 2:1 (Etest), 2:1 (MTS)
och MTS (bestämd koncentration klavulansyra 2 mg/L) samt motsvarande referensdistribution från EUCASTs
databas (25). Vita staplar motsvarar vildtypen, dvs. isolat som saknar resistensmekanismer mot amoxicillinklavulansyra enligt EUCAST. Röda staplar visar isolat med resistensmekanismer (tex. penicillinaser eller annan
β-laktamasproduktion). Det svarta lodräta strecket visar brytpunkten för Enterobacteriaceae och amoxicillinklavulansyra (S≤8, R>8 mg/L) (18).
10
Figur 3. Resultat av resistensbestämning av E. coli (inklusive E. coli med ESBL) med amoxicillin-klavulansyra
2:1 (Etest), 2:1 (MTS) och MTS (bestämd koncentration klavulansyra 2 mg/L). Vita staplar motsvarar vildtypen,
dvs. isolat som saknar resistensmekanismer mot amoxicillin-klavulansyra enligt EUCAST. Röda staplar visar
isolat med resistensmekanismer. Det svarta lodräta strecket visar brytpunkten för Enterobacteriaceae och
amoxicillin-klavulansyra (S≤8, R>8 mg/L) (18). Referensdistributioner för MIC-värden för E. coli med ESBL
saknas.
11
Figur 4. Resultat av resistensbestämning av E. coli (utan ESBL) med amoxicillin-klavulansyra 2:1 (Etest), 2:1
(MTS) och MTS (bestämd koncentration klavulansyra 2 mg/L) samt motsvarande referensdistribution från
EUCASTs databas (25). Vita staplar motsvarar vildtypen, dvs. isolat som saknar resistensmekanismer mot
amoxicillin-klavulansyra enligt EUCAST. Röda staplar visar isolat med resistensmekanismer. Det svarta lodräta
strecket visar brytpunkten för Enterobacteriaceae och amoxicillin- klavulansyra (S≤8, R>8 mg/L) (18).
12
Jämförelse av gradienttester
MTS 2:1 gav generellt högre MIC-värden än Etest 2:1 för samtliga E. coli, framför allt för E.
coli med ESBL. För P. mirabilis gav MTS 2:1 generellt lägre MIC- värden (Tabell 1).
MTS 2 mg/L gav generellt högre MIC-värden än Etest 2:1 för samtliga isolat. E. coli
inklusive ESBL gav högst MIC- värden och skiljde ofta mer än två spädningssteg.
För MTS 2 mg/L varierade resultaten beroende på vilken organism som testats. För E. coli
inklusive ESBL gav MTS 2 mg/L generellt lägre MIC-värden än MTS 2:1. För E. coli utan
ESBL låg 68 av 71 värden för MTS 2 mg/L inom ±1 spädningssteg jämfört med MTS 2:1.
För P. mirabilis var MIC-värden erhållna med MTS 2 mg/L generellt högre än MIC-värden
med MTS 2:1
Tabell 1. Skillnader mellan gradienttester (Etest 2:1, MTS 2:1 och MTS 2 mg/L) angivet som skillnader i
spädningssteg. Färgerna anger skillnaden mellan MIC- värden i antal spädningssteg (se även Tabell 2). Sifforna
visar antal isolat för varje kategori.
MTS 2:1 jämfört
med Etest 2:1
E. coli (inkl. ESBLs)
E. coli (ej ESBLs)
P. mirabilis
MTS 2 mg/L jämfört
med Etest 2:1
E. coli (inkl. ESBLs)
E. coli (ej ESBLs)
P. mirabilis
MTS 2 mg/L jämfört
med MTS 2:1
E. coli (inkl. ESBLs)
E. coli (ej ESBLs)
P. mirabilis
>-2
-2
-1
3
3
24
=
41
39
57
+1
81
25
7
+2
31
2
1
>+2
8
2
>-2
-2
-1
7
5
7
=
74
40
39
+1
56
24
42
+2
7
2
1
>+2
20
>-2
1
-2
11
3
2
-1
54
17
7
=
64
38
22
+1
21
13
53
+2
10
>+2
3
5
13
Jämförelse av gradienttester och mikrobuljongspädning
Resultat från MIC-bestämning med mikrobuljongspädning samt MIC-värden erhållna med
gradienttester för 9 isolat visas i Tabell 2. BMD 2 mg/L gav ofta samma (tre isolat) eller
högre (fem isolat) MIC-värden jämfört med BMD 2:1 med undantag för ett isolat där MICvärdet för BMD 2 mg/L var lägre. För Etest 2:1 låg åtta av nio isolat inom ± 1 spädningssteg
jämfört med BMD 2:1, varav majoriteten gav samma MIC-värden. För MTS 2:1 låg fyra av
nio isolat inom ett spädningssteg och fem av nio skiljde två eller fler spädningssteg. Sju av
nio isolat låg inom ett spädningssteg med MTS 2 mg/L (jämfört med BMD 2 mg/L).
Tabell 2. Jämförelse mellan MIC-värden med gradienttester (Etest 2:1, MTS 2:1 och MTS 2 mg/L) och
respektive referensvärde med mikrobuljongspädning (BMD 2:1 och BMD 2 mg/L).
*Färgstegen till vänster om tabellen anger skillnad i antal spädningssteg för gradienttesterna jämfört med
motsvarande test med mikrobuljongspädning (15).
-2
-1
=
+1
+2
>+2
Isolat
E. coli 1
E. coli 2
E. coli 3
E. coli 4
E. coli 5
E. coli 6
E. coli 7
E. coli 8
E. coli 9
Etest
2:1
8
16
8
16
4
8
4
8
16
MTS
2:1
32
128
32
64
16
32
4
32
32
BMD
2:1
32
32
8
8
4
8
4
16
16
MTS
2mg/L
128
>256
16
32
8
8
8
16
>256
BMD
2 mg/L
≥128
≥128
16
8
4
8
2
32
≥128
14
Zondistributioner
Hämningszoner för P. mirabilis kring lappar med 30 µg amoxicillin-klavulansyra varierade i
diameter mellan 19 och 33 mm med en median på 28 mm. Hämningszoner för E. coli
(inklusive olika typer av ESBL) varierade mellan 8 mm och 28 mm medan hämningszoner för
E. coli (utan ESBL) varierade mellan 14 och 28 mm (Figur 5).
Antal isolat
P. mirabilis vs. amoxicillin- klavulansyra 30 µg
25
20
15
10
5
0
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Hämningszon (mm)
Antal isolat
E. coli (med och utan ESBL) vs.
amoxicillin- klavulansyra 30 µg
25
20
15
10
5
0
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Hämningszon (mm)
Antal isolat
E. coli (utan ESBL) vs.
amoxicillin- klavulansyra 30 µg
25
20
15
10
5
0
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Hämningszon (mm)
Figur 5. Hämningszoner (mm) för amoxicillin-klavulansyra 30 µg för P. mirabilis, E. coli (med och utan ESBL)
och E. coli (utan ESBL). Det svarta lodräta strecket visar brytpunkten för Enterobacteriaceae och amoxicillinklavulansyra (S≥17, R<17 mm) (18).
15
Korrelation mellan hämningszoner och MIC-värden
Resultatet för P. mirabilis visade en hög korrelation mellan MIC-värden och hämningszoners
diameter vid lapptest (30 µg amoxicillin-klavulansyra). För MTS 2:1 och MTS bestämd
koncentration 2 mg/L tolkades 2 respektive 1 isolat som falskt känsliga enligt gällande
zonbrytpunkter för lappdiffusion, dvs. hämningszonen var S (≥17 mm) och MIC-värdet var R
(> 8 mg/L) (Figur 6).
Hämningszoner för amoxicillin-klavulansyra 30 µg för E. coli (inklusive olika typer av
ESBL) korrelerade i hög grad med MIC-värden med Etest 2:1. Tretton isolat blev falskt
resistenta och ett isolat blev falskt känsligt med lappdiffusion enligt gällande brytpunkter
(S≥17 mm, R<17 mg/L). Korrelationen mellan hämningszoner för amoxicillin- klavulansyra
30 µg och MTS 2:1 var lägre och 35 isolat blev falskt känsliga med lappdiffusion. Vid analys
av hämningszoner för amoxicillin- klavulansyra 30 µg och MIC-värden med MTS 2 mg/L föll
fem isolat ut som falskt resistenta (R enligt lappdiffusion och S enligt MIC-bestämning) och
fjorton isolat blev falskt känsliga med lappdiffusion (Figur 7).
För E. coli (utan ESBL) korrelerade hämningszoner för amoxicillin-klavulansyra 30µg
mycket bra med MIC-värden med Etest 2:1. Ett isolat bedömdes som falskt resistent och ett
isolat bedömdes som falskt känsligt med lappdiffusion. Hämningszoner för amoxicillinklavulansyra 30 µg och MTS 2:1 korrelerade i lägre utsträckning, där sju isolat kom att tolkas
som falskt känsliga med lappdiffusion. Vid jämförelse av hämningszoner för amoxicillinklavulansyra 30 µg och MIC-värden från MTS 2 mg/l bedömdes ett isolat som falskt resistent
och tre isolat föll ut som falskt känsliga (Figur 8).
16
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs. MIC (Etest, 2:1)
P. mirabilis
Antal isolat
25
20
8
4
2
1
0.5
15
10
5
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
0
Hämningszon (mm)
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs. MIC (MTS, 2:1)
P. mirabilis
34
32
30
28
26
24
22
20
1
18
2
0
16
4
5
14
8
10
12
15
10
16
8
20
6
Antal isolat
25
0.5
Hämningszon (mm)
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs. MIC (MTS, 2 mg/L)
P. mirabilis
Antal isolat
25
16
20
8
15
4
10
2
5
1
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
0
0.5
Hämningszon (mm)
Figur 6. Zondistributioner för P. mirabilis och amoxicillin-klavulansyra 30 µg där MIC-värden för de olika
gradienttesterna (Etest 2:1, MTS 2:1 och MTS 2 mg/L) visas som olika färger på staplarna. Färgstegen till höger
visar MIC-värdet i mg/L. Det svarta lodräta strecket visar brytpunkten för Enterobacteriaceae och amoxicillinklavulansyra (S≥17, R<17 mm) (18).
17
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs.
MIC (Etest, 2:1)
E. coli (med och utan ESBL)
25
32
Antal isolat
20
16
15
8
10
4
5
2
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
0
1
Hämningszon (mm)
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
25
20
15
10
5
0
6
Antal isolat
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs.
MIC (MTS, 2:1)
E. coli (med och utan ESBL)
Hämningszon (mm)
Hämningszon (mm)
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
25
20
15
10
5
0
6
Antal isolat
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs.
MIC (MTS, 2 mg/L)
E. coli (med och utan ESBL)
>256
128
64
32
16
8
4
2
1
0.5
>256
256
128
64
32
16
8
4
2
1
0.5
Figur 7. Zondistributioner för E. coli (med och utan ESBL) och amoxicillin-klavulansyra 30 µg där MIC-värden
för de olika gradienttesterna (Etest 2:1, MTS 2:1 och MTS 2 mg/L) visas som olika färger på staplarna.
Färgstegen till höger visar MIC-värdet i mg/L. Det svarta lodräta strecket visar brytpunkten för
Enterobacteriaceae och amoxicillin-klavulansyra (S≥17, R<17 mm) (18).
18
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
14
12
10
8
6
4
2
0
6
Antal isolat
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs. MIC (MTS, 2:1)
E. coli (utan ESBL)
64
32
16
8
4
2
1
0.5
Hämningszoner (mm)
14
12
10
8
6
4
2
0
32
16
8
4
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
2
6
Antal isolat
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs. MIC (MTS, 2
mg/L) E. coli (utan ESBL)
1
0.5
Hämningszon (mm)
14
12
10
8
6
4
2
0
16
8
4
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
2
6
Antal isolat
Amoxicillin- klavulansyra 30 µg vs. MIC (Etest, 2:1)
E. coli (utan ESBL)
1
Hämningszon (mm)
Figur 8. Zondistributioner för E. coli (utan ESBL) och amoxicillin-klavulansyra 30 µg där MIC-värden för de
olika gradienttesterna (Etest 2:1, MTS 2:1 och MTS 2 mg/L) visas som olika färger på staplarna. Färgstegen till
höger visar MIC-värdet i mg/L. Det svarta lodräta strecket visar brytpunkten för Enterobacteriaceae och
amoxicillin-klavulansyra (S≥17, R<17 mm) (18).
19
DISKUSSION
Målsättningen med projektet var att utföra MIC-bestämning med gradienttester för
amoxicillin-klavulansyra enligt EUCAST rekommendation (bestämd koncentration av
klavulansyra), att utvärdera lappdiffusion samt att jämföra resultaten från dessa analyser med
de från MIC- bestämning med amoxicillin-klavulansyra i bestämt förhållande 2:1.
Gradienttesterna som utvärderades innehöll antingen en bestämd koncentration klavulansyra
(MTS 2 mg/L) eller ett bestämt förhållande mellan amoxicillin-klavulansyra (Etest 2:1 och
MTS 2:1).
Jämförelse av MIC-fördelningar och EUCASTs referensdistributioner
För P. mirabilis stämde MIC-värden erhållna med de tre gradienttesterna väl överens med
referensdistributionen från EUCASTs databas. MTS 2 mg/L stämde bäst överens med
referensdistributionen (Figur 2).
Resultatet för E. coli (utan ESBL) med samtliga MIC-tester stämde bra med MICdistributionen från EUCAST. MTS 2:1 visade något högre MIC-värden än övriga tester för E.
coli utan ESBL (Figur 4).
E. coli (med och utan ESBL) visade högre MIC-värden än referensdistributionen för E. coli.
Avvikelsen orsakas av E. coli som producerar ESBL, vilket blir tydligt när diagrammen för E.
coli utan ESBL (Figur 4) jämförs med diagrammen för E. coli med och utan ESBL (Figur 3).
Kontrollerna med E. coli 25922 och E. coli 35218 låg inom respektive referensintervall. E.
coli 25922 gav något högre MIC-värden än E. coli 35218. Resultatet är oväntat då E. coli
25922 anses sakna kända resistensmekanismer och vara känslig mot β-laktamantibiotika.
Jämförelse av de olika gradienttesterna
MTS 2:1 gav överlag högre MIC-värden än Etest 2:1 (Tabell 1). Båda produkterna borde
teoretiskt ge samma resultat då de innehåller samma förhållande mellan amoxicillin och
klavulansyra. Skillnaden i resultatet kan bero på leverantörfel för MTS 2:1, vilket styrks av att
resultaten för Etest 2:1 korrelerade bättre med resultat från mikrobuljongspädning (Tabell 2).
Då mikrobuljongspädning är den metod som används som referens för MIC-bestämning (16)
är alltså Etest det test som gav mest korrekta resultat i den här studien. Det bör dock
observeras att mikrobuljongspädning utfördes för endast 9 isolat, vilket ger en relativt liten
referensjämförelse.
Skillnaden mellan MTS 2:1 och Etest kan även ha andra förklaringar, exempelvis att olika
mängd antibiotika frisätts/överförs till odlingsmediet.
P. mirabilis tenderade att ha lägre MIC- värden med MTS 2:1 än med Etest 2:1. MIC-värden
för P. mirabilis var generellt sett låga (0,5-2 mg/L) (Tabell 1). För P. mirabilis syntes inga
större skillnader mellan gradienttesterna och därför utfördes inte resistensbestämning med
mikrobuljongspädning.
20
Den statistiska regressionsanalysen visade att det fanns en korrelation mellan de olika MICvärdena för respektive test och bakterieart, men den statistiska analysen måste tolkas med
försiktighet eftersom vissa extrema värden kan påverka regressionen. Antalet datapunkter vid
höga koncentrationer antibiotika är få, vilket även påverkar regressionsanalysen och gör att
slutsatser om överensstämmelser mellan analyserade metoder måste dras med försiktighet.
Bäst statistiska överensstämmelse mellan undersökta metoder observerades för tester av P.
mirabilis.
Resultatet med MTS 2 mg/L kan inte jämföras med resultat med MTS 2:1 eller Etest 2:1
(Tabell 1). MTS 2:1 och Etest 2:1 bygger på ett bestämt förhållande mellan amoxicillin och
klavulansyra medan MTS 2 mg/L innehåller en bestämd koncentration klavulansyra.
Metoderna förväntas därför inte ge samma resultat och en jämförelse mellan testerna syftar
istället till att se hur de förhåller sig till varandra eller om något samband mellan resultaten
syns.
En studie har visat att andelen resistenta isolat (E. coli) ökade vid byte från bestämt
förhållande amoxicillin-klavulansyra 2:1 till bestämd koncentration klavulansyra (26).
Högre MIC-värden med MTS 2 mg/L beror troligtvis på att klavulansyrans koncentration är
betydligt lägre vid höga MIC-värden än för amoxicillin-klavulansyra med bestämt förhållande
2:1. För gradienttester med fast förhållande ökar klavulansyran i takt med amoxicillinets
koncentration. Vid MTS bestämd koncentration är klavulansyran som diffunderar ut konstant
2 mg/L. Det är då logiskt att MIC-värdena blir högre eftersom klavulansyrans effekt inte är
tillräcklig. Eventuellt skulle en högre bestämd koncentration ge ett annorlunda resultat.
Vid höga MIC-värden fick ellipsen runt MTS 2 mg/L ofta en smalare form jämfört med MTS
bestämt förhållande amoxicillin- klavulansyra 2:1. Det har visats i tidigare studier med
Acinetobacter spp. att känslighet för klavulansyra inte alltid är relaterat till βlaktamasproduktion. Orsaken till ökad känslighet för klavulansyra är okänd och det kan därför
misstänkas att klavulansyra kan ha egen effekt (27). Fenomenet kan delvis förklara varför
MTS 2:1 ibland gav en större hämningsellips jämfört med MTS 2 mg/L, trots samma MICvärde. En annan förklaring till detta kan vara klavulansyrans egna β-laktameffekt (5).
De höga MIC-värdena för MTS 2:1 och MTS 2 mg/L jämfört med Etest 2:1 kan bero på ofta
förekommande bakteriekolonier i ellips runt MTS 2:1 och MTS 2 mg/L. Bakteriekolonier
intill gradienttestremsan skall tas hänsyn till vid avläsningen, vilket kan medföra betydligt
högre MIC-värden.
21
Zon/MIC-korrelation
För samtliga E. coli korrelerade hämningszonerna bäst med Etestets MIC-värden.
Korrelationen mellan MTS 2:1 resultat och hämningszoner var betydligt sämre både för
samtliga E. coli (med och utan ESBL) och E. coli utan ESBL, jämfört med Etest 2:1 och MTS
2 mg/L. Den höga andelen falskt känsliga isolat (för E. coli) beror troligtvis på för höga MICvärden med MTS 2:1. Med gradienttest blir då tolkningen för bakterien R, men med
lappdiffusion tolkas bakterien som S.
MTS resultat med fast koncentration klavulansyra 2 mg/L korrelerade bättre med
hämningszonerna än vad MTS 2:1 gjorde, trots att MIC-värdena generellt sett var högre. Då
MIC-värdena var högre med MTS 2 mg/L kunde det förväntas att dessa inte skulle korrelera
väl med respektive hämningszoner. Resultatet kan förklaras med att E. coli med ESBL gav
mycket höga MIC-värden vid analys med MTS 2mg/L medan MTS 2:1 gav MIC-värden
mellan 8 - 64 mg/L som kom att tolkas som känsliga eller resistenta, eftersom
hämningszonerna kom att hamna runt brytpunkten med lappdiffusion (Figur 7).
Cylinderformade ellipser istället för droppformade ellipser har setts med Etest med
piperacillin-tazobaktam. Dessa atypiska ellipser är svårtolkade och resulterar i sämre
korrelation mellan MIC- bestämning och lappdiffusion (28). I föreliggande studie (E. coli
med och utan ESBL) var ofta de smala cylinderformade ellipserna svåravlästa bland annat på
grund av förekommande kolonier i ellipser, vilket kan vara orsaken till sämre korrelation
mellan hämningszoner och MIC-värden (Figur 7).
Korrelationen mellan hämningszoner och MIC- värden med samtliga gradienttester var bäst
för P. mirabilis. Det är troligt att korrelationen skulle sett annorlunda ut om några av isolaten
varit ESBL- producerande P. mirabilis, då ESBL- producerande E. coli oftast medfört
förhöjda MIC- värden.
Resultaten i den här studien indikerar att P. mirabilis bör ha en artspecifik zonbrytpunkt för
att göra det möjligt att upptäcka isolat med förhöjda MIC-värden. En del av isolaten hade
något högre MIC-värden än övriga P. mirabilis och mindre zondiameter men kom ändå att
tolkas S.
Slutsatser
Korrelationen mellan hämningszoner för amoxicillin-klavulansyra 30 µg och MIC-värden
erhållna med amoxicillin-klavulansyra bestämd koncentration 2 mg/L var sämre än med Etest
bestämt förhållande amoxcillin- klavulansyra 2:1, som används för resistensbestämningar
idag. Amoxicillin-klavulansyra fast koncentration 2 mg/L medför högre MIC- värden än
amoxicillin-klavulansyra fast förhållande 2:1.
22
Resultaten indikerar att zonbrytpunkten behöver justeras något för att korrelera med
amoxicillin-klavulansyra med bestämd koncentration 2 mg/L enligt EUCAST
rekommendationer, framför allt för ESBL-producerande E. coli. Fler isolat (E. coli och P.
mirabilis) med MIC-värden kring brytpunkten bör testas med referensmetodik för att kunna
avgöra exakt var zonbrytpunkten bör ligga.
23
REFERENSER
1. Aldeyab MA, Harbarth S, Vernaz N, Kearney MP, Scott MG, Darwish Elhajji FW, et al. The impact of
antibiotic use on the incidence and resistance pattern of extended-spectrum beta-lactamaseproducing bacteria in primary and secondary healthcare settings. Br J Clin Pharmacol.
2012;74(1):171-9. Epub 2011/12/14.
2. Afridi FI, Farooqi BJ. Activity of beta-lactam beta-lactamase inhibitor combinations against
extended spectrum Beta-lactamase producing Enterobacteriaceae in urinary isolates. J Coll
Physicians Surg Pak. 2012;22(6):358-62. Epub 2012/05/29.
3. Van der Donk CF, van de Bovenkamp JH, De Brauwer EI, De Mol P, Feldhoff KH, Kalka-Moll WM, et
al. Antimicrobial resistance and spread of multi drug resistant Escherichia coli isolates collected from
nine urology services in the Euregion Meuse-Rhine. PLoS One. 2012;7(10):e47707. Epub 2012/10/20.
4. Hoban DJ, Lascols C, Nicolle LE, Badal R, Bouchillon S, Hackel M, et al. Antimicrobial susceptibility
of Enterobacteriaceae, including molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamaseproducing species, in urinary tract isolates from hospitalized patients in North America and Europe:
results from the SMART study 2009-2010. Diagn Microbiol Infect Dis. 2012;74(1):62-7. Epub
2012/07/06.
5. R FG, D G, R NS, J WR. Antibiotic and ChemotherapyAnti-infective agents and their use in
therapy eighth ed. London, United Kingdom: Churchill Livingstone, Elsevier Science limited; 2003.
6. Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol
Rev. 2005;18(4):657-86. Epub 2005/10/15
7. Cephalosporins. http://www.uic.edu. 20130510 kl.21.00.
8. Giske. G C, Melander E. ESBL- resistens hos tarmbakterier.Vad är ESBL? www.smi.se. 20130526
Kl.16.00.
9. NordicAST v.3, Algoritm för detektion av ESBLs. http://www.nordicast.org. 20130510 Kl.21.00
10. ESBL- undersökning. http://www.mikrobiologi.org/documents/view/399.20130510 Kl.22.00
11. Polsfuss S, Bloemberg GV, Giger J, Meyer V, Hombach M. Comparison of European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) and CLSI screening parameters for the detection of
extended-spectrum beta-lactamase production in clinical Enterobacteriaceae isolates. J Antimicrob
Chemother. 2012;67(1):159-66. Epub 2011/10/06.
12. Rodriguez-Bano J, Navarro MD, Retamar P, Picon E, Pascual A, Extended-Spectrum BetaLactamases-Red Espanola de Investigacion en Patologia Infecciosa/Grupo de Estudio de Infeccion
Hospitalaria G. beta-Lactam/beta-lactam inhibitor combinations for the treatment of bacteremia due
to extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli: a post hoc analysis of prospective
cohorts. Clin Infect Dis. 2012;54(2):167-74. Epub 2011/11/08.
13. Resistensbestämning. http://www.mikrobiologi.org/documents/view/234.20130510 Kl.22.00.
24
14. MIC- bestämning med gradienttest (Etest). http://www.mikrobiologi.org/documents/view/233.
20130510 Kl.22.00.
15. International Standards Organisation. Reference method for testing the in vitro activity of
antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO -,
1996. 20130510 Kl. 23.00.
16. LeCorn DW, Vertucci FJ, Rojas MF, Progulske-Fox A, Belanger M. In vitro activity of amoxicillin,
clindamycin, doxycycline, metronidazole, and moxifloxacin against oral Actinomyces. J Endod.
2007;33(5):557-60. Epub 2007/04/18.
17. Giske.G.C, G K. ESBL-resistens hos tarmbakterier.Diagnostik av ESBL.www.smi.se. 20130526
Kl.16.00.
18. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for
interpretation of MICs and zone diameters. Version 3.1, 2013. http://www.eucast.org. 20130520 Kl.
14.00.
19. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Frequently Asked
Questions: The new EUCAST standard indicates a fixed concentration of betalactamase inhibitor for
piperacillin-tazobactam a-caa-s. www.eucast.org. 20130520 Kl. 14.00.
20. ESBL- undersökning. http://www.mikrobiologi.org/documents/view/232.20130510 Kl. 23.00
21. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST disk diffusion method.
Version 2.1, 2012. http://www.eucast.org. 20130508 Kl.14.00.
22. Ejlertsson G. Statistik för hälsovetenskaperna. , 100 s. Lund: Studentlitteratur AB; 2003.
23. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine QC Tables v 3.1.
www.eucast.org. 20130526 Kl.20.00.
24.Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing ;Twenty-Third Information Supplement. Wayne PA
: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2013.
25. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST MIC- ditributions.
www.eucast.org. 20130519 Kl.13.00.
26. van Hall Leverstein MA, Waar K, Muilwijk JWT, group CSobotI-As. Consequences of switching
from a fixed 2:1 ratio of amoxicillin- clavulanate (CLSI) to a fixed clavulanate concentration (EUCAST)
in susceptibility testing of Escherichia coli. ESCMID European Society of Clinical Microbiology and
Infectious diseases [Internet]. 2013.
27. Beceiro A, Fernandez-Cuenca F, Ribera A, Martinez-Martinez L, Pascual A, Vila J, et al. False
extended-spectrum beta-lactamase detection in Acinetobacter spp. due to intrinsic susceptibility to
clavulanic acid. J Antimicrob Chemother. 2008;61(2):301-8. Epub 2007/12/11.
28. L K, Hanberger H, Hällgren A, Johansson A, Nilsson M, Petropoulos A, et al. Impact of Etest ellipse
shape in susceptibility testing of Escherichia coli with β- lactam- β- lactamase inhibitor combinations.
ESCMID, European Society of Clinical Microbiology and Infectious diseases [Internet]. 2013.
25
Bilaga 1
E. coli utan ESBL
UTDATASAMMANFATTNING
16
8
8
8
8
8
4
4
4
4
2
2
4
8
16
16
4
4
8
8
4
4
8
4
4
16
4
2
8
4
4
4
4
8
4
4
4
4
1
2
4
32
8
16
8
8
16
4
4
4
4
2
2
8
16
32
32
4
8
8
8
4
4
64
8
16
32
4
2
8
8
8
4
4
32
4
8
2
4
1
16
8
4
4
4
4
4
4
4
2
4
4
4
4
4
2
2
4
4
2
1
2
2
1
2
2
4
4
2
2
2
1
4
8
4
8
4
4
4
4
4
4
8
8
4
4
4
8
2
2
1
4
2
0,5
4
2
4
4
2
2
2
2
Regressionsstatistik
Multipel-R
0,725043
R-kvadrat
0,525688
Justerad Rkvadrat
0,518814
Standardfel
7,108687
Observationer
71
ANOVA
fg
Regression
Residual
Totalt
Konstant
X-variabel 1
1
69
70
KvS
3864,482
3486,807
7351,289
MKv
3864,481908
50,53343224
F
76,47376669
p-värde för F
8,69844E-13
Koefficienter
-2,05335
2,180504
Standardfel
1,444856
0,249345
t-kvot
-1,42114859
8,744928055
p-värde
0,159777392
8,69844E-13
Nedre 95%
-4,93576328
1,683074029
Övre 95%
0,829053641
2,67793311
Regressionslinje, E. coli utan ESBL
70
60
50
MTS 2:1
Etest MTS Etest MTS
2:1 2:1 2:1
2:1
y = 2,180x - 2,053
R² = 0,525
40
30
20
10
0
0
5
10
Etest 2:1
15
20
Bilaga 1
MTS
2:1
256
64
64
64
32
32
32
32
32
32
32
32
32
16
32
16
32
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
8
256
128
128
32
128
32
32
32
32
64
64
32
32
64
32
32
32
64
32
32
32
32
64
Etest
2:1
16
16
8
16
8
16
8
16
16
16
8
16
16
16
8
8
8
8
8
8
16
16
16
8
8
4
16
4
16
16
16
16
8
8
4
4
16
32
16
4
8
8
MTS
2:1
64
32
32
32
32
32
16
64
32
128
16
64
32
32
32
16
16
16
64
32
32
32
32
16
32
16
64
8
32
32
64
32
32
16
4
16
32
64
32
4
16
16
E. coli med ESBL
UTDATASAMMANFATTNING
Regressionsstatistik
Multipel-R
0,66373
R-kvadrat
0,440537
Justerad Rkvadrat
0,434389
Standardfel
30,72954
Observationer
93
ANOVA
fg
Regression
Residual
Totalt
Konstant
X-variabel 1
1
91
92
KvS
67665,17
85931,73
153596,9
MKv
67665,17079
944,3047521
F
71,65607357
p-värde för F
4,14072E-13
Koefficienter
-13,6826
4,283235
Standardfel
7,206441
0,505994
t-kvot
-1,89866523
8,464991056
p-värde
0,060777179
4,14072E-13
Nedre 95%
-27,9973298
3,278140315
Övre 95%
0,632090509
5,288330438
Regressionslinje, E. coli med ESBL
300
250
MTS 2:1
Etest
2:1
32
32
16
16
16
16
8
16
16
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
4
8
8
8
4
32
8
32
16
16
16
16
16
16
16
16
16
8
16
16
16
16
16
8
16
16
16
16
y = 4,283x - 13,68
R² = 0,440
200
150
100
50
0
0
10
20
Etest 2:1
30
40
Bilaga 1
Etest
2:1
MTS
2:1
Etest
2:1
MTS
2:1
P. mirabilis
UTDATASAMMANFATTNING
8
16
1
1
4
16
1
0,5
2
4
1
1
4
8
2
1
2
2
2
1
1
1
2
1
Regressionsstatistik
Multipel-R
0,887403556
R-kvadrat
0,787485072
Justerad R-kvadrat
0,785042371
Standardfel
1,202798227
Observationer
89
1
1
2
1
ANOVA
1
0,5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0,5
1
2
1
0,5
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
0,5
1
0,5
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
0,5
0,5
4
8
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
1
2
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
0,5
1
1
1
0,5
1
1
1
0,5
1
1
1
1
1
1
0,5
0,5
1
0,5
1
1
1
1
1
0,5
1
1
1
1
1
1
0,5
0,5
1
1
1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
4
1
1
4
8
1
0,5
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
fg
KvS
466,3990939
125,8649511
592,2640449
MKv
466,3991
1,446724
F
322,383
p-värde för F
5,28378E-31
Koefficienter
Standardfel
t-kvot
Nedre 95%
Övre 95%
Konstant
-1,56253527
0,218758287
-7,14275
-1,99734104
-1,1277295
X-variabel 1
2,281651721
0,127075926
17,95503
p-värde
2,64E10
5,28E31
2,029074563
2,534228879
Regression
Residual
Totalt
1
87
88
Regressionslinje, P. mirabilis
20
MTS 2:1
15
10
y = 2,281x - 1,562
R² = 0,787
5
0
-5
0
2
4
6
Etest 2:1
8
10
Kalmar Växjö
391 82 Kalmar
Tel 0480-446200
Lnu.se