Tekniker, metoder och PEG
i
Nefelometrisk/turbidimetriska
analyser
Anders Larsson
KKF, Uppsala
2011
Turbidimetri
Prov
2011
Nefelometri
Prov
2011
Nefelometri/turbidimetri
Prov
Prov
Prov
Prov
2011
Nefelometri/turbidimetri
Små mängder antigen
Prov
Prov
2011
Nefelometri/turbidimetri
Antigensöverskott
Prov
Prov
2011
Heidelberger-Kendall
Precipitering av komplex i lösning
(1-3 dygn, 37oC och 4oC)
Grumlighet
Mängd antigen
2011
Antigenet och antikroppens ursprung
påverkar kurvans form
Grumlighet
Mängd antigen
2011
Komplementaktivering påverkar
precipitatstorleken
Grumlighet
Mängd antigen
2011
Interferens av anti-IgG i provet
Orsaker:
RF
HAMA
Andra anti-IgG
Troligen mindre problem i nefelometri
än i t.ex. Sandwich immunoassays
2011
Tillsats av polymerer för att snabba på och
förstärka reaktionen (Hyaluronsyra,
dextran, Polyetylenglykol (PEG), etanol,
ammoniumsulfat)
2011
PEG
Fäller ”selektivt” immunkomplex i
intervallet <4% PEG 6000 om vi använder
fria antikroppar
Ju lägre PEG konc ju större komplex krävs
och ju tidigare når vi antigen excess
Inert
Billig
Atoxiskt
Ej brandfarligt
Ej temp beroende
Går göra koncentrerade PEG lösningar
Rening av antikroppar
Precipitation
Etanol (gammaglobulin)
40% amsulfat
12%PEG 6000
Jonbyteskromatografi
Affinitetskromatografi
T.ex. Protein A, G, L, T-gel
Varierande linjaritet inom
mätområdet
Kurvanpassningsproblem!
Grumlighet
Mätområde
Mängd antigen
2011
Varierande linjaritet inom
mätområdet
Kurvanpassningsproblem!
Hur kan vi kontrollera att vi inte råkar ut
för antigen excess?
Flesta proteiner har så liten
koncentrationsvariation att det inte är
något problem.
Exempel på problemanalyser
U-albumin
IgG, IgA, IgM
lätta kedjor
Antigen excess kontroll 1
Tillsats av antigen
Grumlighet
Mängd antigen
Antigen excess kontroll 2
Initiala absorbansförändringen
700 nm
1,200
Absorbans
1,000
Abs
0,800
700 nm
0,600
0,400
0,200
0,000
1
6
11
16
21
26
31
Point
CYSTC 0,81 mg/L
CYSTC 3,02 mg/L
CYSTC 6,98 mg/L
2011
Sammanfattning PEG och vanliga
nefelometriska metoder
Vill vi ha snabba svar krävs någon form av
polymer när vi använder fria antikroppar
Oftast används PEG 6000 (numera 8000)
PEG skall helst inte fälla fritt IgG vilket
gör att PEG konc oftast är 3-4% i
reaktionsblandningen
Vad gäller för
partikelförstärkta metoder?
Teoretiskt bör PEG konc vara
lägre än de 3-4 % som används
för fria antikroppar
Ingen selektivitet med 4%PEG
Prov
Prov
Partikelbaserade tester
Partiklarna bör vara små
Mindre diffusionsavstånd
Snabbare reaktion
2011
Partikelbaserade tester
har ett bra antigen excess skydd
Tveksamt om PEG tillför något för antigen
excess
1
0,9
delta absorbance
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
cystatin C concentration (mg/L)
60
70
80
Partikelbaserade tester
PEG påverkar kurvformen
Kalibreringskurvor, Architect
1,2000
lot 1006401
220/45/3 kal 8,30
spädd med fys
buffert sp 25%
med PEG-fri buffert
1,0000
0,8000
lot 1006401
220/45/3 kal 8,30
spädd med fys
PEG-fri buffert
0,6000
0,4000
0,2000
0,0000
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Tusen tack för uppmärksamheten
Prov
Prov
Anders Larsson
KKF, Uppsala
2011
