Akademin för hållbar samhällsoch teknikutveckling
Adhesion av mikroorganismer till lignocellulosa
Anders Karlsson
C-uppsats i Kemiteknik – Läkemedelsdesign, 20p
Handledare: Sven Hamp & Anne Stockenberg
Uppdragsgivare: STFI-Packforsk AB
Examinator: Magnus Neumüller
Västerås: 2008-10-27
1
Abstract
The aim of the project was to develop a method to investigate differences in adhesion of
microorganisms to materials that contains lignocellulose. The method was tested on a grampositive (Micrococcus lutea) and one gram-negative (E-coliJM109) bacteria.
The study was begun by cultivation of the two microorganisms. The cultivation was
done to calculate the generation times of the bacteria and to obtain growth curves. Cells from
these cultivations were also frozen (-70ºC) and later used for inoculation.
At STFI-Packforsk AB the total charge on the mass was measured and later a
conductivity titration on the mass was executed as well, all to find out more about the
different properties of the mass. Properties that in a later part of this study could possibly be
linked to the adhesion of cells to the pulp. The adhesion experiments that were executed gave
poor results. The adhesion experiment with M. lutea was the only experiment that gave a
reproducible result. In this experiment M. lutea was contacted with bleached leaf. A reduction
of cells was observed in all of the dilutions where M. lutea had been in contact with the mass.
The number of colony forming units of the culture was 1,2×107 before the adhesion and 2×106
subsequently.
2
Sammanfattning
Projektets syfte var att utveckla en metod för att undersöka skillnader i adhesion av
mikroorganismer till material som består eller framställs av lignocellulosa. Metoden
tillämpades på en gram-positiv (Mikrococcus lutea) samt en gram-negativ (E-coliJM109)
bakterie.
Studien inleddes med uppodling av de båda bakterierna där tillväxtkurvor utformades,
generationstider beräknades och cellbanker skapades. På STFI uppmättes massornas totala
laddningsförmåga och därpå gjordes ytterligare en konduktivitetstitrering på massorna för att
utröna mer om deras egenskaper, egenskaper som i en senare och fortsatt del av denna studie
skall kunna länkas till mikroorganismernas interaktion med materialet. Adhesionsförsöken
som sedan utfördes gav mycket ojämna resultat. Några fullständiga försök med konduktivitet
kunde aldrig genomföras p.g.a. tidsbrist. Resultaten från adhesionsförsken med M. lutea
visade bäst reproducerbarhet. I försöket där M. lutea adherades till blekt löv påvisades en
reduktion av antalet kolonier i alla spädningar där mikrococcin kontaktats med blekt löv. CFU
för den kultur som uppodlats vid det omtalade tillfället var 1,2*107 före adhesionen och 2*106
efter. Reduktionen var alltså en tiopotens.
3
INTRODUKTION
TEORETISK BAKGRUND
MATERIAL OCH METODER
MATERIAL
Mikroorganism
Utrustning för odlingsförsöken
Utrustning för mätning av pappersmassa
Utrustning kontaktförsök
Kemikalier
Odlingsmedia och lösningar
METODER
ODLING PÅ PLATTA
ODLING I FERMENTOR
JONBYTE AV MASSA TILL H+-FORM
MÄTNING AV DEN TOTALA LADDNINGEN HOS MASSORNA
ADHESIONSFÖRSÖK
KONDUKTIVITETSTITRERING PÅ MASSORNA
SEM (SCANNING ELECTRON MICROSCOPE)
FERMENTATIONSFÖRSÖK
M. LUTEA FÖRSÖK 1
E. COLI FÖRSÖK 1
M. LUTEA FÖRSÖK 2
E. COLI FÖRSÖK 2
E. COLI FÖRSÖK 3
RESULTAT
ADHESIONSFÖRSÖK MED M. LUTEA
ADHESIONSFÖRSÖK E. COLIJM109
TOTALLADDNING AV MASSOR
KONDUKTIVITETSTITRERING
ELEKTRONMIKROSKOPBILDER
6
7
8
8
8
8
9
9
10
10
11
11
12
12
12
12
13
14
14
14
16
18
20
22
24
24
25
25
26
31
DISKUSSION
32
REFERENSER
34
BILAGA 1
35
BERÄKNINGAR
BILAGA 2
TITRERINGSKURVA BLEKT LÖV-MASSA 1
BILAGA 3
TITRERINGSKURVA BLEKT LÖV-MASSA 2
BILAGA 4
TITRERINGSKURVA BLEKT BARR-MASSA 1
BILAGA 5
35
37
37
38
38
39
39
40
4
TITRERINGSKURVA BLEKT BARR-MASSA 2
BILAGA 6
TITRERINGSKURVA OBLEKT LÖV-MASSA 1
BILAGA 7
TITRERINGSKURVA OBLEKT LÖV-MASSA 2
BILAGA 8
TITRERINGSKURVA OBLEKT BARR-MASSA 1
BILAGA 9
TITRERINGSKURVA OBLEKT BARR-MASSA 2
40
41
41
42
42
43
43
44
44
5
Introduktion
Syftet med projektet var att framställa ett material som kan användas i hygieniska
sammanhang. Materialet skall besitta egenskaper som gör att det attraherar mikroorganismer.
I studien som utfördes utarbetades en metod för att undersöka skillnader i adhesion av två
olika mikroorganismer, en grampositiv och en gramnegativ, till lövvedsmassa och
barrvedsmassa i blekt och oblekt tillstånd.
Anledningen till studien är att det finns ett intresse att utforma material med egenskaper
som gör att bakteriehalten i omgivningen kan reduceras. I sjukhusmiljöer skulle ett sådant här
material kunna användas i örngott eller skurmoppar. I en framtid med nya hotbilder från
multiresistenta bakterier p.g.a. alltför frekvent bruk av antibiotika efterfrågas andra metoder
och infallsvinklar på problemet.
Studien utfödes genom att bakteriesuspension med känd halt bringas i kontakt med det
adsorberande materialet. Cellkoncentrationen före och efter kontakt i suspensionen uppmättes
och reduktionen visar effektiviteten.
Uppgiften inleddes med en primär litteraturstudie av grundläggande mekanismer för
adhesion. Sedan utvecklades den metod som skulle standardiseras för odling och skörd av
bakterierna. Ett standardiserat förfarande utarbetades även för kontakt mellan bakterierna och
testmaterialet. Studien är komplex då bakteriernas egenskaper förändras mellan olika
tillväxtfaser. Avsikten var att optimera och standardisera metoderna under projektets gång.
6
Teoretisk bakgrund
Processen där bakterier fäster till ytor dikteras av en rad olika komponenter. En tumregel
brukar vara att bakterier som fäster till abiotiska ytor gör det genom icke specifik adhesion
exempelvis genom hydrofob interaktion. Bakterier som fäster till levande ytor gör det däremot
genom mer specifik interaktion via lektiner, adhesiner eller ligander. Ett typiskt exempel för
en sterospecifik interaktion är den mellan en lektin och kolhydrat. Att den är specifik innebär
att endast den yta som bär den motsvarande kolhydratstrukturen som passar till lektinen
vilken finns på bakterien, kommer att fästa1. Det är dock lite utav en förenkling att påstå att
hydrofob interaktion är helt och hållet ospecifik. Olika faktorer så som essentiella
näringskomponenter och motstånd mot skadliga fysiska och kemiska påfrestningar är också
viktiga för en lyckad kolonisation. Adhesionsprocessen brukar delas in i faktorer som
innefattar presentation, orientering och åtkomlighet. Först måste organismen närma sig ytan,
framdriven antingen slumpmässigt av en vätska som strömmar över ytan eller så kan det ske
på ett mer styrt vis genom så kallad kemotaxis där en cell förflyttar sig mot eller från en
ökande koncentration av ett kemiskt ämne. När organismen når en så kallad kritisk närhet till
ytan (≤1nm) så avgörs adhesionsförfarandet genom summan av de krafter som antingen
verkar attraktivt eller repulsivt. Exempel på dessa krafter är elektrostatiska, hydrofobiska, van
der Waals, sterisk effekt och temperaturpåverkan. Eftersom de flesta inerta ytor är negativt
laddade och bakteriers ytor också är negativt laddade så verkar elektrostatiska krafter
repulsivt då dessa två ytor interagerar.
När en bakterie fäst till en yta genom att förankra sig genom specifik interaktion så är
adhesionen irreversibel. Endast med fysikalisk eller kemisk påverkan kan adhesionen brytas.
Alltså sker troligen adhesionen i två steg där det första steget är reversibelt och det andra
irreversibelt. Den irreversibla adhesionen orsakas av adhesiner2.
I försöken användes två stycken bakterier, Escherichiacoli JM109 och Mikrococcus.
Lutea. Den mest intressanta skillnaden mellan de två är att den ena är gram-positiv och den
andra gram-negativ. Gram-positva bakterier har en hög koncentration av teichonsyra i det
yttre skiktet. Detta ger de gram-positiva bakterierna ett lägre pH. En direkt effekt av detta är
att dessa bakterier har en lägre zeta-potential än de gram-negativa. Zeta-potentialen är ett mått
på en bakteries nettoladdning. En låg zeta-potential reflekterar alltså en hög surhet på ytan av
en bakterie3. För övrigt skiljer sammansättningen på grampositiva och gramnegativa
cellväggar på ett tydligt vis. De grampositiva bakterierna har en tjockare och därmed mycket
mer stabil cellvägg med peptidoglykan som den mest centrala beståndsdelen (20-40 nm).
Gramnegativa bakterier har också peptidoglykan som en viktig beståndsdel. Skiktet av
peptidoglykan täcks dock av ett yttre membran med fosfoyl-lipopolysaccharidprotein (LPS)
utstickande ytterst. Adhesiner sitter fästa här. I det yttre membranet finns även hydrofoba
proteiner med vidhäftande förmågor4. Man bör alltså kunna förvänta sig tydliga skillnader
mellan grampositiva och gramnegativa bakteriers vidhäftningsegenskaper.
7
Material och metoder
Material
Mikroorganism
Micrococcus lutea (M.lutea) förvarad i frysmedium, erhållen fryst (-70°C) från instutionens
stamförråd.
Escherichia coli JM109 (E.coli JM109) förvarad i LB med 10 % glycerol, erhållen fryst
(-70˚C) från instutionens stamförråd.
Utrustning för odlingsförsöken
Autoklav:
Varioklav, steam steriliser
H+P Labortechnik GmbH
Type 400E
S/n 42200999
PH-meter:
Orion 520A
Orion Research Inc
S/n 006872
Skakinkubator:
Orbital shaker 4536
Forma Scientific
S/n 16258/21
Mikrovågsugn:
Elvita
Model E18TF
S/n 9611002393
Magnetomrörare:
Kebolab MR 2000
S/n 05301
1L Fermentor med tillbehör:
SARA small Bioreactor controlserie 2000
Belach Biotechnik
Styrprogram, Phantom 2000 v.2.01
Spektrofotometer:
Ultraspec 3000
UV/visible spectrophotometer
Model 80-2106-20
S/n 65513
Analysvåg:
Mettler Toledo P11875
Snabbpipetter: 5-1000 µL, Labassco
Aluminiumfolie
8
Autoklavtejp
Bägare 500 ml
Duralexflaskor 250 ml, 500 ml, 1000 ml
E-kolv 50 ml, 250 ml, 500 ml
Eppendorfrör
Exikator
Falconrör
Filterpapper
Hink
Kanyler
Kvartsküvett
Magnetloppa
Muffinsformar
Mätcylinder 1000 ml
Parafilm
Petriplattor
Plastküvett
Pinsett
Sax
Skedar
Slangklämmor
Sprutor 1 ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml
Utrustning för mätning av pappersmassa
Analysvåg:
XT6200C-FR
Precisa
Dator:
Specialprogram Tinet 2.4
Konduktivitetsmätare:
CDM80 Radiometer Copenhagen
Exsickator
Termostadbad
Vaccumflaska
Buchnertratt
3 st. 1000 ml kolv (används för att bereda lösningar)
Förvägda filterpapper Munktell nr 3 (7 cm)
Provbehållare
Utrustning kontaktförsök
Autoklav:
Varioklav, steam steriliser
H+P Labortechnik GmbH
Type 400E
S/n 42200999
Skakinkubator:
Orbital shaker 4536
9
Forma Scientific
S/n 16258/21
Aluminiumfolie
Autoklavtejp
E-kolv 500 ml, 50 ml
Eppendorfrör
Duralexflaskor 500 ml, 1000 ml
Petriplattor
Snabbpipetter: 5-1000 µL, Labassco
Glaspärlor: 3 mm i diameter
Kemikalier
Glucose SIGMA D-(+)-Glucose EC no. 200-075-1
Natriumklorid, NaCl, Fischer Scientific UK Limited, Batch 0737701
Casein Trypsic Peptone (Tryptone), Scharlau Microbiology, Batch 13986, 15994
Yeast Extract BactoTM, Lot 3296925
Peptone from soymeal papain digested, Lot 744112
Agar-Agar, granular powder, Fischer scientific, Batch 0737925
Sodium hydroxide pellets, Scharlau, Batch 7764
Hydrochloricacid 37% reagent grade Scharlau, Batch 82597
Natriumdihydrogenfosfat, Prolabo, Batch J020, NaH2PO42H20
DiNatriumhydrogenphosphat-dihydrat, Schalau Chemie SA, Batch 1.06580.1000
70 % Etanol, EtOH
Skumdämparolja, Structol
Kalibreringslösningar:
1. pH 7,00, Scharlau Cheine SA, Batch 74079
2. pH 4,00, Scharlau Cheine SA, Batch 74250
Odlingsmedia och lösningar
LB-medium (dubbelt medium) 1 L
Trypton 20 g
Natriumklorid 5 g
Jästextrakt 10 g
Fosfatbuffrad salin-lösning (PBS) 2L
Lösning A: 100 ml 0,2 M NaH2PO4
NaH2PO4*2H2O = 3,12 g
Lösning B: 250 ml 0,2 M Na2HPO4
Na2HPO4*2H2O = 8,9 g
19 ml av lösning A
81 ml av lösning B
19 g NaCl
pH ställs till 7,4
10
40 % glukos-lösning
200 ml MilliQ-vatten
80 g D(+)-Glukos
1 L Agar för gjutning av petriplattor
10 g Tryptone
10 g NaCl
5 g jästextrakt
15 g agar agar
Metoder
Odling på platta
Mikroorganismerna hämtades från instutionens stamförråd, en frysbox med temperatur -70ºC.
Med ympögla racklades de ut på petriplatta med en s.k. tertiärstrykning. Detta moment
utfördes på laboratoriebänk som innan strykningen tvättats ren med 70 % etanol. Strykningen
utfördes i närvaro av öppen låga för att minska kontaminationsrisken.
Agarblandning autoklaverades och ca 30 st. plattor placerades på en spritad laboratoriebänk.
På laboratoriebänken placerades även en bunsenbrännare med öppen gaslåga. Den varma
lösningen hälldes över till petriskålarna och därefter brändes eventuella luftbubblor bort med
brännaren. Skålarna fick sedan stå i rumstemperatur i ca 24 timmar innan de placerades i
kylskåp.
Förberedelse av odling
Fermentorn monterades och alla sensorer kontrollerades. Syreelektroden kalibrerades till 100
% efter att ha polariserat under ca 3 timmar. pH-elektroden kalibrerades med
kalibreringslösningar pH 4 resp. pH 7. Temperaturgivaren kalibrerades till rumstemperatur.
Odling av förkulturer förbereddes genom blandning av dubbelt LB-medium. Mediet hälldes
ned i E-kolvar som förslöts med folie och därefter autoklaverades i samma omgång med
glukos som blandats i en separat duralexflaska vid 1,2 bar övertryck och 121ºC. Efter färdig
sterilisering placerades utrustningen i LAF-bänk.
1000 ml dubbelt LB-medium blandades och överfördes till odlingskärlet. Slangar för bas samt
syra kläddes med folie före den efterföljande autoklaveringen av utrustningen.
Ympningen utfördes sedan i LAF-bänk. Önskad koloni ympades från odlingsplatta med steril
ympögla i det sterila mediumet. E-kolvarna placerades sedan i stillastående skakinkubator vid
37ºC. Ett tidur startade skakinkubatorn i lämplig tid för förkulturerna. Alla förkulturer odlades
under betingelserna 37ºC och 250 rpm.
11
Odling i fermentor
Det steriliserade odlingskärlet ställdes på plats och anslöts till luft, kylvatten, omrörare och
pH-reglering. 5 M H3PO4 och 5 M NaoH användes för reglering av pH i mediumet. Slangen
för utgående luft anslöts till en spritfälla för avdödning av bakterierna. Ingående luft skapade
ett högre tryck inuti kärlet än utanpå. Temperaturen ställdes till 37ºC. Sedan togs prov från
mediumet. Med erhållet prov kontrollerades pH samt absorbansen i spektrofotometer.
Absorbansen kontrollerades vid en våglängd på 600 nm och eventuella utspädningar utfördes
med PBS.
Efter dessa moment ympades mikroorganismen. Ympens volym var 25-50 ml beroende
på odlingstillfälle. Syreregleringen kalibrerades sedan till 100 %. Prover togs därefter med
jämna mellanrum för att kontrollera tillväxten. Efter 1h av odling påbörjades manuell tillförsel
av glukos. Syreregleringen ställdes in på ett högt börvärde för att undvika syrebrist i odlingen.
Absorbansprover mättes sedan fram till stationärfasen.
Jonbyte av massa till H+-form
5 g av pappersmassan vägdes upp och blandades med 500 ml 0,01 M HCl i en rundbottnad
1000 ml kolv och därefter ställdes pH till 2. Lösningen fick sedan stå i 30 min och pH
justerades med HCl vid behov. I nästa steg filtrerades massan av i en buchnertratt med filter
och tvättades med destvatten tills konduktiviteten på filtratet var under 5 µs/cm. Den var nu i
sin H+form. Filterkakan separerades efteråt från filtret och vägdes. Pappersmassans vikt
angavs i våtform.
Mätning av den totala laddningen hos massorna
En 1000 ml rundbottnad kolv placerades på analysvågen och en äggformad magnetloppa
lades i. En uppskattning av massans våtvikt omvandlad till torrvikt bestämdes till 1/10 av
våtvikten. 1/10 av pappersmassan som genomgått jonbyte till H+-form placerades i kolven. 5
ml 0,01 M HCl tillsattes och därefter 10 ml 0,01 M NaCl. Provet späddes upp till en
totalvolym om 500 ml. Kärlet placerades i termostadbadet (25˚C) och konduktivitetscell, pHgivare samt kväveslang anslöts. Titreringen startades sedan genom datorprogram. Efter
körningen filtrerades massan av i buchnertratt. Filtret som användes var förvägt så att den
exakta vikten av massan efter titreringen erhölls. Efter titreringen utvärderades kurvan
manuellt (se bilagor 1-9).
Adhesionsförsök
1 L CLED-agar blandades och autoklaverades (1,2 atm, 120ºC i 20 min). Agar göts i plattor
som fick stå i rumstemperatur över natt för att eliminera kondens. Dagen därpå placerades de i
kylskåp för förvaring före användning.
2 L PBS och 500 ml dubbelt LB-medium blandades . 200 ml av LB-mediumet hälldes sedan
ned i en 500 ml E-kolv som täcktes med folie. Förfarandet ägde rum i LAF-bänk. E-kolven
autoklaverades sedan under samma betingelser som vid tidigare tillfällen. Sedan ympades Ekolven och placerades därefter i skakinkubator vid 37ºC skakfrekvens 250 rpm.
500 ml PBS hälldes över i duralexflaska och autoklaverades tillsammans med 1 g blekt
lövmassa som vägts upp i en 50 ml E-kolv och därefter täckts med två lager av folie.
PBS:bufferten kyldes efter avslutad autoklavering i isbad.
12
Adhesionsförsöket inleddes med att 1 µL från förkulturen odlad över natt ströks ut på platta
med ympögla. Sedan togs ytterligare 1µL av övernattodlingen till ett eppendorfrör och
späddes med 99 µL PBS vilket gav en spädning på 1:100. Även en spädning på 1:1000
gjordes till eppendorfrör till en totalvolym på 1ml. Från dessa båda spädningar pipetterades
25µL till petri-plattor (se Figur 1). Dubbelprov av plattor tillämpades. Spädningarna racklades
ut på plattorna m.h.a. sterila glaspärlor(diameter 3 mm).
25ml av övernattodlingen hälldes sedan över till E-kolven med 1g blekt löv-vedsmassa. Ekolven vortexades i ca: 20 sekunder på 1800 varv. Därefter skakades den även för hand i c:a
30 sekunder. Därefter utfördes samma spädningar som ovan. 1µL övefördes med ympögla
direkt från E-kolven till platta sedan spädningar på 1:100 samt 1:1000. 25µL av dessa
racklades sedan ut på petri-plattor. Dubbelprov av plattor tillämpades.
Ymp 1µL
1/100
1/1000
Figur 1. Översikt av adhesionsförsök mikrococcus lutea och Ecoli JM109.
Konduktivitetstitrering på massorna
En bägare med volymen 1000 ml fylldes med 5 ml 0,01 M HCl, 10 ml 0,01 M NaCl och
späddes upp till 500 ml med milliQ-vatten. Bägaren placerades på omrörningsplatta i
dragskåp och en magnetloppa lades i botten. Titreringen utfördes droppvis med 0,1 M NaOH
13
både på prover med och utan pappersmassa. 2 gram massa togs ut vid varje titrering.
Konduktivitetsmätningar utfördes efter varje tillsatt droppe NaOH.
SEM (Scanning electron microscope)
Representativt prov togs och torkades in. Provet guldpläterades under vakuum i 100 sek. vid
1,2 kw spänning och 30 mA ström.
Fermentationsförsök
M. lutea försök 1
500 ml dubbelt LB-medium blandades och tre st. 250 ml E-kolvar fylldes med vardera 100 ml
medium. 150 ml 40 % glukos blandades. De tre E-kolvarna med medium, glukos-lösning
(separat i duralexflaska) samt skumdämparolja autoklaverades och fick därefter vila i LAFbänk.
Under pågående sterilisering av förkulturerna, glukos-lösning och skumdämparolja
monterades det stora odlingskärlet ihop med alla dess givare och slangar. Efter monteringen
skruvades en av muttrarna loss och 1L dubbelt LB-medium hälldes ned i kärlet. Syra- och
bas- slangarnas öppningar kläddes med folie och kärlet med medium samt syra- och
basslangar autoklaverades. Förkulturerna ympades med varsin koloni av M .lutea. Kolonierna
hade renstrukits dagen innan på CLED-plattor. Ympen utfördes i LAF-bänk.
De tre E-kolvarna placerades i skakinkubator över natt i 37˚C, 250 rpm. Glukoslösningen och skumdämparoljan lämnades kvar i LAF-bänken som fick stå påslagen under
natten.
Efter 5 h i skakinkubator hade tillväxt ägt rum i alla tre E-kolvar. Slangarna för in- och utluft
anslöts till fermentorn och luften in ställdes till 8 cc/min. Sedan anslöts slangarna för
kylvatten, syra och basslangar samt alla sladdar till elektroderna.
5 M H3PO4 och 5 M NaoH användes för reglering av pH i mediumet. Temperaturen
skruvades upp till ett börvärde på 37˚C och rpm till 300. Två droppar skumdämparolja
tillsattes till odlingen. 4 ml prov togs ut för pH-kontroll och absorbansmätning.
Regleringsintervallet för pH ställdes in mellan 6,89 och 7,14. Överföringen av förkultur från
E-kolv till spruta på 50 ml gjordes i LAF-bänk. Efter 7h på skakinkubator ympades
fermentorn med innehållet i sprutan. Efter 11 h gjordes upptäckten att syreregleringen av
misstag inte var påslagen och därmed hade ingen ökning av omrörningen ägt rum. När denna
aktiverades ökade tillväxten och den seglivade lagfasen gick snabbt mot logfas.
Glukos tillsattes med jämna mellanrum, (tabell 1). Första injektionen glukos gjordes 1,5 h
efter ymp och därefter injicerades glukos varje halvtimme (se Fig. 2 och Fig. 3).
14
Tabell 1. OD-mätningar för monitorering av tillväxt under odling av M. lutea
Prov
Tid
(min)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
420
450
480
510
540
570
600
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Glukos
(volym)
OD
0,034
0,116
0,212
0,232
0,264
0,064
0,072
0,296
0,124
0,196
0,476
0,432
0,512
0,744
1,052
1,124
2,45
3,40
4,94
8,16
13,2
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
6 ml
6 ml
6 ml
14
Optisk densitet
12
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Tid (min)
Figur 2. Tillväxtkurva M.lutea odlad på dubbelt LB medium försök 1
15
3
optisk densitet
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Tid(min)
Figur 3. Logaritmerad logfas av tillväxtkurva M.lutea försök 1
Bedömning av generationstiden m.h.a. den räta linjens ekvation:
∆y = ln13,2 – ln3,4 = 1,356
∆x = 90 min
µ = 0,01506 min-1
tg =
ln 2
= 46,0 min
0,01506
E. coli försök 1
Fermentorn monterades och givare kalibrerades på samma sätt som vid föregående
odlingstillfälle. 500 ml dubbelt LB-medium blandades. 3st 250 ml E-kolvar fylldes med
vardera 100 ml av mediet och täcktes med folie. Dessa tre E-kolvar autoklaverades
tillsammans med 150 ml 40 % glukos (separat i duralexflaska) samt skumdämparolja. I nästa
omgång autoklaverades fermentorn med samma arrangemang som vid föregående odling med
avseende på alla detaljer. E-kolvarna ympades med kolonier erhållna från petriplattor med
LB-agar.
Fermentorn ställdes på plats för odling. Inluften skruvades på, elektroder samt slangar för syra
och bas kopplades på. Därefter togs prov från LB-mediet för mätning av OD samt pHkontroll. Efter 9,5 h odling i skakinkubator av förkulturerna ympades fermentorn med 20 ml
som påvisat tillväxt pH var då 6,85 och mediet 37°C. Syreregleringen kalibrerades till 100 %
vid tillfället för ymp. Omrörningen sattes till 300 rpm och två droppar skumdämparolja
tillsattes. Första satsen glukos tillsattes efter c:a 1 h odling och därefter gjordes ytterligare
tillsatser med jämna mellanrum, (se Tabell 2). Absorbansmätningar gjordes utan avvikelser
från föregående odling för att erhålla tillväxtkurva, (se tabell 2 och Figur 4).
16
Tabell 2. OD-mätningar för monitorering av E-coliJM109:s tillväxt under odling
Prov
Tid
(min)
0
12
30
50
70
95
115
135
155
175
195
215
235
255
285
305
325
345
365
385
405
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Glukos
(volym)
OD
0,036
0,048
0,052
0,070
0,098
0,134
0,202
0,332
0,472
0,832
0,896
1,55
1,99
2,53
2,50
3,02
4,12
4,80
7,60
8,80
9,20
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
Optisk densitet
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
400
500
Tid(min)
Figur 4. Tillväxtkurva för EcoliJM109 odlad på dubbelt LB medium försök 1
17
2,5
optisk densitet
2
1,5
1
0,5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Tid(min)
Figur 5. Logaritmerad logfas av tillväxtkurva E.coliJM109 försök 1
∆y = ln9,20 – ln3,02 = 1,114
∆x = 100 min
µ = 0,0114
tg =
ln 2
= 62,2 min
0,0114
M. lutea försök 2
För att underlätta det förberedande arbetet vid kommande odlingar utfördes denna odling med
syftet att göra en s.k. cellbank. Celler togs ut från odlingen under logfas och placerades i
eppendorfrör som sedan frystes in i -70°C. Dessa celler avsågs utgöra en stambank att
användas som ymp för framtida odlingstillfällen.
Fermentorn gjordes i ordning och givare kalibrerades som vid tidigare odlingar. 500 ml
dubbelt LB-medium blandades. 2 st. E-kolvar med volymen 500 ml fylldes med vardera 200
ml av mediet och täcktes med aluminiumfolie. Dessa autoklaverades med 200 ml 40 %
glukos samt skumdämparolja som blandats separat från mediumet i indivduella durexflaskor.
Därefter blandades 1000 ml dubbelt LB-medium som omgående fördes över till
fermentorn. Syra och basslangar täcktes med folie och alla öppningar in i kärlet stängdes.
Slangar för in och utluft täpptes igen med klämmor. Allting förvarades sedan över natt i
kylrum. Förkulturerna ympades och placerades därefter i skakinkubator och inkubatorn
startades med hjälp av tiduret. Varvtal och temperatur ställdes in på samma sätt som vid
tidigare odlingstillfällen.
Efter 6 h odling var mediumet fortfarande blankt varpå ett större inokulat togs och blandades
med 10 ml sterilt LB-medium, detta medium överfördes sedan till de båda förkulturerna. 8 ml
till den ena E-kolven och två till den andra. Glycerol autoklaverades för att undvika skador på
mikroorgansimerna då de frystes ned. Efter 9 h på skak fördes ympen till fermentorn. pH var
då 6,7 och temperaturen 37ºC. Syreregleringen kalibrerades till 100 % och ett börvärde på
denna reglering ställdes in på 93%.
18
Odlingen pågick sedan under 8 h. Då hade OD stigit till ett värde av 10, 0. Enligt tidigare
resultat befann sig då bakterien i logfas, (Tabell 1, Figur 2) och därmed avslutades odlingen.
20 ml glycerol tillsattes fermentorn och efter omblandning togs provet ut i 20 st. sterila
eppendorfrör. De 20 rören som erhölls placerades sedan i frys (-70ºC).
Tabell 3. OD-mätningar för monitorering av tillväxt under odling av M.lutea försök 2
Prov
Tid
(min)
0
20
40
70
100
130
160
190
220
250
280
310
335
360
390
415
445
475
495
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Glukos
(volym)
5 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
OD
0,030
0,056
0,066
0,080
0,088
0,106
0,138
0,192
0,268
0,396
0,566
0,830
1,150
1,640
2,640
3,800
5,520
6,200
10,04
12
Optisk densitet
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
400
500
600
Tid(min)
Figur 6. Tillväxtkurva för Mikrococcus.lutea odlad på dubbelt LB medium försök 2
19
2,5
optisk densitet
2
1,5
1
0,5
0
0
100
200
300
400
500
600
Tid(min)
Figur 7. Logaritmerad logfas av tillväxtkurva Mikrococcus.lutea försök 2
Beräkning av µ m.h.a. den räta linjens ekvation:
∆y = 1,569
∆x = 110 min
µ = 0,01426
tg = 48,6 min
Resultatet överensstämmer väl med resultatet från försök 1.
E. coli försök 2
Fermentorn monterades och givare kalibrerades på samma sätt som vid tidigare
odlingstillfällen. 200 ml dubbelt LB-medium blandades. Mediet fördes över till en 500 ml Ekolv och autoklaverades därpå tillsammans med 150 ml 40 % glukos (separat durexflaska)
samt skumdämparolja. Efter steriliseringen flyttades materialet över till påslagen LAF-bänk.
1000 ml dubbelt LB-medium blandades med peptone baserat på soyabönor istället för
tryptone. Förkulturen ympades med en koloni från en plattodling av E-coliJM109. Odling på
skakinkubator gjordes lika tidigare.
Efter 8,75 h odling i skakinkubator utfördes ympen av fermentorn. Temperaturen var då
36,5ºC, rpm 130 och pH 6,93. Syreregleringen kallibrerades till 100% i samband med ympen.
Inluften drogs ned till 0 cc/min då just denna stam av E-coli visat sig syrekänslig i början av
odling. Omrörningen reglerades manuellt under odlingens gång. Glukosstickor användes för
att registrera glukoshalten. 3 h in i odlingen var omrörningen inställd till 500 rpm och inluften
uppskruvad till 6 cc/min. Celler för förvaring i stambank togs ut och frystes in vid ett OD på
6. På rekommendation av handledaren tillsattes 150 ml glycerol/l. OD-mätning efter 5 h
visade 5,84, se (Tabell 4 och Figur 8). Glycerol tillsattes fermentorn m.h.a. sterilpipetter,
volym 25 ml. Fermentorn förflyttades till LAF-bänk. De sterila eppendorfrören fylldes under
iakttagande av aspetik. 78 eppendorfrör frystes in i -70º C. Ett av eppendorfrören användes för
kontaminationstest samt OD-mätning. Med ympögla ströks provet ut på LB-platta. OD20
mätningen gav en absorbans på 6,28 vid skörd av kulturen (se Figur 8). På LB-plattan kunde
nästföljande dag inga främmande kolonier upptäckas.
Tabell 4. OD-mätningar för monitorering av tillväxt under odling av E.coliJM109 försök 2
Prov
Tid
(min)
0
10
35
55
75
105
135
155
175
200
220
245
265
280
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Glukos
(volym)
6 ml
OD
0,122
0,146
0,170
0,212
0,248
0,446
0,710
1,680
2,420
2,500
3,060
4,260
4,960
5,840
7
Optisk densitet
6
5
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
Tid(min)
Figur 8. Tillväxtkurva för E.coliJM109 odlad på dubbelt LB medium försök 2
21
2
1,8
optisk densitet
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
250
300
Tid(min)
Figur 9. Logaritmerad logfas av tillväxtkurva E.coliJM109 försök 2
Bedömning av µ m.h.a. den räta linjens ekvation:
∆y = 0,848
∆x = 80 min
µ = 0,0106 min-1
tg = 65 min
E. coli försök 3
Fermentorn monterades och givare kalibrerades lika tidigare. Tinade celler från cellbanken
användes direkt för ymp av fermentorn. 1000 ml medium blandades lika tidigare och
överfördes till den monterade fermentorn. Även 300 ml 40 % glukos blandades lika tidigare i
en separat duralexflaska. Slangar för bas och syra kläddes i folie och skumdämparolja
överfördes till duralexflaska. Varorna autoklaverades som vid tidigare odlingstillfällen.
Fermentorn ympades med 5 ml EcoliJM109 från cellbanken. Temperaturen i
odlingskärlet var vid tillfället för ymp 28,9°C och pH 6,9. Omrörningen var nästan 0 rpm och
luftflödet var frånslaget. Efter ca 2 h ökades inluften till 3 cc/min. Omrörningen justerades till
260 RPM. 10 minuter senare tillsattes första satsen glukos och den var 5 ml. Glukosstickor
användes för att mäta nivån av glukos i odlingen. Omrörningen ökades successivt manuellt
under odlingen och efter fyra timmars odling var RPM inställt på 675. 5,5h efter ymp tillsattes
ytterligare 5 ml glukos. Strax innan denna andra tillsats av glukos ökades omrörningen till 985
rpm. En sänkning i pH efter tillsatsen av glukos indikerade att 5 ml möjligtvis var en aning för
mycket, se (Tabell 5, Figur 10 och Figur 11).
22
Tabell 5. OD-mätningar för monitorering av tillväxt vid odling av E.coliJM109
Prov
Tid
(min)
0
30
60
80
140
180
210
240
270
295
325
355
380
410
430
450
475
485
495
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Glukos
(volym)
5 ml
5 ml
3 ml
3 ml
OD
0,040
0,058
0,060
0,064
0,088
0,182
0,262
0,424
0,820
1,360
2,270
2,680
3,720
4,660
5,640
6,720
7,360
8,560
8,800
Optisk densitet
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
400
500
600
Tid(min)
Figur 10. Tillväxtkurva för EcoliJM109 odlad på dubbelt LB medium försök 3
23
2,5
optisk densitet
2
1,5
1
0,5
0
0
100
200
300
400
500
600
Tid(min)
Figur 11. Logaritmerad logfas av tillväxtkurva EcoliJM109 försök 3
Bedömning av generationstiden m.h.a. den räta linjens ekvation:
∆y = 1,01
∆x = 120 min
µ = 0,0084 min-1
tg = 82,35 min
Lagfasen var längre i försök 3 i jämförelse med försök 2 för E.coliJM109. Den förändrade
strategin för glukostillsats avspeglas i kurvornas utseende då logfasen kan identifieras vilket
inte var möjligt i försök 1. Generationstiderna skiljer sig med ca 17 min och den längre
lagfasen i försök 3 kan vara att härleda till bytet av tryptone till peptone. Ympförfarandet
skiljde sig också, vilket också kan ha bidragit.
Resultat
Adhesionsförsök med M. lutea
CLED-plattor användes under försöket. Se metoddelen sid. 10-11 för information om hur
mikroorganismen adherades till fibrerna.
Tabell 6. Resultat av adhesionsförsök med M. lutea adhering till blekt lövvedsmassa.
Spädning
Icke adherade
Adherade
Ospädd 1µL överväxt i primärstryket överväxt i primärstryket
1/100
överväxt
överväxt men mindre till antalet
7
1/1000
ca 300 st = 1,2 × 10 CFU/l
ca 50 st = 2 × 106 CFU/l
Kolonibildning före och efter adhesion:
1,2*107-2*106 = 10000000 CFU/l
24
Resultatet visar en reduktion på106 kolonibildande enheter per L vilket motsvarar en
reduktion om c:a 90 % efter att odlingen kommit i kontakt med den blekta lövvedsmassan.
Detta resultat är en stark indikation på att bakterien fäst till den blekta lövmassan.
Adhesionsförsök E. coliJM109
Motsvarande adhesionförsök utfördes på E.coli JM109. Ympningen till förkulturen utfördes
med E-colibakterier från cellbanken. CLED-plattor användes för utodling av Ecolibakterierna precis som i föregående adhesionsförsök.
Resultatet av kontaktförsöket påvisade inga skillnader i antalet kolonier mellan proverna före
och efter kontakt. Samtliga CLED-plattor påvisade överväxt av antalet kolonier. E.coli tycks
ha egenskaper som är svåra att förutsäga. Det krävs större precision i försöksvariablerna.
Adhesionsmetoden tycks inte vara tillräckligt välpreciserad.
Totalladdning av massor
För att kunna se ett sammanhang mellan laddning och graden av bindning så mättes den totala
laddningen av de fyra olika massorna. Noterbart är att båda massorna hade en högre laddning
i sitt oblekta tillstånd och att lövvedsmassa uppvisade en högre laddning i jämförelse med
barrmassa.
Tabell 7. Totalladdning massor.
Medelvärde blekt löv: 71,3 µekv/g
Medelvärde blekt barr: 43,5 µekv/g
Medelvärde oblekt löv: 146,5 µekv/g
Medelvärde oblekt barr: 91,0 µekv/g
För beräkningar av totalladdning och titreringskurvor, se (Bilaga 2-9).
25
Konduktivitetstitrering
Konduktivitet är ett mått på hur väl ett material kan transportera elektrisk laddning. Denna
faktor kan ha en avgörande inverkan på ett materials vidhäftningsförmåga.
Konduktivitetsmätningen utfördes först enbart på bufferten och sedan på de fyra olika
massorna
Konduktivitetstitrering Buffert
90
80
Kond(µS/cm)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Vol(m l)
Figur 12. Konduktivitetstitrering av Buffert. Konduktivitetens beroende av tillsatt volym 0,1M
NaOH.
Vol(ml)
0
0,2
0,4
0,55
0,85
1,1
1,5
Kon(µS/cm)
66,9
54,5
40,1
48
55,9
64,9
83,7
26
Konduktivitetstitrering Blekt lövvedsmassa
100
Kon(µS/cm)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Vol(m l)
Figur 13. Konduktivitetstitrering blekt lövvedsmassa. Konduktivitetens beroende av tillsatt
volym 0,1M NaOH.
Vol(ml) Kon(µS/cm)
0
53,9
0,2
43,9
0,4
41,5
0,5
44
0,9
60,3
1,2
78,5
1,5
90,4
27
Konduktivitetstitrering Blekt barrvedsmassa
90
80
Kond(µS/cm)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Vol(ml)
Figur 14. Konduktivitetstitrering av blekt barrvedsmassa. Konduktivitetens beroende av
tillsatt volym 0,1M NaOH.
Vol(ml) Kond(µS/cm)
0
59,6
0,1
54
0,2
47,2
0,4
40,3
0,6
40,6
0,8
51,3
1
62,8
1,2
72,6
1,4
79,3
28
Konduktivitetstitrering Oblekt lövvedsmassa
160
140
Kond(µS/cm)
120
100
80
60
40
20
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Vol(ml)
Figur 15. Konduktivitetstitrering av oblekt lövvedsmassa. Konduktivitetens beroende av
tillsatt volym 0,1M NaOH.
Vol(ml)
0
0,2
0,5
0,6
0,8
0,9
1,1
1,4
1,7
Kond(µS/cm)
89,7
97,3
107,7
112,2
119,6
125,5
134,5
146,6
158,1
29
Konduktivitetstitrering Oblekt barr
180
160
Kond(µS/cm)
140
120
100
80
60
40
20
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Vol(m l)
Figur 16. Konduktivitetstitrering av oblekt barrvedsmassa. Konduktivitetens beroende av
tillsatt volym 0,1M NaOH.
Vol(ml)Kond(µS/cm)
0
89,7
0,2
97,3
0,5
107,7
0,6
112,2
0,8
119,6
0,9
125,5
1,1
134,5
1,4
146,6
1,7
158,1
I massornas oblekta form är konduktiviteten mycket hög initialt (runt 90 µS/cm) till skillnad
från i blekt tillstånd (runt 55-60 µS/cm). Konduktiviteten för de oblekta massorna påvisade en
stigande konduktivitet genom hela titreringen. Titreringen på endast buffert gav en högre
konduktivitet initialt (runt 70 µS/cm), i jämförelse med massornas blekta form. Noterbart är
också att konduktiviteten aldrig sjunker lägre än 40 µS/cm, varken under titreringen på
bufferten eller i massornas blekta form.
30
Elektronmikroskopbilder
Elektronmikroskop bilder av blekt lövvedsmassa med adherenta E. coli bakterier. Bilderna
togs med syftet att se hur bakterierna fäste till materialet.
Bilderna visar samma preparat. Den första bilden är tagen med förstoringsgraden 1×3500 och
den andra 1×10000. Bakterien syns tydligt på båda bilderna och tycks ligga adherent på ytan
till materialet.
31
Diskussion
Studien inleddes med upprepade odlingar av de båda mikroorganismerna för att studera
egenskaperna hos bakterierna. Tillväxtkurvor gjordes för de båda mikroorganismerna.
Tillväxtkurvorna baserades på optisk densitet som mättes under pågående odlingar. Syftet var
att kontaktförsöken senare skulle utföras med mikroorganismerna i logfas.
Över hälften av odlingarna genomfördes utan möjlighet att mäta glukoshalten. Under
dessa inledande odlingar tillsattes rikligt med glukos. När sedan användandet av glukosstickor
påbörjades visade det sig att en mycket mindre mängd glukos troligen varit tillräcklig. För
mycket glukos har en negativ effekt på tillväxten hos bakterier och proteiner då oönskade
syror produceras. M.lutea verkade dock inte påverkas av den höga halten glukos. Däremot
visade sig E.coli lite mer känslig i detta avseende då tillväxten saktade av vid ett par tillfällen.
E.coli visade sig också känslig i andra avseenden. Då den under ett flertal tillfällen visade sig
trögstartad och vid något tillfälle inte alls ville växa så gjordes ett antagande om att stammen
var syrekänslig (Sven Hamps kommentar). Metoden ändrades så att syrehalten i början hölls
nära noll. Så fort tillväxt påvisats genom absorbansmätningarna skruvades syretillförseln upp
succesivt. Mikrococcin som är strikt aerob trivdes med hög syretillförsel genom hela
odlingen.
På STFI mättes totalladdningen av pappersmassorna. Dessa mätningar indikerade att
lövvedsmassa i dess båda tillstånd påvisade en högre totalladdning i jämförelse med barr. Den
oblekta formen för lövmassa gav ett värde på 146,5 µekv/g medan den oblekta barrmassan
gav ett värde på 91,0 µekv/g. Den blekta massan gav ett värde på 71,3 µekv/g för lövmassa
och 43,5 µekv/g för barrmassa. Påföljande konduktivitetstitreringar utförda efter dessa
mätningar visade ingen noterbar skillnad mellan massorna, däremot mellan de båda
kvaliteterna. I massornas oblekta form var konduktiviteten mycket högre initialt (runt
90µS/cm) till skillnad från i blekt tillstånd (runt 55-60µS/cm). Konduktiviteten för de oblekta
massorna påvisade en stigande konduktivitet genom hela titreringen där de blekta massorna
uppträdde mer förutsägbart.
I studier av liknande karaktär har olika slutsatser kunnat dras. I en studie gjordes
experiment med varierande jonstyrkor hos en- och tvåvärdar metalljoner för att karakterisera
den hydrofila karaktären hos cellulosafibrer. Studien kom med slutsatsen att elektrostatiska
krafter är involverade i adhesionsprocessen genom Lewissyra-basinteraktion vid låg
jonstyrka6.
I en annan studie gjordes antagandet att hydrofoba, icke specifika interaktioner är
bestämmande för bakterieadhesionen, detta p.g.a. att både fiberyta och bakteriers cellyta är
starkt elektrondonerande. I denna studie bestämdes ytenergin hos olika fibrer genom
indränkning med vätska i kapillaritetsstudier på provark med olika vätskor7.
En tredje studie visade också ett intressant resultat. I denna studie användes laboratoriefilter
av nylon, cellulosa och glasfibrer. Två Gram-negativa och en Gram-positiv bakterie användes
i studien och den visade att bakterier passerar filter där porvidden är minst 5 gånger
bakteriediametern. Med en förminskad porstorlek kan bakterier lätt hållas kvar genom
adhesion8. För att undersöka hur molekylära interaktioner såsom van der Waals och
elektrostatiska bindningar på olika sätt påverkar bakteriernas pappersmassabindande
egenskaper vore det intressant att använda atomic force mikroskopiteknik. Denna typ av
studie har även föreslagits av Dufrene Y.F9.
Adhesionsförsöken visade sig komplicerade och lämnade stort utrymme för optimering
vid fortsatta studier. Minimering av hantering samt sterilisering av massan inklusive
resterande ingående material och utspädningslösning är essentiellt. Adhesionsförsöket med
M.lutea som vidhäftande mikroorganism får anses som det mest lyckade då en tydlig
reduktion av kolonier efter kontakt kunde påvisas. Det bör dock nämnas att reduktionens
32
uppkomst nödvändigtvis inte beror på att mikroorganismen fäst till materialet. Samma
förfarande med E.coli visade varierande resultat utan möjlighet att dra slutsater av.
För vidare studier i ämnet föreslås främst användning av M.lutea då denna ger jämnare
resultat under både odling och adhesionsförfarande. Intressant här är den uppmätta skillnaden
i totalladning mellan massorna och sambandet med kvaliteten. Även information från
konduktivitstitreringarna kan vara av intresse att jämföra. Försök bör också göras med
konduktivitetsmätningar efter kontakt mellan massa och bakterier. Det är svårt att uttala sig
om materialens användbarhet för dessa försök. Vidare studier måste genomföras. Dock finns
en del information om materialen som kan vara av intresse för vidare experiment, så som
laddning och konduktivitet. Elektrostatiska krafter bör verka repulsivt då fibrerna har en
negativ yta, vilket även bakterierna har. De stora skillnaderna i laddning mellan massorna i
oblekt respektive blekt tillstånd borde alltså kunna spela roll för adhesionen. Det vore
intressant att undersöka. Andra variabler som kan vara intressanta att undersöka är om
adhesionen varierar under inverkan av olika pH eller om det går att detektera skillnader i
adhesion i samband med olika tillväxtfaser hos mikroorganismerna.
33
Referenser
1. Bacterial adhesion to Cells and Tissues. Ofek, I. And Doyle, R.J. Chapman & Hall
1994, ISBN 0-412-03011-X, s 5
2. http://cmr.asm.org/cgi/content/full/15/2/155#Docking:%20Primary%20Bacterial%20
Adhesion, 071215, American society for Microbiology.
3. Ofek, I. And Doyle, R.J. Chapman & Hall, s 84
4. Ofek, I. And Doyle, R.J. Chapman & Hall, s 54-59
5. Handout: Laboration i fermentationsteknik december -06- januari – 07
6. Adhesion of Pseudomonas putida KT2442 Is Mediated by Surface Polymers at the
Nano and Microscale. Environmental Engineering Science (2205), 22(5), 629-641.
Bell, C.H., Arora, B.S. et al.
7. Determination of Cellulose Surface Energy by Imbibition Experiments in Relation to
Bacterial Adhesion. Journal of Dispersion Science and Technology (2004), 25(6), 781787. Pezron, I, Rochex, A. et al
8. Removal of bacteria in laboratory filters: models and experiments. Water research
(1993), 27(6), 955-62. Logan, B.E., Hilbert, T.A. et al.
9. Application of atomic force microscopy to microbial surfaces: from reconstituted cell
surface layers to living cells. Micron (Oxford England: 1993) (2001), 32(2), 153-65.
Dufrene Y.F.
34
Bilaga 1
Beräkningar
Beräkning av totalladdning på massor 5/11
I botten av kurvan drogs en baslinje (se bilagor 2-9). Sedan ritades en linje längs kurvans
högra linje som också går igenom den omslagspunkt som datorn registrerat. Där denna linje
korsar baslinjen, där erhålls den nya omslagspunkten. Sedan räknades skalan om m.h.a. linjal.
En punkt till höger om den nya omslagspunkten där milliliteranatalet är känt, t.ex. 1,000 ml
användes för att dividera med antal cm ut till denna punkt. Denna siffra multiplicerades sedan
med antal cm vid omslagspunkten. Detta gav ny Cond EP (ml). 500 ml drogs sedan ifrån
vilket gav en ny egentlig EP. Detta tal multiplicerades med 100 vilket gav µekv. Den exakta
invägda massan dividerades sedan med föregående siffra för att få µekv/g. Dubbelprov
utfördes. Mer än tio % differans på proven indikerar någon slags felfaktor.
Blekt löv prov 1:
((1,0 / 11,65 * 9,75) - 0,500) * (100 / 0,4674) = 72,0812 µekv/g
Blekt löv prov 2:
((1,0 / 10,2 * 8,7) – 0,500) * (100 / 0,5001) = 70,5741 µekv/g
Medelvärde blekt löv:
72,0812 + 70,5741
= 71,328 µekv/g
2
Blekt barr 1:
((1,0 / 11,65 * 8,9) - 0,500) * (100 / 0,5935) = 44,4732 µekv/g
Blekt barr 2:
((1,0 / 11,65 * 8,6) - 0,500) * (100 / 0,5607) = 42,4821 µekv/g
Medelvärde blekt barr:
44,4732 + 42,4821
= 43,4777 µekv/g
2
Oblekt löv 1:
((1,4 / 11,4 * 9,5) - 0,500) * (100 / 0,4564) = 146,0706 µekv/g
Oblekt löv 2:
((1,4 / 12,7 * 10,7) - 0,500) * (100 / 0,4626) = 146,89311 µekv/g
Medelvärde Oblekt löv:
146,0706 + 146,89311
= 146,4818 µekv/g
2
35
Oblekt barr 1:
((1,2 / 12,2 * 9,5) - 0,500) * (100 / 0,4956) = 87,6566 µekv/g
Oblekt barr 2:
((1,2 / 10,9 * 8,8) – 0,500) * (100 / 0,4969) = 94,3464 µekv/g
Medelvärde Oblekt barr:
87,6566 + 94,3464
= 91,0015 µekv/g
2
Beräkningar lösning A och B för Fosfatbuffrad salin (PBS) 1L
Lösning A: 100ml 0,2M NaH2PO4
NaH2PO4*2H2O=156 g/mol
0,2mol/L*0.100L=0,02mol
0,02 mol*156g/mol=3,12g
Lösning B: 250ml 0,2M Na2HPO4
Na2HPO4*2H2O=178g/mol
0,2 mol/L*0,250L=0,05mol
0,05mol*178g/mol=8,9g
36
Bilaga 2
Titreringskurva blekt löv-massa 1
37
Bilaga 3
Titreringskurva blekt löv-massa 2
38
Bilaga 4
Titreringskurva blekt barr-massa 1
39
Bilaga 5
Titreringskurva blekt barr-massa 2
40
Bilaga 6
Titreringskurva oblekt löv-massa 1
41
Bilaga 7
Titreringskurva oblekt löv-massa 2
42
Bilaga 8
Titreringskurva oblekt barr-massa 1
43
Bilaga 9
Titreringskurva oblekt barr-massa 2
44
