2011-01-13
Blodgruppserologi, immunhematologi
1
Formation av intra cellullära bryggor mellan
cellerna (fria antikropps o antigen
bindningsställen)
1. Aggregation
2. Repulsion
3. Koncentrationen av antigen kontra antikropp
3
Jonstyrka
Minska jonstyrkan, associationen ökar
T.ex. med LISS Low Ion Strength saline.
Om jonstyrkan blir för låg --- ospecifik
adsorption av immunglobuliner (antikroppar)
5
Första steget antikropp binder till antigen
Joninteraktion beror förstås på jonstyrkan
Hydrofoba bindningar, icke polära grupper
undviker vatten och binder till varann.
Värme
ökar bindningsstyrkan
Vätebindningar , exoterma, ökar alltså vid
sänkt temperatur
Van der Waal krafter, ökar ju närmare
antikroppen och antigenet är till varandra
Undanträngning av vatten
2
Temperatur
För en antikropp med temperaturoptimum på
37⁰ minskar bindningshastigheten vid en
lägre temperatur. Åtgärd, Inkubationen
förlängs eller miljön ändras
Vissa antikroppar binder till vid 37⁰ men
dissocierar snabbt. Åtgärd, sänk
temperaturen efter sensibiliseringen.
Eluering av antikroppar, upphettning till 56⁰
dissociationen ökar.
4
pH
Under normala förhållanden är erytrocyterna
negativt laddade (sialinsyra).
pH 7,0-7,5
Antikroppar har en svagt positiv laddning.
Vandrar katodalt i elektriskt fält.
Användning av PBS garanterar att den
använda koksaltlösningen inte är sur. Salthalt
0,9 %. Isoton.
Surt pH leder till ökad dissociation. Detta
förhållande används vid eluering.
6
1
2011-01-13
Antigen densitet
Antalet antigen och antigenets placering i
membranet påverkar agglutinationen
Vid underskott av antikroppar (många
antigen) få eller inga agglutinat
Vid överskott av antikroppar
Prozonefenomen. Alla antigen är blockerade
inga bryggor, inga agglutinat. Späd!
7
8
Första steget
Antikropp binder till antigen
Andra stadiet
Bryggor av antikroppar mellan de
sensibiliserade erytrocyterna, IgM binder i
NaCl
Ig G kräver förstärkt testmiljö (protein +
centrifug ) och/eller en andra antikropp
(AHG). IAT
9
10
Främst
Ig-M.
anti-A och anti-B + enstaka anti-M
Antikroppar som aktiverar komplement ger
hemolys, kan misstolkas som negativ reaktion
Vi använder EDTA som binder kalciumjoner
som krävs för aktivering av
komplementsystemet
Indirekt agglutination med Antiglobulinteknik
eller enzymbehandling av blodkropparna
IgG
11
12
2
2011-01-13
Enzymtekniker svåra att standardisera men bra
för bestämning vid förekomst av flera
antikroppar
Proteaser alla har en bred specificitet för
peptidbindningar
Bromelin från ananas
Ficin från fikon
Papain från papaya
Trypsin, chymotrypsin och neuroaminidas
Neuroaminidas spjälkar gärna bort för mycket
och T-antigenet (normalt gömt i cellmembranet)
blottläggs,
direktagglutineras av en T-antikropp.
Antiglobulinteknik
Enzymbehandling
av blodkropparna
13
14
Antiglobulintester
Beskrevs redan 1908 av Carlo Moreschi ,fast han
inte förstod det. Moreschi's phenomen . Moreshi
märkte att inkubation med tyfoid bakterier och
utspätt get anti-tyfoidserum inte visade någon
agglutination . Men efter tillsats av anti get
serum agglutinerades bakterierna. R. Coombs
och hans kollegor som uppfann/upptäckte AHG
reaktionen i Cambridge 1945, [Coombs et al.,
1945] kungjorde att Moreshis observation var en
tidig applikation av AHG reaktionen
15
16
Indirekt
antiglobulintest påvisa antikroppar
in vitro bundna IAT
Direkt
antiglobulintest påvisa antikroppar
in vivo bundna DAT
17
18
3
2011-01-13
Vad
visar bilden? Ringa in det/de rätta svaren
1p
Positivt Resultatet av en Direkt
antiglobulintest
Negativt resultat av en Direkt
antiglobulintest
Positivt resultat av en Indirekt
antiglobulintest
Negativt resultat av en Indirekt
antiglobulintest
19
20
21
22
Jk
David
Marie
Stefan
AnnaCarin
Rahil
CarlAnton
Sofia
Sabina
Anas
Kim
Henrik
Naz
Sara
Leif
Frida N
Johan
Betty
Åsa
Milan
Salwa
Carolin
Pontus
Frida G
Hind
Rebecka
23
76%
Jka
9%K
A
+
+
B
+
-
D
+
+
+
C
+
+
+
c
+
+
+
E
+
-
e
+
+
+
K
-
+
-
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
hos
europeer
hos
0% hos
a
+
+
+
24
4
2011-01-13
Other blood group incompatibility (RhC,
HDFN också känt som erytroblastosis
fetalis
Rhesus D hemolytisk sjukdom
ABO hemolytisk sjukdom
Anti-Kell hemolytic disease of the
newborn
Rhesus c hemolytic disease of the
newborn Rhesus E hemolytic disease of
the newborn
Rhe, Kid, Duffy, MN, P and others)
Examples of autoimmune hemolysis
WAIHA Warm antibody autoimmune hemolytic anemia
IgG
Idiopathic
SLE
Evans syndrome (antiplatelet antibodies and hemolytic
antibodies)
Cold antibody autoimmune hemolytic anemia IgM
IDIOPATISK
Infektiös mononukleos (Epstein Barr) (anti-i)
Paroxysmal cold hemoglobinuria
Donald-Landsteiner antikropp anti-P som binder till
P-antigenet. Ex Treponema pallidum (syfilis),
haemofilus influenza och mycoplasma pneumonia (
anti-I)
25
26
'Paroxysmal Nocturnal Haemoglobinuria
Decay
accelerating factor (Decay,To break
down into component parts)
Komplement decay-accelerating factor
CD55
Ökar nedbrytning av C3konvertaset.C3bBb
blockerar bildning av MAC.
Cromer blodgrupp
DAF fungerar som receptor för Echovirus
och coxsackie B viruses
27
28
Vid
testning med gelteknik används kolonner
med AHG i Matrixet vilket eliminerar
behovet av tvättfas.
Metoden kräver inte kontroll av negativa
resultat
Provlösningen och icke bundet immunglobulin
blir kvar i reaktionskammaren
29
30
5
2011-01-13
Förstärkningsteknik
för svaga antikroppar
PEG (AHG måste vara anti-IgG
Uppvärmning
Eter
Surgörning
31
32
För
bestämning av feto-maternell blödning
(för att bestämma mängden anti-D, Rhprofylax)
Kvantifiering av anti-D hos immuniserad
moder
33
Genotypning
av foster
patienter
Serologiska problem
Screening av blodgivare
Standardisering av celler för testpaneler
(dos)
DAT positiva celler
Transfunderade
35
34
För
att förutsäga risken för HDFN. Vanligast
vid RhD men även Rhc ock K
DNA från amniocyter, celler från korionvilli,
fetalt DNA ur maternellt blodprov
36
6
2011-01-13
För
att kunna erbjuda korrekt matchat blod
till patienter med kroniskt transfusionsbehov
(dvs patienter med hemoglobinopatier)
För
att bestämma RhDvarianter
att bestämma AB0grupp vid avvikande
serologiska testresultat
För att lösa serologiska oklarheter
Tex erytrocytgruppering A men serum
gruppering visar anti-A
För
37
För
att finna givare med speciella blodtyper
där tillförlitliga testsera saknas eller är
mycket sällsynta T.ex. Dombrock.
38
För
att bestämma zygotin hos celler för
användning som testerytrocyter tex
normaltypade Fy(a+b-) kan vara FyaFya
FyaFy eller FyaFyx
39
Prover
som inte kan typas serologiskt pga att
erytrocyterna är sensibiliserade (coatade,
mantlade) med IgG in vivo
41
40
Fostererytrocyter
som bundit IgG1 eller IgG3
ak bryts ned och frisätter hemoglobin
Bilrubin, kan mätas i fostervätskan efter en
amniocentes. Bilrubin
kernikterus
Mer exakta data genom att mäta B-Hb och BEVF direkt hos fostret EVF bör vara 0,35-0,40
Dopplermätning av blodflöde (ökad
hjärtminutvolym vid anemi)
42
7
2011-01-13
43
44
45
46
Blodkomponenter
Blodgruppering AB0
och Rh x 2 med två olika
reagens
Ak-undersökning på serum från modern
DAT på barnets blodkroppar
Finns antikropp skall förprov göras med
givarblodet och serum från modern
Ge 0positivt Rh negativt blod.
Om barnet är DAT positivt måste orsaken
utredas genom jfr undersökningar på mor och
barn
Leukocytfiltrerat och bestrålat och lagrat
mindre än 5 dagar
47
48
8
2011-01-13
Kvantifiering
av ak
monolayer assay MMA
Chemilumiscenstest CLT
Antibody Dependent cell-mediated
Cytotoxity ADCC
Märkning av givarblodet med Cr51 och ge 0,51,0 mL och mäta överlevnaden,
utgångsvärde, efter 10 och 60 minuter (Görs
sällan)
Monocyt
Testet
mäter den antikroppsmedierade
frisättningen av C351 från testblodkroppar
som hemolyserats med lymfocyter eller
monocyter som effektorceller
49
Mäter
effektorcellernas adhesion och
fagocytos av de IgGklädda cellerna i närvaro
av luminol,resultatet uttrycks i % av ett
monocytsvar på en positiv kontroll. Värden
över 30% indikerar en moderat till svår
fosterpåverkan
51
50
Anti-K
i låg titer kan ge en svår HDFN
genom att bryta ned de tidiga förstadierna
till erytrocyter
Liten mängd hemoglobin och bilrubin i
fostervattnet
Alloimmunisering med K-antigen svarar för ca
10 % av alla allvarligt påverkade foster
52
Monocyter
separeras frå n patienten och
blandas med antikroppsklädda erytrocyter
53
54
9
2011-01-13
55
Patienter
som kommer att kräva
transfusioner under lång tid bör
blodgrupperas med avseende på fenotyp för
alla de viktigaste blodgruppssystemen.
Använd molekylärbiologisk teknik.
Tex Thalassemier, HbS,
56
THE BRISTOL INSTITUTE FOR TRANSFUSION SCIENCES and THE
INTERNATIONAL BLOOD GROUP REFERENCE LABORATORY
Welcome to the International Blood Group Reference Laboratory
and the Bristol Institute for Transfusion Sciences. Sited in Bristol,
England, IBGRL and BITS are National Blood Service laboratories.
The IBGRL was established in 1946 to provide Reference Services
related to blood transfusion. In 1952, the IBGRL was designated a
collaborating centre for the World Health Organisation. One of
IBGRL’s functions is to maintain a database of donors with rare
blood types. Authorized laboratories can interrogate the
International Rare Donor Panel directly via this web site. The
IBGRL has a distinguished record of research in blood transfusion
science. Some of this research has led to the generation of a
range of monoclonal antibodies which are available to
researchers around the world as IBGRL Research Products.
58
57
Sensivitet
är antalet erhållna positiva
resultat jämfört med antalet sant positiva
resultat
Specificitet är totala antalet negativa
resultat jämfört med antalet sant negativa
resultat
Metod jämförs med metod som fått epitetet
”Guldstandard”
59
prediktivt värde (npv) är ett
begrepp inom statistiken som definieras som
andelen av de som testas negativa för en
sjukdom som verkligen är negativa. Det
negativa prediktiva värdet beror på
prevalensen i populationen, en hög prevalens
ger ett lågt npv.
Negativt
60
10
2011-01-13
prediktivt värde (ppv) är ett
begrepp inom statistiken som definieras som
andelen av dem som testas positiva för en
sjukdom som verkligen är positiva. Det
positiva prediktiva värdet beror på
prevalensen
i populationen, en hög prevalens ger högt
ppv.
Positivt
Bredare
antigensprofil som kan varieras beroende
på lokala skillnader, tex Dia och Mur
Som är sällsynt bland europeer och afrikaner men
har en frekvens på 5 % hos kineser och japaner och
upp emot hos 54 % hos Brasiliens Kainganges
indianer. Mur antigenet finns hos mellan 5-10
procent i Kina.
Anti Dia förekommer hos 3,5 % av alla
multitransplanterade i Brasilien och kan orsaka
svår HDFN (komplementaktiverande)
61
62
Nej
Halveringstid
för tillfört anti-D är 21-26 dagar
Genom
att utvälja testceller som är negativa
för all möjliga antigen utom ett
63
Reagerar
bara med de erytrocyter som har
antigener med mer än en specificitet kodade
av samma gen Tex anti-f som reagerar med
celler som uttrycker c och e antigener på
samma proteinkedja.
Reagerar alltså med DCe/dce men inte
DCe/DCe eller DCe/DcE
65
64
Tex
anti-K + anti-Jka
+ anti-S
K
negativ incidens 0.91, Jka
negativ incidens 0.23, SW
negativ incidens 0,48
0,91x0,23x 0,48 = 0,1 eller 1 på
10
66
11
2011-01-13
Patientens
totala med transfusioner under
mindre än 24 timmareller en akut ersättning
av halva den uppskattade blodvolymen per
timme blodvolym har ersatts
Om
man har eller haft irreguljära
erytrocytantikroppar av klinisk betydelse
När metoden för ak-screening inte uppfyller
krav på känslighet
Patient som fått ABO inkompatibel
organtransplantation inom tre månader
Foster eller nyfödda som transfunderats på
grund av alloimmun sjukdom
Speciell uppmärksamhet för patienter
tillhörande populationer med antigen som
markant skiljer sig från befolkningen i
allmänhet
67
Feber
> 38C
Il 6 från T-celler o
mastceller till hypothalamus
Frysningar
Ångest, ländsmärtor
Blodtrycksfall (anafylatoxiner, histamin)
Bakteriell kontamination eller feltransfusion
68
Klåda
Urtikaria
Blodtrycksfall
Feber
Anafylaktisk
reaktion med chock
69
Dyspne
(andnöd)
70
Transfusionsrelaterad
akut lungskada
cellmembran, granulainnehåll från
leukocyter
Blodtrycksstegring
Trasiga
71
72
12
2011-01-13
Avbryt
transfusionen
fri ven väg
Kontrollera vitalfunktioner medvetande,
andning, blodtryck
Rätt blodenhet?
Meddela medicinskt ansvarig läkare
Meddela blodcentral, behov av akut
provtagning?
Dialys, antibiotika, venesectio, aferes.
Håll
73
74
13
