Fakulteten för hälso- och livsvetenskap
Examensarbete
Jämförelse av resultat mellan manuell gelkortsanalys och automatisk
immunohematologisk gelkortsanalys vid utförande av
blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test)
Veronica Nilsson
Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Nivå: Grundnivå
Nr: 2013:BL12
Jämförelse av resultat mellan manuell gelkortsanalys och automatisk
immunohematologisk gelkortsanalys vid utförande av
blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test)
Veronica Nilsson
Examensarbete, biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng
Filosofie kandidatexamen
Handledare:
Ingvar Rydén
MD, PhD
Länsenheten för Klinisk kemi
Kalmar länssjukhus
SE – 391 85 Kalmar
Roche Diagnostics
Karlsbodavägen 30, Box 147
161 21 Bromma
Susanne Widell
Dr Med Vet.
Examinator:
Maria Mattsson
Dr Med Vet.
Institutionen för kemi och
biomedicin
Linnéuniversitetet
SE – 391 82 Kalmar
Institutionen för kemi och
biomedicin
Linnéuniversitetet
SE – 391 82 Kalmar
Examensarbetet ingår i Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng
SAMMANFATTNING
Oförenlighet mellan givare och mottagare vid blodtransfusion kan leda till fatala
hemolytiska transfusionsreaktioner (HTR), njurskada och död samt immunisering av
mottagaren. Antigener på erytrocyters yta inom ABO-systemet, samt reguljära naturliga
antikroppar mot dessa i patientens plasma är viktigast att ta hänsyn till. En individ har alltid
en antikropp av IgM i sin plasma mot det antigen inom ABO systemet som denne saknar.
Irreguljära antikroppar, förvärvade genom transfusion eller graviditet och verksamma i
kroppstemperatur orsakar också HTR vid oförenlighet. Vid blodtransfusion utförs därför
alltid en blodgruppskontroll av patientens ABO antigen och antigen D inom Rh- systemet
samtidigt med en antikroppsscreening av patientens plasma (BAS-test) med manuell
gelkortsteknik. Immunohematologi 1000 (IH-1000) är ett helautomatiskt datoriserat system
som utför denna test automatiskt och överför resultaten direkt in i patientens journal. För att
undersöka om dessa metoder ger jämförbara resultat utfördes BAS-test på venprov från
sammanlagt 118 blodgivare och patienter (50 män och 68 kvinnor), 16-99 år, med dels
manuell gelkortsteknik och dels med IH-1000. Resultaten visade en god överensstämmelse
(100%) mellan de båda teknikerna avseende både ABO tillhörighet på erytrocyter och fynd
av irreguljära antikroppar i plasma. De patienter som erhöll positiv antikroppsscreen med
gelteknik erhöll även en positiv antikroppscreen med erytrocyter från samma testgivare vid
analys i IH-1000. Ingen signifikant skillnad (chi2-test) sågs i antikroppsreaktionernas styrka
mellan de båda metoderna. BAS-test kan således utföras med IH-1000 istället för manuellt i
gelkort.
ABSTRACT
Incompatibility between donors and recipients can cause fatal hemolytic transfusion reactions
(HTR), kidney damage and death and immunization of the recipient. Antigens on the surface
of erythrocytes in the ABO blood group system and regular natural antibodies against these in
the patient’s plasma must be considered. An individual always has a corresponding antibody
of IgM in their plasma. Irregular antibodies acquired by transfusion or pregnancy and active
in body temperature also cause the HTR incompatibility. Before blood transfusion a test is
performed to investigate the patient’s ABO antigen and the antigen Rh D, and an antibody
screen, a compability test called BAS-test. The test is manual performed using a gel card
technique. Immunohematology 1000 (IH-1000) is a fully automatic computerized system that
automatically performs the test and passes the results directly to the patient file. To investigate
whether these methods provide comparable results blood sample from the vein from a total of
118 blood donors and patients (50 men and 68 women) in the ages of 16-99 years were
collected. Both manual gel card technique and analysis with the IH-1000 were performed. The
results showed a good agreement (100%) between the two techniques for both affiliation of
ABO of erythrocytes and findings of irregular antibodies in plasma. The patients who
received a positive antibody screen with the manual technique also received a positive
antibody screen with erythrocytes from same test donor in the analysis of IH-1000. Between
the two methods no clinically significant difference was observed in the antibody response in
the strength of the reactions. BAS-test can be performed with IH-1000 instead of manually
performed technique.
Innehållsförteckning
INTRODUKTION ..................................................................................................................... 1
Blodgruppsantigen .................................................................................................................. 1
Rh-systemet ............................................................................................................................ 2
Kell-systemet .......................................................................................................................... 2
Blodgruppsantikroppar ........................................................................................................... 3
Förenlighetsprövning .............................................................................................................. 3
Blodgruppsserologiska tekniker ............................................................................................. 3
Testerytrocyter och antigram .................................................................................................. 4
Antihumanglubulintekniken (AHG; Coomb’s test) ............................................................... 4
Direkt antiglobulintest (DAT) ............................................................................................. 4
Indirekt antiglobulintest (IAT; Coomb’s indirekta test) ..................................................... 4
Blodgruppering och antikroppsscreening med gelkort ........................................................... 5
Manuell BAS/BKS-test .......................................................................................................... 6
Automatisk gelkortanalys med Immunohematologi 1000 (IH-1000) .................................... 6
Instrumentöversikt ............................................................................................................... 6
IH-Com Client ..................................................................................................................... 7
ProSang............................................................................................................................... 7
IH-Com Communicator ...................................................................................................... 7
Syfte ........................................................................................................................................... 7
MATERIAL OCH METOD....................................................................................................... 7
Provmaterial............................................................................................................................ 7
Manuellt BAS/BKS-test med gelkort ..................................................................................... 7
Reagens och gelkort ............................................................................................................ 7
Förberedelser ...................................................................................................................... 8
Kontroll ............................................................................................................................... 8
Utförande ............................................................................................................................ 8
IH-1000 ................................................................................................................................... 8
Reagens och gelkort ............................................................................................................ 8
Inför analys ......................................................................................................................... 8
Underhåll ............................................................................................................................ 9
Kvalitetssäkring ...................................................................................................................... 9
Testprocess .......................................................................................................................... 9
Statistisk analys .................................................................................................................... 10
Etik........................................................................................................................................ 10
RESULTAT ............................................................................................................................. 10
DISKUSSION .......................................................................................................................... 12
Slutsats .............................................................................................................................. 13
TACKORD............................................................................................................................... 14
REFERENSER ......................................................................................................................... 15
BILAGA 1……………………………………………………………………………………….
BILAGA 2……………………………………………………………………………………….
INTRODUKTION
Ett blodgruppsantigen definieras som en kemisk substans på erytrocytens yta som kan kännas
igen av en specifik alloantikropp. Strukturer med liknande substans och sammansättning kan
vidare grupperas i olika blodgruppssystem. Enligt The International Society of Blood
Transfusion (ISBT) finns 285 godkända blodgruppsantigen. Av dessa blodgruppsantigen är
245 indelade i 29 blodgruppsystem där ABO-systemet anses vara det viktigaste inom
transfusionsmedicin. Blodgruppssystemen bygger alla på skillnader i antigenstrukturer på
erytrocyters yta. Denna upptäckt gjordes år 1901 då Karl Landsteiner uppmärksammade
hemagglutinationsreaktioner genom att blanda olika kombinationer av erytrocyter och serum
från olika individer. Det kliniskt mest relevanta blodgruppssystemet, ABO, hade identifierats
och blodtransfusion kunde utföras med en lägre risk för hemolytiska transfusionsreaktioner
(HTR) och allvarliga komplikationer (1-4).
Blodgruppsantigen
ABO-systemet utgörs av antigen A och B som ingår i tre allelsystem och är produkter av Arespektive B-allelen på ABO-genen. Allel O producerar ej något A- eller B-antigen och är
recessiv till A och B. Systemet är uppdelat efter de fyra fenotyperna A, B, AB och O som i sin
tur utgörs av olika genotyper (tabell I). Fenotyp A indelas i A1 och A2 med flera. Erytrocyter
av typ A1 uttrycker A-antigenet starkare än typ A2 (1-2).
Tabell I. ABO-grupp och genotyp.
ABO-grupp
O
A (A1 eller A2)
B
AB (A1B eller A2B)
Genotyp
O/O
A/A eller A/O
B/B eller B/O
A/B
H-substans, som uttrycks av H-antigenet är en precursorsubstans (paraglobosid) till antigen A
och B. Precursorsubstansen utgörs av N-acetylgalaktosamin, D-galaktos, N-acetylglukosamin
och L-fukos som är sammanlänkade (figur 1). Det socker (L-fukos) som innehar en terminal
position i precursorkedjan kallas immunodominant och ger ”H” dess blodgruppsspecificitet.
Strukturerna finns på erytrocytens membran (1-4).
Figur 1. H-antigenet utgör precursorstrukturen för A- och B-antigenet. (Veronica Nilsson,
2012.)
1
Generna för ABH-antigenen finns vid tre olika loci (ABO, Hh och Se/se) vilka producerar det
specifika glykosyltransferas som adderar ett socker till precursorsubstansen för formation av
olika antigen. Gener för ABO-systemet finns på kromosom 9 och gener för Hh-systemet finns
på kromosom 19 (1-4).
Antigen H uttrycks starkare på erytrocyter av typ O med anledning av att H-substansen ej
omvandlas. Erytrocyter av typ A2 har mindre andel av omvandlad H-substans än erytrocyter
av typ A1 och B på grund av ett mindre effektivt A-transferas (1-2).
Inom ABO-systemet finns enligt Landsteiners regel alltid en motsvarande naturlig antikropp
reguljärt i en persons plasma mot det antigen denna saknar. En individ som saknar A- eller Bantigen på sina erytrocyter har således antikroppar mot både A- (anti-A) och B-antigen (antiB) reguljärt i plasma och naturligt förekommande då de inte uppstått på grund av någon känd
stimulering av immunförsvaret. Vid inkompabilitet i ABO-systemet mellan mottagare och
givare kan en fatal hemolytisk transfusionsreaktion uppstå med allvarliga komplikationer,
njurskada och död (1-2).
Rh-systemet
Rh-systemet (Rhesus) vilket innehåller 50 olika definierade blodgruppsantigen är det näst
viktigaste blodgruppssystemet. Upptäckter som kom att ligga till grund för systemet gjordes
först i slutet av 1930-talet och inleddes med misstanke om antikroppar hos en obstetrisk
patient. En hemolytisk transfusionsreaktion var då iakttagen av Levine och Stetson.
Landsteiner och Wiener kunde sedan ett år efter iakttagelsen rapportera om antikroppar hos
kanin och marsvin då de använde erytrocyter från rhesusapan vid transfusion (1-5).
De vanligaste antigen inom systemet är D, C, c, E och e. Antigen D har störst klinisk
betydelse då det är starkt immunogent. Bärare av D-antigenet på erytrocyterna benämns RhD
positiva (RhD+) medan de som saknar antigenet benämns som RhD negativa (RhD-). Det
finns även fall då antigenet är försvagat uttryckt (Weak D) (1-2).
Risken att bli immuniserad och bilda irreguljära antikroppar mot antigen D är hög vid
transfusion och graviditet och kan vara en orsak till hemolytiska transfusionsreaktioner (HTR)
och hemolytisk sjukdom hos foster och nyfödda (HDFN). HDFN kan uppkomma då
antikroppar mot antigen D (IgG) från en RhD negativ immuniserad moder passerar över
placentabarriären till ett RhD positivt foster (1-5).
Kell-systemet
Utanför ABO- och Rh-systemet är irreguljära antikroppar mot antigen K inom Kellsystemet
de vanligaste. De är ofta av IgG-typ och kan reagera vid 37°C vilket leder till HDFN,
autoimmun hemolytisk anemi (AIHA) och akut transfusionsreaktion. Anti-K kan dock ej
bilda komplement. Totalt förekommer 25 olika antigen inom Kell-systemet vilka kodas av
KEL-genen lokaliserad på kromosom 7, men antigen K och k (cellano) är de viktigaste då de
är av stor klinisk relevans (1-3).
2
Blodgruppsantikroppar
Vid exponering av ett okänt antigen på en erytrocyts yta stimuleras immunförsvaret till en
produktion av antikroppar. Olika antigen har olika stark immunogenicitet, det vill säga olika
förmåga att starta ett immunförsvar så antikroppar bildas. Naturliga antikroppar uppstår
spontant utan tidigare känd exponering och tillhör immunglobulinklassen IgM. Naturliga IgM
antikroppar förekommer både reguljärt som exempel i ABO-systemet eller irreguljärt i en
patients plasma. De har även förmåga att aktivera komplement men kan inte passera över
placenta på grund av sin storlek (1-2).
Irreguljära antikroppar av typ IgG är förvärvade och har uppstått då en persons immunförsvar
kommer i kontakt med inkompatibelt erytrocytantigen, på grund av blodtransfusion eller vid
graviditet. Dessa är kliniskt viktiga då de är verksamma i kroppstemperatur och kan passera
placenta. Om ett fosters erytrocyter har en annan genuppsättning än moderns erytrocyter
bildar moderns immunförsvar antikroppar i plasma mot något antigen som fostrets erytrocyter
bär på. Andra blodgruppssystem där antigen kan ha stark immunogenicitet förutom inom Rhsystemet är antigen i blodgruppssystemen Kell och Duffy. Irreguljära antikroppar av typ IgG
mot antigen A och B kan dock också uppstå om ett fosters antigen inom ABO-systemet är
annorlunda än moderns. Barn mindre än 6 månader utgör ett undantag från regeln avseende
både naturliga och irreguljära antikroppar i plasma då immunförsvaret inte ännu är fullt
utvecklat (1-3, 5).
Förenlighetsprövning
Transfusion av oförenliga ABO erytrocyter resulterar i kraftig HTR som kan leda till
intravasal koagulation, njurskada och död. Oförenlighet mellan mottagare och givare
avseende andra blodgruppsantigen leder till aktivering av immunförsvaret, immunisering och
HTR. Förenlighetsprövning genom blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test),
är därför av stor betydelse inför varje transfusion av erytrocytinnehållande blodkomponent (12, 8).
Blodgruppsserologiska tekniker
Analystekniker inom blodgruppsserologi syftar till att påvisa erytrocytantigen inom olika
blodgruppssystem samt specifika alloantikroppar riktade mot något/några av dessa antigen i
en patients plasma. För påvisande av erytrocytantigen används kommersiellt tillverkade
antiserum med en känd specifik monoklonal eller polyklonal antikropp med känd styrka. För
att påvisa eventuella alloantikroppar i en patients plasma används blodgivarerytrocyter med
en känd antigenuppsättning för olika kliniskt viktiga blodgruppssystem så kallade
testerytrocyter (1-2).
När ett blodgruppsantigen reagerar med en antikropp uppstår en synlig antigen/antikroppreaktion, så kallad hemagglutination (agglutination) som kan variera olika i styrka och
graderas från 1-4 (se tabell II). Denna reaktionsstyrka är beroende av förhållandet i
koncentration mellan antigen och antikropp, temperatur och optimal miljö samt erytrocyters
negativa laddning. Antikroppar av typ IgM (som till exempel de reguljära naturliga i ABOsystemet) är stora pentamerer med flera antigenbindande platser och kan därför bilda en
synlig agglutination (binda minst tre olika erytrocyter med samma antigen) direkt i isoton
koksaltmiljö. Optimal temperatur är ≈ 20°C eller lägre (1-2).
3
Vid agglutination av irreguljära antikroppar av IgG-typ, som är mindre molekyler, krävs en
förstärkt reaktionsmiljö för att binda ihop erytrocyter med IgG-antikroppar på sin yta till en
synlig agglutination. Detta kan till exempel ske med hjälp av sekundära antikroppar mot
humant globulin (AHG) direkt eller indirekt men också genom att sänka erytrocyternas
negativa laddning med hjälp av enzymer (papain) eller högproteinmiljö med exempelvis
albumin. Kroppstemperatur är optimalt för att en antikropp av typ IgG ska reagera med sitt
antigen (1-2).
Testerytrocyter och antigram
Testerytrocyter för antikroppsscreening och antikroppsidentifiering kommer från kända
blodgivare och skall alla vara av blodgrupp O. De är utvalda för att presentera de flesta
antigen mot vilka eventuella irreguljära antikroppar av klinisk betydelse (reagerar i
kroppstemperatur) kan binda till. De utgör tillsammans en panel där förekomst eller avsaknad
av ett visst antigen kan avläsas manuellt i ett så kallat antigram. Givarens uppsättning av
antigen är homozygot eller heterozygot. Bestämning av antigen (fenotypning) på
testerytrocyter ska vara utförd vid två olika tillfällen på olika prov från samma givare med
lika reaktionsresultat. För antikroppsscreening används testerytrocyter från 2-3 stycken olika
givare och för identifiering av en specifik antikropp används testerytrocyter från 14 stycken
olika givare. Testerytrocyterna utgör en standardpanel vilka numreras 1-14. Panelen benämns
K1-14 där K står för Kalmar. I Kalmar ingår K12, K13 och K14 som testpanel i
antikroppsscreening. För att erhålla en optimal rekationsmiljö är cellerna uppslammade i
isoton lösning (erytrocytsuspension) i en bestämd erytrocytkoncentration (%) vald för den
specifika analystekniken (8).
Antihumanglubulintekniken (AHG; Coomb’s test)
För att påvisa antikroppar av typ IgG i en patients plasma eller bundna på en patients
erytrocyter (sensibiliserade) används främst AHG-tekniken. Antikroppar mot humant
immunglobulin (AHG) får indirekt reagera med immunglobuliner i patientens plasma eller
direkt bundna till cellernas antigen. Komplementbildning av IgG kräver att två molekyler av
IgG binder till antigenet i viss närhet av varandra (1-2, 5).
Direkt antiglobulintest (DAT)
DAT (även kallat Coomb’s direkta test) utförs för att upptäcka irreguljära antikroppar bundna
till patients erytrocytantigen. Patients erytrocyter tillsätts AHG efter att annat löst protein
tvättats bort med isoton koksalt. Om en antikropp eller ett komplementprotein är bundet till
erytrocyternas yta ses en synlig agglutinationsreaktion (1-2, 5).
Indirekt antiglobulintest (IAT; Coomb’s indirekta test)
För att påvisa irreguljära antikroppar av typ IgG i patientens plasma används vanligtvis
indirekt antihumanglubulinteknik (IAT). Ett antal testerytrocyter från blodgivare med känd
antigenuppsättning inkuberas i 37°C med patientplasma. Eventuell irreguljär antikropp binder
efter optimal tid till sitt antigen. Testerytrocyterna renas från annat löst icke bundet humant
protein och tillsätts AHG som binder till humana antikroppar på erytrocyterna. Centrifugering
på optimalt varvtal underlättar agglutination och därmed den synliga agglutinationsreaktionen
Eventuell agglutinationsreaktion ska avläsas manuellt och graderas enligt riktlinjer ur
Handbok för Blodcentraler (tabell II) (1-2, 6).
4
En synlig agglutination sker således i både DAT- och IAT-tekniken då de AHG-antikroppar
som är bundna till eventuella IgG-molekyler på erytrocyten även binder IgG på en närbelägen
erytrocyt. Båda teknikerna kan utföras i rör eller gelkort. Agglutinationen kan således ske med
hjälp av en förstärkt reaktionsmiljö (1-2, 6).
Tabell II. Gradering av reaktionen mellan antigen och antikroppar.
Reaktion
Förklaring
4+
Ett stort agglutinat med en klar bakgrund och endast få fria celler.
3+
Fler fasta agglutinat av medelstor storlek med en klar bakgrund och endast få
fria celler.
2+
Rikligt av medelstora lösa agglutinat.
1+
Makroskopiskt, nästan ej synliga agglutinat.
Då inga agglutinat syns vid avläsning betecknas detta; - (negativt). Vid manuellt utförande
kan även graderingarna (4+), (3+), (2+) och (1+) användas. Graderingen (4+) förklaras som
något svagare än 4+ men starkare än 3+. Då en kombination av agglutinat och utebliven
reaktion förekommer benämns detta som blandbild (6).
Blodgruppering och antikroppsscreening med gelkort
Immunhematologiska tester med gelteknik introducerades år 1990 av Lapierre et al. då kort
bestående av mikrobrunnar innehållande Sephadex dextrangel i storlekarna G100, G200 eller
S2000 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) togs i bruk. Vid utförandet av gelteknik
överförs erytrocyter och antiserum till gelkortets mikrobrunnar. Centrifugering av gelkorten
gör det möjligt för erytrocyterna att tränga ner i gelen samt påskyndar dess vandring. Om
motsvarande antigen finns på erytrocyternas yta sker agglutination. Stora agglutinat blir fast
högst upp i gelen medan mindre agglutinat kan silas och tränga ner i gelen (1-2, 5-6).
Vid gelteknik innehållande AHG sensibiliseras erytrocyterna då okänd plasma inkuberas i
värme med testerytrocyter om en blodgruppsspecifik antikropp är riktad mot antigenet på
erytrocyterna. Agglutination sker vid centrifugering då de sensibiliserade erytrocyterna
kommer i kontakt med AHG. Figur 2 visar reaktionen mellan antigen och antikroppar i
gelkortets mikrobrunnar och används tillsammans med förklaringen i tabell II (1-2, 5-6).
Figur 2. Reaktion mellan antigen och antikropp visas med agglutinationsgradering (Veronica
Nilsson, 2012). Se tabell II för förklaring.
5
Manuell BAS/BKS-test
Vid BAS-test utförs kontroll av patients ABO- och Rh D-grupp (B) via antigenbestämning av
erytrocyter. För att undersöka om en patient bildat irreguljära antikroppar av typ IgG i plasma
utförs även en antikroppsscreening (AS) i samband med blodgruppskontrollen. Resultatet
avseende patientens ABO- och Rh D-grupp måste stämma mot tidigare genomförd fullständig
blodgruppering där en antigenbestämning av ABO-antigen inklusive RhD-gruppering samt
bestämning av patientens reguljära ABO-antikroppar i plasma har utförts. Är det känt att
patient har irreguljära antikroppar benämns testen istället för BKS-test men utförs på samma
sätt (1-2,7).
Vid testen används gelkort ”Type and Screen” (DiaMed, Cressier, Schweiz) som består av
mikrobrunnar med monoklonala IgM-antikroppar mot antigenerna A (anti-A), B (anti-B) och
RhD (anti-D) samt tre mikrobrunnar med polyspecifikt antihumanglobulin (AHG) (kanin antiIgG och monoklonalt anti-C3d (antikomplement)) i gelblandning. Mikrobrunnarna innehåller
gel med antikroppar buffrade i saltlösning med bovint serum. Kortet reagerar inte med DVIvarianter som är en svagare variant av D-antigenet. För blodgruppskontroll överförs
patienterytrocyter till mikrobrunnar med anti-A, anti-B och anti-D. Screeningen görs mot
speciellt utvalda testerytrocyter vilka blandas med patientplasma.
Avläsning utförs manuellt mot ljusbord eller liknande och bedömning av antigenantikroppsreaktionens styrka görs för att sedan bokföra resultatet. Negativ BAS-test innebär
att erytrocytenhet kan godkännas för utlämning till patient. Positiv BAS-test innebär fynd av
kliniskt betydelsefulla erytrocytantikroppar av okänd identitet och medför en vidare
antikroppsutredning för att påvisa antikroppsspecifiteten. För att säkerställa ABO
förenligheten utförs slutligen en datoriserad utlämningskontroll för att se om patienten har
samma blodgrupp vid blodgruppering och förenlighetsundersökningen som tidigare (1-2, 4,
8).
Automatisk gelkortanalys med Immunohematologi 1000 (IH-1000)
Immunohematologi 1000 (IH-1000) är ett helautomatiskt system för gelkorten ID-Cards från
BioRad. Instrumentent kan utföra bestämning av ABO-blodgrupper, omvänd testning
(plasmagruppering), fenotypning, Rh-undergrupper, antikroppsscreening och identifiering,
bestämning av enskilda antigener samt utföra DAT och mottagar-givartest. Instrumentet har
kapacitet för 180 prover, 240 gelkort och 28 olika reagens. Instrumentets viktigaste funktioner
är beredning av provcellssuspension, distribution av provcellssuspension, provplasma och
testceller till ID-Cards, inkubering, centrifugering, ID-Cards-avläsning samt tolkning av
reaktioner i enstaka mikrobrunnar. Programvaran IH-1000 ger aktuell information om
pågående tester samt ger en överblick av tillgängliga resurser (reagens, diluent 2, lösningar).
Vid fel i instrumentet visas felmeddelanden på pekskärmen (figur 3a) för att kunna åtgärda
felet. IH-1000 används mot programvaran IH-Com Client (9).
Instrumentöversikt
IH-1000 utgörs bland annat av en huvuddator och en automatiserad dator. Till instrumentet
finns en pekskärm med tillhörande tangentbord för manövrering i de olika programvarorna
samt en streckkodläsare bland annat för manuell registrering av prover (figur 3a). För att
introducera prover och reagens i instrumentet finns ett speciellt laddningsområde för
inmatning av rack. Reagensrack är konstruerat för att kunna genomföra omblandning av
6
reagens. Gelkort inför analys förvaras i förvaringslåda för ID-Cards och kasseras efter
avläsning i avfallsbehållare för ID-Cards. Även behållare för tvättlösning, systemvätska och
flytande avfall finns tillgänglig. Vid analys av prov utförs arbetet i pipetteringsområdet där
transportarmen förflyttar gelkort mellan håltagningsmodul, pipetteringsområde för gelkort,
inkubator och instrumentets tre möjliga centrifuger (figur 3b). Instrumenten har två olika
nålar, höger och vänster, som utför all dispensering av diluent, provmaterial och reagens på
höger respektive vänster sida. Nålarna sköljs i tvättstationen för att undvika kontaminering
och kunna kalibreras i lokaliseringsmodulen (9).
IH-Com Client
IH-Com client är den programvara som används för att kontrollera instrumentet. Med hjälp av
programvaran är det möjligt att spåra provtagare och läsare, hantera patientdata samt test- och
arbetslistan (9).
ProSang
Prosang är laboratoriets laboratorieinformationssystem. Programvaran (databas) används av
blodcentraler för lagring av resultat från utförda serologiska tester inför eventuella
transfusioner. Till exempel är information om patienters blodgrupp samt närvaro eller
frånvaro av antikropp angiven i databasen (10).
IH-Com Communicator
För kommunikation mellan IH-1000 och laboratoriets laboratorieinformationssystemet,
ProSang, används IH-Com Communicator. Efter utförd validering är det möjligt för godkända
resultat att direkt överföras till ProSang (9).
Syfte
Syftet med denna studie var att göra en jämförelse mellan manuell gelteknik och automatisk
gelkortsanalys med IH-1000 vid utförande av BAS-test inför blodtransfusion. Ger de båda
metoderna överensstämmande resultat?
MATERIAL OCH METOD
Provmaterial
Venösa blodprover togs i rör innehållande etylendiamintetraättiksyra (EDTA) på 104 stycken
slumpvis utvalda blodgivare samt 14 patienter i åldrarna 16-99 år (50 män och 68 kvinnor).
Totalt analyserades 118 BAS-tester.
Manuellt BAS/BKS-test med gelkort
Reagens och gelkort
En 0.8% erytrocytsuspension bereddes av testerytrocyter K12, K13 och K14 med ID-CellStab
(2 %, DiaMed, Crissier, Schweiz). För genomförandet BAS/BKS-test användes ID-Gelkort
”DiaClon Type and Screen”. Gelkortets brunnar innehöll gelsuspension med monoklonala
7
antikroppar mot antigenerna -A, -B och -DVI-, anti-IgG (polyklonala antikroppar mot IgG
från kanin) och anti-C3d (monoklonala antikroppar) (DiaMed, Crissier, Schweiz).
Förberedelser
Blodprover var förvarade i cirka 2-8°C och analyserades senast 3 dygn efter
provtagningstillfället för att förhindra försvagning av antikropp. Inför analys var dock
blodprov och samtliga reagens rumstempererade (cirka 20°C) för att undvika interferens i
form av pipetteringfel. Gelkort kontrollerades med avseende på gelens utseende. Gelen bör
vara intakt med ett vätskeskikt överst, luftbubblor får ej förekomma i gel och droppar får ej
förekomma på folien.
Kontroll
För kontroll av antigenernas hållbarhet på testerytrocyterna överfördes 50 µl av
testerytrocyter K12 till mikrobrunn innehållande anti-IgG och anti-C3d. För att utföra kontroll
mot Duffyantigenet utfördes då 25 µl anti-Fya överfördes till samma inkubationsbrunn.
Gelkort inkuberades i 37°C under 15 minuter och centrifugerades vid 2000 g under 10
minuter innan avläsning.
Utförande
Blodprov i EDTA-rör centrifugerades vid 2000 g under 5 minuter för att erhålla plasma och
packade erytrocyter. Till inkubationsbrunnar märkta ”Anti-IgG+C3d” överfördes 50 µl 0,8 %
av testerytrocyter K12, K13 och K14 i respektive brunn. Till inkubationsbrunnar med
testerytrocyter tillsattes 25 µl patientplasma. Mellan gel och testerytrocyter och plasma syntes
en luftspalt. Erytrocytsuspension bereddes genom att blanda 500 µl ID-CellStab (2 %) med 25
µl packade erytrocyter från patient. Till gelkortets brunnar märkta ”A”, ”B” och ”DVI-”
överfördes 10 µl suspension till vardera brunn. Inkubering av gelkort utfördes under 15
minuter vid 37°C och därefter centrifugerades gelkorten under 10 minuter vid 2000 g.
Avläsning av reaktionerna i vardera gelkorts mikrobrunnar utfördes över belyst bakgrund.
Med anledning av att BAS-test ska avspegla patientens immunhematologiska status är testet
giltigt i 5 dygn med provtagningsdag inräknad. BAS-test utfördes enligt metodbeskrivning
”Förenlighetsprövning, BAS-test med gelkort” för Länsenheten för klinisk kemi, Landstinget
i Kalmar 2011-09-30 (6-8, 11).
IH-1000
Reagens och gelkort
ID-cellstab, testerytrocyter K12, K13 och K14, och ID-Diluent 2 till IH-1000 (DiaMed,
Crissier, Schweiz) användes vid utförandet av BAS/BKS-test i IH-1000. Lågjonlösningen
(LISS) ID-Diluent 2 användes vid beredning av erytrocytsuspension för att öka
inbindningshastigheten mellan antigen och antikroppar. Samma gelkort, ”DiaClon Type and
Screen” (DiaMed, Crissier, Schweiz), användes vid manuellt och maskinellt utförande.
Inför analys
Öppnade reagens användes ej längre än 48 h i IH-1000. Reagens, gelkort och patientprover
inkuberades i rumstemperatur (cirka 20°C) i 30 minuter innan användning för att undvika
pipetteringsfel.
8
Inför analys centrifugeras prover vid 2000 g under 10 minuter. Reagens och diluent
placerades i särskilda rackar. Provrör placerades i rack avsedda för rör. Racken fördes in i
laddningsområde för reagens, diluent och prov och racken matades in i instrumentet. Reagens,
diluenter och provers streckkoder identifierades av identifieringsstationen och transportarmen
lyfte in identifierade rack till pipetteringsområdet. Instrumentets två nålar arbetade om
varandra för att känna av reagensens vätskenivå. I programvaran IH-1000 kontrollerades att
racken identifierades korrekt av instrumentet samt hur stor volym av reagens som fanns
tillgänglig. Gelkort förvarades i ställ och placerades i förvaringslåda för gelkort i
instrumentet. Transportarmen läste av det första gelkortet i varje ställ samt räknade det totala
antalet gelkort. I programvaran IH-1000 kontrollerades det att gelkorten var avlästa.
Underhåll
Vid dagligt underhåll kontrollerades utgångsdatum på reagens, diluent, gelkort och lösningar.
Nyss nämnda fylldes även på. Vid veckounderhåll bereddes nya lösningar (bilaga 1, tabell I).
Slangar torkades av med isopropanol och instrumentet sköljde automatiskt genom systemet.
Tid för veckounderhåll är cirka 32 minuter. Håltagningsmodul rengjordes med Rivascoop
under 15 minuter, sköljdes med vatten och torkades försiktigt. Inga mekaniska delar kom i
kontakt med vätskan.
Kvalitetssäkring
DiaMed Basic QC är humant helblod som är negativt med avseende på HBsAg (ytantigen av
hepatit B-virus), HCV (heptit C-virus) och HIV I och II (humant immunbristvirus). Rören
förvarades i cirka 2-8°C och hade då en hållbarhet på 7 dygn. DiaMed Basic QC Sample 1
(QC1) är A Rh D negativt och har antikroppar mot antigen D. DiaMed Basic QC Sample 2
(QC2) är B Rh D positivt har antikroppar mot antigen Fya. Kontrollerna användes för att
granska kvalitén på använda reagenser och möjliggjorde i sin tur ett immunhematologiskt
resultat. Kontrollernas förväntade reaktioner godkändes innan analys utfördes.
Testprocess
På datorskärm visades antal provbeställning som var redo för analys eller krävde justeringar,
till exempel påfyllning av reagens. Provrack placerades i laddningsområde för inmatning prov
och reagens. Efter inmatning överfördes beställning av analys i datahanteringprogramvaran
och begäran överfördes till IH-1000 och visades på pekskärm. När beställning utfördes
förflyttade transportarmen gelkort från förvaringslåda till pipetteringsområde och
transportarmens kamera läste av förekomst av eventuella bubblor i gelkortens mikrobrunnar.
Håltagningsmodul gjorde hål i gelkort som sedan placerades i pipetteringsområdets block där
det inkuberades vid cirka 20°C samtidigt som nål gjorde hål i diluent. Pipett dispenserade 50
µl av vardera av testcell (K12, K13 och K14) och överförde dessa till avsedda mikrobrunnar
innehållande anti-IgG och anti-C3d. Analys av blodprover i IH-1000 kräver att prover ej är
äldre än 2 dygn. Pipetten dispenserade sedan 25 µl plasma från prov som överfördes till
mikrobrunnarna med testcellerna. Erytrocyter från prov överfördes till diluent och
omblandning utfördes. Av erytrocytsuspension pipetterades 12,5 µl till mikrokolonn anti-A,
anti-B och anti-DVI-. Tvätt av nål utfördes i tvättstation mellan dispenseringarna.
Transportarm förflyttade gelkorten till inkuberingsblock och inkubering utfördes i 37°C under
15 minuter. Transportarm förflyttade sedan gelkort till tillgänglig centrifug. Då beställning
utfördes på ett ojämnt antal prover hämtade transportarmen ett gelkort som användes som
motvikt vid centrifugering. Gelkorten centrifugerades vid 2000 g under 10 minuter.
Transportarmen förflyttade centrifugerade gelkort till lässtationen där en kamera registrerade
9
agglutinationsreaktionerna. För varje mikrobrunn var kamerabilden indelad i olika sökfönster.
Vidare var varje fönster uppdelat i 5 zoner (figur 3) (9).
Figur 3. Indelning av avläsningszoner för registrering av agglutinationsreaktion eller
utebliven agglutinationsreaktion i mikrobrunn. Reaktioner graderas som positiv i fyra steg
eller negativ.
Tolkningsprogramvaran tolkade resultatet. Vid eventuella avvikelser, t ex otydliga reaktioner,
tilldelades mikrobrunnen ett specifikt meddelande (bilaga, tabell II) och gelkortet förflyttades
till förvaringslåda för gelkort där det avlästes manuellt. Vid manuell visuell avläsning valdes
lämplig reaktionsstyrka för respektive mikrobrunn. Varje enskild reaktion eller samtliga
brunnars reaktioner kunde kommenteras. Avlästa kort kasserades i behållare för avfall. Avfall
handskades varsamt med tanke på potentiell smittorisk.
Statistisk analys
För kvalitativ jämförelse mellan metoderna utfördes chi2-test, χ2 (chi-square test) i Microsoft
Excel 2007. Med testet jämfördes kvalitativa variabler vilka indelades i klasser för att utreda
om det föreligger någon signifikant skillnad mellan de två metoderna, den observerade
frekvensen och den förväntade frekvensen. Hypotesprövning användes och metoderna
jämfördes vid signifikansnivå α = 0,05. Skillnaden anses vara signifikant, det vill säga
skillnad förekommer mellan de båda metoderna, då det uträknade värdet (p) är lägre än 0,05.
En jämförelse av tidsåtgången mellan manuellt och maskinellt utförande gjordes genom att
mäta analystiden för 10 patientprover vid separata tillfällen. Ett medelvärde för analystid
räknades sedan ut (13).
Etik
Patientprover vilka valdes till studien analyserades i samband med rutindiagnostik.
Provmaterialet behandlades med respekt. För att skydda patienternas identitet kodades
provnumren (14).
RESULTAT
Totalt utfördes 118 stycken BAS/BKS-tester manuellt vilka även analyserades i instrumentet
IH-1000.
10
Vid manuellt utförande utfördes kontroll av testerytrocyterna K12 mot Duffyantigenet vilket
gav reaktionen (+3).
Vid automatiskt utförande för att kontrollera Kalmars testerytrocyter (K12, K13 och K14)
användes QC 1 och QC 2. QC 1 var A Rh D negativ samt positiv för testerytrocyterna K12
och K13. QC 2 var B Rh D positiv samt positiv för testerytrocyterna K12 och K14 (tabell III).
Tabell III. Resultat av analys av QC 1 och QC 2 i IH-1000.
Anti-A
Anti-B
Anti-DVIK12
QC 1
+4
+2
QC 2
+4
+4
+2
K13
+2
-
K14
+2
Analys i IH-1000 resulterade i rådata (bilaga, tabell I) som kunde jämföras med resultat från
manuellt utförda BAS-tester (tabell IV) genom att använda chi2-test.
Tabell IV. Tabellen visar de variabler som användes till chi2-testet. Totalt analyserades 118
venösa blodprover med manuell (M) respektive automatisk metod (IH-1000). Gelkort ”Type
and screen” bestående av mikrobrunnar med anti-A, -B och -DVI- samt anti-IgG och C3d
användes. Till mikrobrunnar med anti-IgG och anti-C3d användes testerytrocyt K12, K13 och
K14.
Reaktion
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
4/0
Totalt
Anti-A
M
IH1000
51
42
1
1
13
Anti-B
M
IH1000
17
12
6
Anti-DVIM
IH1000
88
61
1
1
K12
M
1
30
2
7
2
K13
IH1000
1
M
2
1
1
1
8
3
4
2
1
109
118
2
63
2
118
63
118
100
1
118
100
118
26
2
118
26
1
118
K14
IH1000
2
106
105
2
110
118
118
118
M
IH1000
1
1
6
8
1
3
109
107
118
118
Enligt utfört chi2-test är uträknat värde för anti-D 5,04*10-6. Värdet för de övriga
testbrunnarna överstiger signifikansnivån 0,05 (tabell V).
Tabell V. Utfört chi2-test efter analys i IH-1000.
χ²
Anti-A
0,16
Anti-B
1,0
Anti-DVI5,04*10-6
K12
1,0
K13
1,0
K14
0,98
Tidsåtgång för manuellt utförande av ett BAS/BKS-test var 31 minuter (30,9 minuter) medan
tidsåtgången för att utföra analys av ett test i IH-1000 var 30 minuter (30,4 minuter). Tid för
centrifugering av prov inför analys är ej inkluderad i något av fallen.
11
DISKUSSION
Syftet med studien var att göra en jämförelse mellan manuell gelkortsteknik och automatisk
immunometod vid utförande av BAS/BKS-test med gelkortsteknik för att undersöka om de
båda metoderna ger överensstämmande resultat.
Utförd manuell blodgruppskontroll och analys av patientprover i IH-1000 visar vid enstaka
tillfällen olika reaktionsgraderingar (tabell IV). Skillnader förekom då främst mellan
reaktionerna 3+ och 4+. Vid analys av patientprover anses skillnaden, i detta fall, ej vara av
klinisk relevans då samtliga resultat var över 3+ (undantag negativa reaktioner och reaktioner
med blandbild). Lägsta godkända gradering i gelkortets mikrobrunnar vid manuellt utförande
av blodgruppskontroll är 3+. Dock kan även (3+) godkännas som gradering under
förutsättningen att ytterligare undersökning (rörteknik eller fullständig ABO/Rh-gruppering)
utförs (6).
Efter en statistisk analys, med hjälp av chi2-test, kunde resultaten (tabell V) jämföras vid
signifikansnivå 0,05. En signifikant skillnad visades endast i resultaten från mikrobrunn
innehållande anti-DVI- (5,04*10-6 <0,05). Efter validering utförd av Blodcentralen i Linköping
är det fastställt att anti-DVI- i gelkort av typ ”Type and Screen” kan ge svaga reaktioner.
Detta kan dock anses som acceptabelt då Rh D-grupperingen endast brukas som en kontroll
på tidigare blodgruppering (15).
Resultaten efter utförd antikroppsscreening visar i vissa fall en förstärkt reaktion vid analys i
IH-1000 (bilaga, tabell I). I enstaka fall visas en positiv reaktion (förekomst av irreguljär
antikropp) vid manuellt utförande medan analys av samma prov visar en negativ gradering i
IH-1000. Efter manuellt utförd antikroppsscreening som visas positiv kan misstanke om
köldantikropp föreligga. För att utesluta köldantikropp utförs idag manuell analys
rutinmässigt enligt samma förfarande i miljö med temperaturen 37°C. Instrumentets
arbetstemperatur är något högre än 20°C vilket har resulterat i att vissa antikroppar, troligtvis
köldantikroppar, försvinner (bilaga 2, tabell I). Att en eventuell köldantikropp försvinner
underlättar arbetet med tanke på att en vidare antikroppsutredning ej erfordras. Dock är
köldantikroppar normalt ej av klinisk relevans vid transfusion av erytrocytenhet då de
vanligen ej är påvisbara vid 37°C. I kliniskt syfte kan det trots allt vara viktigt att resultatet
visas positivt för att vetskapen om kliniskt viktiga erytrocytantikroppar ej ska gås miste om.
Dock är det ej av relevans att detektera alla antikroppar hos en patient utan enbart de som är
kliniskt signifikanta (2, 9, 16).
Vad gäller tidsåtgång för analys kan skillnaden 0,5 minuter/analys anses oanselig, manuellt
(30,9 minuter) och maskinellt utförande (30,4 minuter). Större skillnader i analystid fås dock
vid analys av ett stort antal patientprover då instrumentet kan utnyttja dubbla arbetsområden
och utföra fler moment samtidigt. En av de största interferenserna vid analys kan vara den
mänskliga faktorn som kan orsaka bland annat pipetteringsfel och förväxlingar. Genom att
föra instrumentet i bruk blir det möjligt att undvika eventuella förväxlingar och pipetteringsfel
samtidigt som flera prover kan hanteras vid samma tillfälle (6, 9).
12
Starkt hemolyserade samt starkt lipemiska prover bör ej analyseras manuellt för att undvika
interferenser. Analys av hemolyserade eller lipemiska prover i IH-1000 kan ge felaktiga eller
icke tolkningsbara resultat. Vid både manuellt och automatisk metod är erfordrad åtgärd
omtagning av prov. Tidigare studier beträffande automatisering av immunohematologiska
tekniker visar bland annat en förbättrad analyskvalité, minskning av fel vilka är orsakade av
mänskliga faktorn där ibland minska fel som rör tolkning av resultat och
överföring/dokumentation av resultat. Nyss nämnda orsaker innebär att automatisering av
immunhematologiska metoder ger en högre säkerhet. Att tänka på är att det slutgiltiga
resultatets tillförlitlighet, oavsett metod, är beroende av en korrekt tillämpning av good
laboratory practice (GLP) för reagens och prov (6, 9, 16-18).
Slutsats
Manuellt utförande av BAS/BKS-test har visats ha en god överensstämmelse med analys av
BAS/BKS-tester i IH-1000 då åtskilliga uträknade värdena, med hjälp av chi2-test, visades
överstiga signifikansnivån 0,05. Genom att utföra analys i IH-1000 undviks felkällor som
annars kan orsakas av den mänskliga faktorn.
13
TACKORD
Ett stort tack till Ingvar Rydén, min externa handledare och Susanne Widell, min interna
handledare. Jag vill även tacka personalen på blodcentralen i Kalmar, framför allt Anitha
Petersson och Ann-Marie Helgesson. Tack för all handledning och ert stöd!
14
REFERENSER
1. Berséus, O och Filbey, D. Blodgruppsserologi. Örebro : u.n., 1996.
2. Daniels, G och Bromilow, I. Blodgruppsserolog. Pozkal, Polen : Studenlitteratur AB, 2008.
3. Mccullough, J. Transfusion Medicine Second Edition, England, Churchill Livingstone,
2004.
4. Harmening, D M. Modern blood banking & transfusion practices. United States of
America, 2005.
5. Issit, PD och Anstee, DJ. Applied Blood Group Serology. Durham NC : Montgomery
Scientific Publications, 1998.
6. Säfwenberg, J. och Strindberg, J. Antikroppscreening, Handbok för blodcentraler. u.o. :
Svensk förening för Transfusionsmedicin, 2006-01-30.
7. Svenska Labex AB. Metodanvisning för ID-Micro Typing System. DiaClon Type+Screen.
8. Säfwenberg, J. Förenlighetsprövning. Handbok för blodcentraler. u.o. : Svensk förening
för Transfusionsmedicin, 2009-12-15.
9. LABEX Användarmanual IH-1000 & IH-com, Helsingborg Sverige.
10. Databyrån AB. ProSang Blood Bank System. Hämtad 2012-05-07 från
http://www.prosang.se/prosang.pdf
11. Transfusionsmedicin, Laboratoriemedicinskt centrum i Östergötland.
Förenlighetsprövning, BAS-test, i gelkort, 2012-11-14.
12. Aylward, G och Findlay, T. SI Chemical Data. John Wiley & Sons Australia, 2008.
13. Ejlertsson, G. Grundläggande statistik med tillämpningar inom sjukvården.
Studentlitteratur, 1984.
14. Institutet för biomedicinsk laboratorievetenskap, IBL. Institutet för biomedicinsk
laboratorievetenskap. Hämtad 2013-06-14 från http://www.ibl-inst.se/?page_id=497
15. Alderbom, A. Validering av IH-1000. Laboratoriemedicinskt centrum i Östergötland,
Transfusionsmedicin, 120423.
16. Bajpai, M, Kaur, R och Gupta, E. Automation in Immunohematology. Asian J Transfus
Sci. 2012 Jul-Dec; 6(2): 140–144.
17. Dale, A. Kern och Sterling, T. Bennet. Informatics applications in blood banking. Vol 16
nummer 4, dec 1996.
18. Delamaire M. Automation of the immunohematology laboratory. Transfus Clin Biol. 2005
Jun;12(2):163-8.
15
BILAGA 1
Tabell I. Lösningar vilka användes för underhåll av IH-1000.
Lösning
Setup clean
Riskfras med tolkning
R35: Starkt frätade
Säkerhetsfras med tolkning
S24, S25, S26, S28: Undvik
hudkontakt. Undvik ögonkontakt.
Vid ögonkontakt, skölj
omedelbart med mycket vatten
och kontakta läkare.
System
liquid
R36, R38: Irriterande för
hud. Irriterande för ögon.
S24, S25, S26: Undvik
hudkontakt. Undvik ögonkontakt.
Vid ögonkontakt, skölj
omedelbart med mycket vatten
och kontakta läkare.
Cleaning
liquid
R34, R43: Orsakar
allvarliga brännskador. Kan
framkalla allergi vid
hudkontakt.
Använd lämpliga handskar.
Använd personlig
skyddsutrustning för ögon och
ansikte. Vid olycka eller
illamående tillkalla genast läkare.
Läs information från tillverkaren
angående återvinning. Detta
material och dess förpackning ska
kasseras som farligt avfall.
Isopropanol
R11, R36, R67: Högt
antändligt. Irriterande för
ögon. Ångor kan orsaka
dåsighet och yrsel.
S7, S16, S24, S25, S26: Behållare
bör hållas ordentligt stängd. Håll
undan från antändande källor.
Undvik hudkontakt. Undvik
ögonkontakt. Vid ögonkontakt,
skölj omedelbart med mycket
vatten och kontakta läkare (11).
BILAGA 2
Tabell I. Analys av
118 venösa blodprover
med gelkort
Type and Screen
Schweiz).
Anti-B
Anti-A
Anti-DVIK12 (DiaMed, Crissier,
K13
K14Till
brunnar med IgG och C3d
är
testerytrocyt
K12,
K13
och
K14
tillsatta.
Analys
är
utförd
manuellt
samt
medIHIHIHIHIHIHIH-1000.
Labnummer Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
12 (37°C)
13
14
15
16
17
18
19
20
21
21 (37°C)
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0
0
0
0
0
0
4
0
4
3
0
0
0
0
0
?/0
0
0
4
0
4
3
0
0
0
4/0
4
0
4
4
4
0
0
4
0
0
0
4
4
0
4
4
3
0
0
4
0
0
4
0
4
4/0
4
4
0
0
4
3
4
4
4
0
4
4
4
4
0
0
3
3
3
3
0
4
0
0
4
0
0
0
0
0
4
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
4
0
4
4
4
4
4
4
4
4
0
4
4
4
4
4
4
0
0
4
4
4
4
0
0
0
4
0
4
4
4
0
4
4
4/0
4
3,5
0
0
0
4
0
4
4
0
0
4
4
4
4
0
0
0
4
0
4
4
3
0
4
4
Dp/3
4
3
0
0
0
4
0
4
3
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
4
0
4
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
4
0
3
0
0
0
0
0
4
4
4
4
4
0
4
0
4
4
0
4
4
4
4
4
4
4
0
4
4
0
4
0
4
4
4
4
4
3
4
4
0
3
0
4
4
0
4
3
4
3
3
3
4
0
3
4
0
3
0
4
3
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5/0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5/0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5/0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5/0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
wD/0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
0
4
4
4
0
4
4
4
4
0
0
4
0
4
4
0
0
0
4
0
4
0
4
0
0
4
0
4
4
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
4
4
0
4
0
0
4
0
4
4
4
4
0
3
4
4
0
4
3
3
3
0
0
4
0
3
4
0
0
0
3
0
4
0
3
0
0
4
0
4
4
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
4
4
0
4
0
0
3
0
4
4
4
4
4
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
4
4
0
4
4
4
4
4
0
4
0
4
4
4
0
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
0
4
4
2,5
4
4
4
0
0
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
0
4
4
0
3
3
4
0
4
3
3
3
4
0
3
0
4
3
4
0
4
3
4
4
4
4
4
4
4
4
0
4
4
3
4
3
3
0
0
4
3
4
4
4
4
3
4
4
4
4
3
4
0
3
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
101
102
103
104
105
105 (37°C)
106
107
108
109
110
110 (37°C)
111
112
113
114
115
116
117
118
0
0
0
4
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
4/0
4
4
0
4
Dp/4
4
4
0
4
4
4
0
0
4
4
4
0
0
4
0
0
0
0
3
0
0
0
0
4
0
4
4
0
4
0
3
4
4
4
4/0
0
0
4
4
0
4
4
Dp/4
0
0
4
4
0
0
4
0
0
0
0
0
4
0
3
0
0
0
0
0
4
0
4
4
0
0
4
4
0
0
4
4
0
0
4
4
0
Tabell II. Tolkning av meddelande i rådata.
Meddelande
?
Dp
wF
wR
wP
wD
[]
L
W
E
E
*agglutinerade erytrocyter.
0
0
0
0
2
0
2
2
4
2
1
1,5
2,5
2
1,5
2,5
2
0
2
2
0
0
0
0
1
2
2
4
1
2
3
2
2
3
2
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
3
2
1
2
2
0,5
1
4
4
0
0
0,5
0
0
0 wR/0,5
0
0
2
2
3,5
4
0
0
0,5
1
0
0
2
2
0
0
0
0
2
0
0
?/1
2
2
0,5
0
3
2
2
2,5
2
0
2
0
Förklaring
Resultattolkning ej möjlig. Kontrollera manuellt.
Blandbild.
Osäkert resultat/ oklar gel. Kontrollera manuellt
för främmande partiklar.
Ej homogent område ovanför cellknappen* (röda
blodkroppar
eller
främmande
partiklar)
Kontrollera manuellt.
Kontrollera cellknappens yta.
Oklar knapp. Kontrollera manuellt.
Brunnen används inte för detta test.
Ingen vätskefördelning i brunnen.
Brunn för tolkning ej funnen.
Ingen reaktion i brunnen.
Ingen vätska ovanför gelen.
0
0
0
0
1
0
1
2
2
1
2
2
2
2
2
0
2
0
Kalmar Växjö
391 82 Kalmar
Tel 0480-446200
Lnu.se
